Kwasica zewnątrzkomórkowa ogranicza metabolizm jednowęglowy i zachowuje łodygę komórek T

Nagromadzenie kwaśnych produktów przemiany materii w mikrośrodowisku guza hamuje funkcje efektorowe limfocytów nadmuchujących guz (TIL). Jednakże nie jest jasne, w jaki sposób środowisko kwaśne wpływa na metabolizm i różnicowanie komórek T. Tutaj pokazujemy, że długotrwała ekspozycja na kwas przeprogramowuje wewnątrzkomórkowy metabolizm komórek T i sprawność mitochondriów oraz zachowuje łodygę komórek T. Mechanicznie, podwyższona kwasica zewnątrzkomórkowa upośledza wychwyt i metabolizm metioniny poprzez regulację w dół SLC7A5, zmieniając w ten sposób odkładanie H3K27me3 na promotorach kluczowych genów macierzystych komórek T. Zmiany te sprzyjają utrzymaniu stanu „pamięci podobnej do łodygi”, poprawiają długoterminową trwałość in vivo i skuteczność przeciwnowotworową u myszy. Nasze odkrycia nie tylko ujawniają nieoczekiwaną zdolność kwasicy zewnątrzkomórkowej do utrzymywania właściwości komórek T przypominających łodygę, ale także pogłębiają naszą wiedzę na temat wpływu metabolizmu metioniny na łodygę komórek T.

Cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Adopcyjny transfer limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego stanowi ogromny postęp w dziedzinie terapii nowotworów, ponieważ doprowadził do całkowitej regresji niektórych nowotworów złośliwych. Jego skuteczność terapeutyczna w dużej mierze zależy od trwałości i stopnia zróżnicowania przeniesionych limfocytów T1,2. Mniej zróżnicowane komórki T pamięci są preferowaną populacją do adopcyjnego transferu komórek T (ACT) ze względu na ich podobne do komórek macierzystych właściwości samoodnawiania i multipotencji3,4. Rzeczywiście wykazano, że zastosowanie macierzystych limfocytów T pamięci w ACT pozwala uzyskać lepszą odpowiedź przeciwnowotworową5. W porównaniu z ostatecznie zróżnicowanymi efektorowymi komórkami T, komórki T podobne do łodygi wykazują wyraźne cechy charakterystyczne6. Zarówno ludzkie, jak i mysie komórki T podobne do macierzystych charakteryzują się ekspresją cząsteczek doświadczanych przez antygen i związanych z zasiedlaniem, w tym wysokimi poziomami CD62L i CCR7 (ref. 7). Nasza wiedza na temat profili transkrypcji, modyfikacji epigenetycznych i szlaków metabolicznych regulujących komórki T podobne do macierzystych znacznie się rozwinęła w ostatnich latach 8–10. Doniesiono, że kilka czynników transkrypcyjnych, takich jak TCF1, KLF2 i LEF1, odgrywa zasadniczą rolę w napędzaniu lub utrzymywaniu łodygi komórek T9. Warto zauważyć, że TCF1 jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym, który promuje wytwarzanie długowiecznych komórek T pamięci11. Podczas przewlekłych infekcji niewielka część łodygopodobnych limfocytów T TCF1+ podtrzymuje odpowiedź limfocytów T przeciwko wtórnej infekcji1,12. Zmiany epigenetyczne umożliwiają limfocytom T zarówno inicjowanie zmian transkrypcyjnych leżących u podstaw nabywania cech komórek pamięci, jak i utrzymywanie tych wzorców ekspresji transkrypcyjnej13. Liczne badania wykazały, że trimetylacja histonu H3 w K4 (H3K4me3), modyfikacja związana z aktywacją, zachodzi w loci genów związanych z pamięcią, w tym TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 i SELL, podczas różnicowania naiwnych CD{{47 }} Komórki T w komórki T pamięci, podczas gdy trimetylacja H3 w K27 (H3K27me3), modyfikacja represyjna, zostaje utracona w tych loci 13–15. I odwrotnie, geny związane z efektorami (GZMB, PRF1, IFNG i TBX21) wykazują zmniejszone represyjne i zwiększone aktywujące modyfikacje epigenetyczne w tych loci w efektorowych komórkach T13,16. Wreszcie, coraz liczniejsze dowody sugerują, że obwody metaboliczne dyktują decyzje dotyczące losu komórek T i kształtują ich stan epigenetyczny i funkcjonalny17. Krótko żyjące efektorowe limfocyty T są silnie glikolityczne i zależne od metabolizmu jednowęglowego18,19, podczas gdy komórki T pamięci podobne do łodygi wykazują odrębne profile metaboliczne charakteryzujące się zwiększonym utlenianiem kwasów tłuszczowych (FAO) i mitochondrialną zapasową pojemnością oddechową (SRC), kardynalną cechy związane z długoterminową trwałością20–22. Dlatego przeprogramowanie metaboliczne jest ważne dla skutecznego uzyskania łodygi i długoterminowego przeżycia komórek T.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Immunosupresyjne mikrośrodowisko nowotworu (TME), charakteryzujące się niskim pH, niedotlenieniem, pozbawieniem glukozy i wzbogaceniem kwasu mlekowego, jest kluczową barierą utrudniającą prawidłową ekspansję, różnicowanie i funkcjonalność limfocytów T23,24. Rzeczywiście, stres metaboliczny narzucony przez TME upośledza pojemność i sprawność mitochondriów, wywołując wewnątrzguzową niewydolność i dysfunkcję metaboliczną komórek T25–28. Co ciekawe, większość limfocytów naciekających nowotwór (TIL) jest dysfunkcyjna, ale niewielka ich część ma pamięć przypominającą łodygę lub właściwości prekursorowe7,29. Ten podobny do łodygi podzbiór TIL zachowuje potencjał proliferacyjny i trwałość i jest powiązany z korzystną odpowiedzią na blokadę immunologicznego punktu kontrolnego (ICB) i TIL-ACT u osób chorych na raka11,30. Poprzednie badania wykazały, że podwyższona kwasica zewnątrzkomórkowa (↑[H+ ]) hamuje aktywność cytolityczną limfocytów T zarówno in vitro, jak i in vivo31–33. Ponadto kwaśny TME ma znaczący wpływ na aktywność i różnicowanie komórek szpikowych naciekających nowotwór, takich jak komórki dendrytyczne (DC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM) 34–36. Jednakże wpływ ↑[H+ ] na łodygę komórek T i sprawność metaboliczną pozostaje w dużej mierze nieznany. Tutaj podajemy, że długoterminowa ekspozycja in vitro na ↑[H+ ] ułatwia różnicowanie ludzkich i mysich macierzystych limfocytów T CD8+ kosztem końcowych efektorowych limfocytów T CD8+. Odkryliśmy, że długotrwałe leczenie ↑[H+] przebudowuje metabolizm komórek T i podtrzymuje zdolność oddechową mitochondriów. Co więcej, trwała ekspozycja na ↑[H+] upośledza wychwyt i metabolizm metioniny, co w konsekwencji skutkuje zmniejszonym odkładaniem się genów związanych z pamięcią przez H3K27me3, ułatwiając w ten sposób utrzymanie statusu „pamięci podobnej do łodygi”. Wreszcie, adoptywny transfer limfocytów T hodowanych w warunkach ↑[H+] wykazuje silne działanie przeciwnowotworowe in vivo, zgodnie z ich mniej wyczerpanym fenotypem. Zatem nasze badanie ujawnia nieoczekiwaną rolę kwasicy zewnątrzkomórkowej w zachowaniu łodygi komórek T poprzez przebudowę metabolizmu komórkowego i wzorców epigenetycznych.

Wyniki

↑ Ekspozycja na [H+ ] sprzyja macierzystości komórek T CD8+

Aby określić, czy zewnątrzkomórkowe ↑[H+ ] wpływa na różnicowanie limfocytów T przypominających łodygę, przeprowadziliśmy analizę cytometrii przepływowej kluczowych fenotypów podobnych do łodygi na ludzkich limfocytach T hodowanych przez 12 dni w dowolnej pożywce kontrolnej, pożywce ↑[H+ ] zawierającej 10 mM kwasu mlekowego (naśladując stężenie mleczanu w sytuacjach patofizjologicznych23,35) lub środowisko kwaśne (~pH 6,6, według kwasu solnego) (ryc. 1a). Większy odsetek limfocytów T CD8+ podobnych do łodygi, w tym pamięci wczesnej (CD45RO− CD27+ ) i pamięci centralnej (CD45RO+ CD27+ ), zaobserwowano w limfocytach T kondycjonowanych w ↑ [H+] w porównaniu z pożywką kontrolną (dane rozszerzone, ryc. 1a). Dodatkowo odkryliśmy, że komórki T hodowane w pożywce ↑[H+] miały wyższy procent komórek macierzystych (CCR7+ CD62L+) (ryc. 1b). Warto zauważyć, że zauważyliśmy znacznie zwiększoną ekspresję TCF1, kluczowego czynnika kierującego różnicowaniem pnia i pamięci centralnej, na poziomie białka zarówno w ludzkich, jak i mysich limfocytach T CD8+ eksponowanych na ↑[H+ ] (ryc. 1c i Rozszerzone dane rys. 1b). Ponadto występował zależny od stężenia [H+] wpływ na ekspresję CCR7 i TCF1 (dane rozszerzone, ryc. 1c). Zgodnie z fenotypem przypominającym łodygę komórek T kondycjonowanych ↑[H+], wytwarzanie wewnątrzkomórkowego interferonu (IFN-) i czynnika martwicy nowotworu (TNF-) było w tych komórkach znacząco zmniejszone (ryc. 1d).

Aby lepiej zbadać stan różnicowania komórek T, przeprowadziliśmy analizę sekwencjonowania RNA (seq RNA) i odkryliśmy, że długoterminowa ekspozycja in vitro na ↑[H+] skutkowała odrębnym profilem transkrypcji (dane rozszerzone, ryc. 1d). Ekspozycja na ↑[H+] doprowadziła do znacząco zmniejszonej ekspresji genów kodujących cząsteczki efektorowe, takie jak PRF1, GZMB i IFNG, oraz receptora współhamującego BTLA (ryc. 1e, f i dane rozszerzone ryc. 1e). Natomiast komórki T hodowane w ↑[H+] wykazały wyższą ekspresję BACH2, CCR7, LEF1 i TCF7, które korelują z łodygą komórek T (ryc. 1e, f i dane rozszerzone ryc. 1e). Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA) wykazała, że ​​wzór transkrypcji indukowany przez ekspozycję na ↑[H+] był podobny do tego w komórkach T pamięci (ryc. 1g i dane rozszerzone ryc. 1f). Ponadto ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) potwierdziła zwiększoną ekspresję mRNA BACH2, KLF2, LEF1 i TCF7 po traktowaniu ↑[H+] (ryc. 1h). Łącznie obserwacje te potwierdzają fakt, że traktowanie ↑[H+] w dużym stopniu kształtuje profile transkrypcyjne komórek T w celu ustalenia łodygi. Warto zauważyć, że odkryliśmy, że leczenie ↑[H+] hamowało proliferację komórek T i wypaczało rozkład cyklów komórkowych w kierunku fazy G1 i od fazy S (rysunek uzupełniający 1a – c). Następnie zbadaliśmy aktywację komórek T po leczeniu ↑[H+] podczas stymulacji TCR i odkryliśmy, że ekspozycja ↑[H+] nie ma znaczącego wpływu na ekspresję markerów aktywacji komórek T ani wielkość komórek (rysunek uzupełniający 2a, b). Dodatkowo potwierdziliśmy dodatkowo, że ekspozycja ↑ [H + ] po aktywacji komórek T może nadal wywoływać stan podobny do łodygi komórek T (rysunek uzupełniający 2c – f). Odkrycia te wykluczają możliwość, że komórki T wystawione na działanie ↑[H+] są po prostu oporne na stymulację, w przeciwieństwie do przyjmowania stanu przypominającego łodygę.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Poprzednie doniesienia wykazały, że kwaśne środowisko ostro hamuje aktywność cytolityczną limfocytów T zarówno in vitro, jak i in vivo23,31. Odkryliśmy również, że krótkotrwała ekspozycja na ↑ [H+] upośledza wytwarzanie cytokin, ale ma niewielki wpływ na fenotyp podobny do łodygi w limfocytach T (dane rozszerzone ryc. 1g – i i ryc. uzupełniająca 3a – c). Co więcej, hamujące działanie wytwarzania cytokin przez ekspozycję na ↑[H+] jest przejściowe i odwracalne, ponieważ usunięcie ↑[H+] szybko przywraca wytwarzanie cytokin przez komórki T (dane rozszerzone, ryc. 1h). Zatem hamowanie funkcji efektorowej komórek T przez środowisko kwaśne jest bardzo szybkie, podczas gdy przeprogramowanie łodygi komórek T wymaga przedłużonej ekspozycji ↑[H+]. Ponieważ mleczan występuje w roztworze w postaci niezdysocjowanej (kwas mlekowy) lub jako sól jonowa (mleczan sodu), następnie staraliśmy się ustalić, czy mleczan sodu wykazuje podobny wpływ na łodygę komórek T i odkryliśmy, że mleczan sodu również promuje sygnatury łodygi, chociaż jego skuteczność była znacznie niższa niż skuteczność leczenia kwasem mlekowym (10 mM) (dane rozszerzone ryc. 1j, k i ryc. uzupełniająca 4a – f). Odkrycia te sugerują zarówno znaczenie ↑[H+ ], jak i jego różnicę w stosunku do leczenia jonami mleczanowymi, w indukcji fenotypu przypominającego łodygę limfocytów T CD8+.

ryc. 1|↑ Ekspozycja na [H+ ] ułatwia różnicowanie limfocytów T CD8+ podobnych do łodygi. a Schemat aktywacji ludzkich limfocytów T we wskazanych warunkach: pH 7,4 (–↑[H+ ], kontrola), pH 6,6 (+↑[H+ ], kwas solny) lub 10 mM kwas mlekowy (+↑[H+ ]). PBMC, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej. b, Reprezentatywne profile ekspresji CCR7 i CD62L w ludzkich limfocytach T CD8+ w różnych warunkach w dniu 12. n=3 niezależnych próbek. c, Reprezentatywne histogramy i oznaczenie ilościowe ekspresji TCF1 w ludzkich limfocytach T CD8+ w różnych warunkach w dniu 12. n=3 niezależnych próbek. MFI, średnia intensywność fluorescencji. d, Ludzkie komórki T namnażano jak w a przez 12 dni i stymulowano 12-mirystynianem 13-octanem forbolu (PMA) zawierającym brefeldynę A (BFA) przez 4,5 godziny. Profil wewnątrzkomórkowej ekspresji IFN- i TNF- przedstawiono dla limfocytów T w warunkach pH 7,4 (po lewej), 10 mM kwasu mlekowego (w środku) lub pH 6,6 (po prawej). n=3 niezależnych próbek. e, f, analiza seq RNA ludzkich komórek T, które namnożono w kontroli (pH 7,4) lub w kwasie mlekowym (10 mM). Mapa cieplna wybranych genów (e) i wykres wulkaniczny wszystkich genów, w których znakowano geny związane z pamięcią, efektorami i wyczerpanymi komórkami T (f). Na wykresie wulkanu oś x przedstawia log2-przekształconą wartość krotności zmiany (FC) dla komórek traktowanych kwasem mlekowym w porównaniu z kontrolami w dniu 12, a oś y przedstawia skorygowane wartości P. n=4 niezależnych próbek. g, wykres GSEA porównujący kontrolę z limfocytami T kondycjonowanymi kwasem mlekowym pod kątem wzbogacenia efektorowego i pamięci. NES, znormalizowany wynik wzbogacenia. h, Ilościowa ekspresja mRNA czynników transkrypcyjnych związanych z łodygą komórek T (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) w komórkach T we wskazanych warunkach. n=3 niezależnych próbek. Dane przedstawiono jako średnią ± sem. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta (b – d, h). Nominalne wartości P i współczynniki fałszywego wykrywania (FDR) obliczono przy użyciu domyślnej metody oprogramowania GSEA (g).

Podwyższony poziom [H+ ] powoduje przeprogramowanie metaboliczne

Oprócz odrębnych programów transkrypcyjnych, komórki T podobne do łodygi nabywają również preferencyjnie unikalne cechy metaboliczne, w tym podwyższony poziom FAO i ograniczony metabolizm glikolityczny17,20,37. Aby zbadać cechy metaboliczne długoterminowych komórek T eksponowanych in vitro na ↑[H+], przeprowadziliśmy analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) i odkryliśmy znaczące różnice w ekspresji genów związanych ze szlakami metabolicznymi, takimi jak metabolizm małocząsteczkowy i glikoliza (ryc. 2a). Rzeczywiście, długoterminowe komórki T kondycjonowane ↑[H+] wykazywały zmniejszoną glikolizę i metabolizm aminokwasów w przeciwieństwie do zwiększonego metabolizmu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (dane rozszerzone, ryc. 2a, b). W przeciwieństwie do długotrwałej ekspozycji na ↑[H+], krótkotrwałe leczenie ↑[H+] hamowało jedynie glikolizę, ale nie miało znaczącego wpływu na FAO (rysunek uzupełniający 5a). Ilościowa analiza PCR potwierdziła ponadto, że geny glikolizy SLC2A1, SLC2A3 i LDHA były znacząco zmniejszone w komórkach T eksponowanych na ↑[H+] (dane rozszerzone, ryc. 2c). I odwrotnie, kondycjonowanie ↑[H+] promowało ekspresję palmitoilotransferazy karnitynowej 1 (kodowanej przez CPT1A), enzymu ograniczającego szybkość zaangażowanego w FAO (dane rozszerzone, ryc. 2c). Aby dokładniej wyjaśnić zmiany metaboliczne wywołane przez ↑[H+], przeprowadziliśmy bezstronną analizę metabolomiczną i znaleźliśmy 285 odrębnych związków pośrednich w komórkach T hodowanych z ↑[H+] w porównaniu z kontrolami (dane rozszerzone, ryc. 2d). W szczególności ekspozycja na ↑[H+] znacząco zmniejszyła glikolityczne produkty pośrednie i niektóre niezbędne aminokwasy, zamiast zwiększać liczbę różnych form karnityny, aktywowanej formy kwasów tłuszczowych, która jest przenoszona do mitochondriów w celu utlenienia (dane rozszerzone, ryc. 2e – g). Analiza strumienia metabolicznego z użyciem [13C6]glukozy lub [13C16]palmitynianu wykazała, że ​​ekspozycja na ↑[H+] drastycznie utrudnia włączanie [13C6]glukozy do związków pośrednich TCA i kwasu mlekowego, jednocześnie promując wbudowywanie [13C16]palmitynianu do acetylo-CoA i cytrynianu, co potwierdza tę tezę że kwasica zewnątrzkomórkowa hamuje glikolizę i wzmacnia FAO w limfocytach T (ryc. 2b – e). Te kondycjonowane ↑[H+] limfocyty T wykazywały ograniczenia w odniesieniu do pobierania składników odżywczych, o czym świadczy zmniejszone zużycie [13C6]glukozy i wchłanianie analogów lipidów (BODIPY FL C16), co może wynikać ze zwiększonego gradientu elektrochemicznego (Rozszerzone dane ryc. 2h, i).

Ograniczone pobieranie składników odżywczych i zmiana metabolizmu komórkowego może prowadzić do zmian w sieciach sygnalizacyjnych w limfocytach T. Analiza wzbogacania GO komórek T traktowanych kwasem mlekowym ujawniła, że ​​większość dotkniętych genów jest głównie zaangażowana w sygnalizację PI3K – AKT, mTOR i TCR (dane rozszerzone, ryc. 3a). Sygnalizacja mTOR odgrywa kluczową rolę w integrowaniu sygnałów immunologicznych i wskazówek metabolicznych niezbędnych do prawidłowej aktywacji limfocytów T, a hamowanie sygnalizacji mTOR kieruje komórki w kierunku tworzenia limfocytów T CD8+ pamięci zamiast różnicowania efektorowego38–40. Nasza analiza GSEA wykazała, że ​​aktywność sygnalizacji zarówno AKT – mTOR, jak i NF-kB w komórkach T kondycjonowanych ↑ [H+] była zmniejszona w porównaniu z aktywnością w kontrolnych komórkach T (ryc. 2f i dane rozszerzone ryc. 3b). Zostało to dodatkowo potwierdzone przez zmniejszoną fosforylację S6 (w Ser235 i Ser236), 4EBP1 (w Thr37 i Thr46), AKT (w Ser473) i NF-кB (w Ser536) w komórkach T kondycjonowanych ↑[H+] (ryc. 2g, h i rozszerzone dane ryc. 3c). Wiadomo, że mTOR jest krytycznym regulatorem różnorodnych procesów biologicznych, w tym wielkości komórek, wytwarzania energii i syntezy białek41. Rzeczywiście, odkryliśmy, że wielkość komórek T kondycjonowanych ↑[H+] była zmniejszona w porównaniu z kontrolnymi komórkami T (dane rozszerzone, ryc. 3d). Następnie oceniliśmy zależną od bioenergii syntezę białek w komórkach T kondycjonowanych ↑[H+] przy użyciu SCENITH, nowo opracowanej metody, która wykorzystuje włączenie puromycyny jako odczyt poziomów syntezy białek42. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspozycja na ↑[H+ ] hamowała energochłonną syntezę białek (ryc. 2i), co sugeruje, że metabolizm energetyczny w limfocytach T CD8+ został zmieniony. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, że hamowanie aktywności mTOR przez rapamycynę zwiększa ekspresję czynników transkrypcyjnych związanych z łodygą (dane rozszerzone ryc. 3e, f). Podsumowując nasze wyniki, dochodzimy do wniosku, że długoterminowa ekspozycja na ↑[H+ ] organizuje zmianę metaboliczną i hamuje aktywność mTOR, ułatwiając w ten sposób nabycie i utrzymanie pnia komórek T.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

↑ Ograniczenie metabolizmu metioniny za pośrednictwem [H+] zachowuje łodygę epigenetyczną

Coraz więcej dowodów sugeruje, że metabolizm jednowęglowy dyktuje decyzje dotyczące losu komórek T i kształtuje ich stan funkcjonalny43,44. Nasza analiza seq RNA wykazała słabe wzbogacenie jednowęglowego procesu metabolicznego i sygnatury cyklu metioninowego w limfocytach T narażonych na długotrwałe, a nie krótkotrwałe leczenie ↑[H+] (ryc. 3a, dane rozszerzone ryc. 4a, i dodatkowa ryc. 5b). W związku z tym ekspozycja na ↑[H+] hamowała ekspresję genów kodujących enzymy związane z cyklem metioninowym (MTR, AHCY i BHMT), a także metabolizmem kwasu foliowego (SHMT1 i SHMT2) (dane rozszerzone, ryc. 4b). Dalsza analiza metabolomiczna ujawniła, że ​​komórki T hodowane w kwasie mlekowym wykazały znaczny spadek wewnątrzkomórkowych metabolitów biorących udział w cyklu metioninowym, w tym metioniny, S-adenozylometioniny (SAM) i S-adenozylohomocysteiny (SAH), ale podwyższony poziom seryny i homocysteiny (rozszerzone Dane rys. 4c). Śledzenie [13C5]metioniny dodatkowo potwierdziło, że wychwyt i wewnątrzkomórkowa obfitość metioniny, wewnątrzkomórkowego SAM znakowanego 13C (m+5), SAH (m+4) i 5′-metylotioadenozyny (MTA, m +1) były znacznie zmniejszone w komórkach T eksponowanych na ↑ [H+ ] (ryc. 3b – d i dane rozszerzone ryc. 4d). Warto zauważyć, że egzogenna suplementacja metioniną przywróciła wychwyt i wewnątrzkomórkową obfitość [13C5]metioniny, jak również odpowiednich związków pośrednich w komórkach T eksponowanych na ↑[H+] (ryc. 3c,d i dane rozszerzone ryc. 4d), co sugeruje, że egzogenna metionina suplementacja może przywrócić wychwyt metioniny i metabolizm komórek T eksponowanych na ↑[H+]. Następnie zbadaliśmy, czy ograniczenie metioniny może napędzać łodygę komórek T. Stwierdziliśmy, że pozbawienie metioniny rzeczywiście sprzyjało indukcji populacji limfocytów T TCF1+ CD8+, ale nie miało wpływu na ekspresję CD62L i CD44 (dane rozszerzone, ryc. 4e, f). W celu dalszego badania roli metabolizmu metioniny w macierzystości komórek T indukowanej ↑[H+], hodowaliśmy komórki T w pożywce ↑[H+] uzupełnionej metioniną, SAM lub SAH. Fenotyp pnia komórek T wywołany kwasicą zewnątrzkomórkową był rzeczywiście częściowo zabroniony przez suplementację metioniną lub SAM, ale nie SAH (ryc. 3e i dane rozszerzone ryc. 4g – i). Wewnątrzkomórkowa metionina jest przekształcana w SAM, ważnego donora grupy metylowej w reakcjach metylacji DNA i histonów (dane rozszerzone, ryc. 5a). W związku z tym scharakteryzowaliśmy wzorce metylacji histonów i odkryliśmy, że podwyższony [H+] znacznie obniżył całkowite poziomy H3K27me3 w limfocytach T, ale nie miał znaczącego wpływu na ekspresję innych markerów metylacji histonów (ryc. 3f i dane rozszerzone ryc. 5b). Zgodnie z oczekiwaniami, suplementacja metioniną do komórek T pod wpływem ekspozycji ↑[H+] przywróciła całkowity poziom ekspresji H3K27me3 (ryc. 3f). Specyficzne zmniejszenie poziomu H3K27me3 obserwowane w komórkach T poddanych długotrwałemu leczeniu ↑[H+ ] skłoniło nas do postawienia hipotezy, że ekspozycja ↑[H+ ] selektywnie reguluje metylotransferazę specyficzną dla odkładania się H3K27me3. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy znacząco zmniejszoną ekspresję EZH2, kluczowej metylotransferazy dla H3K27me3, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka w komórkach T eksponowanych na ↑[H+] (dane rozszerzone, ryc. 5c, d). Co więcej, hamowanie aktywności EZH2 przez wysoce specyficzny inhibitor, GSK126, zwiększyło ekspresję TCF1, a także odsetek limfocytów T CCR7+ CD62L+ CD8+ (dane rozszerzone ryc. 5e, f) , co było zgodne z poprzednim raportem, że EZH2 może regulować potencjał komórek T pamięci poprzez selektywne modyfikacje epigenetyczne45. Aby zidentyfikować ogólnogenowe zmiany we wzorcach epigenetycznych indukowanej ↑[H+] macierzystych komórek T, przeprowadziliśmy test CUT&Tag-seq i stwierdziliśmy minimalne zmiany w proporcjonalności odkładania się H3K4me3 i H3K27me3 pomiędzy różnymi leczonymi grupami wzdłuż promotora, ciała genu i regiony międzygenowe (dane rozszerzone, ryc. 5g). W szczególności profilowanie epigenomiczne ujawniło obniżony poziom represyjnego markera histonowego H3K27me3 w loci genów związanych z pamięcią (na przykład TCF7, CCR7, ID3, LEF1 i KLF2) w długoterminowych komórkach T leczonych ↑[H+] (ryc. 3g) . Co ważne, dodatek metioniny w warunkach ekspozycji na ↑[H+ ] częściowo przywrócił poziom H3K27me3 w powyższych loci, a także ekspresję ich genów, co sugeruje ważną rolę metioniny w epigenetycznej modulacji tych genów związanych z pamięcią (ryc. 3g i Rozszerzone dane rys. 5h). Zgodnie z poprzednim badaniem14, geny efektorowe, takie jak PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 i NR4A2, korzystnie uzyskały aktywujący wzór metylacji histonów (H3K4me3hi i H3K27me3lo) (ryc. 3g). Warto zauważyć, że zajęcie H3K4me3 w regionach promotorowych tych genów efektorowych zostało zaburzone w komórkach T hodowanych w warunkach ekspozycji ↑[H+] i zostało przywrócone przez suplementację metioniną (ryc. 3g). Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te wskazują, że przerwanie cyklu metioninowego za pośrednictwem ↑[H+] sprzyja epigenetycznej ochronie łodygi komórek T.

Kilka transporterów metioniny (SLC), w tym SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 i SLC43A2, może pośredniczyć w transporcie metioniny46. Aby zbadać, w jaki sposób ekspozycja na ↑[H+] zmniejsza wychwyt i metabolizm metioniny w komórkach T, przeanalizowaliśmy wzorce ekspresji różnych SLC i odkryliśmy, że ↑[H+] radykalnie obniża ekspresję SLC7A5 i SLC38A2, ale ma niewielki wpływ na ekspresję SLC38A1 (rozszerzone Dane Rys. 6a,b). Ponadto ekspozycja na ↑[H+] zmniejszyła ekspresję i aktywność MYC (dane rozszerzone, ryc. 6c, d), o którym doniesiono, że reguluje ekspresję transporterów metioniny, takich jak SLC7A5 (ref. 47). Następnie wykazaliśmy wysokie obłożenie MYC w promotorze SLC7A5 i, w mniejszym stopniu, w promotorze SLC38A2 (dane rozszerzone, ryc. 6e). Co ważne, znacząco zmniejszone wiązanie MYC z tymi loci zaobserwowano w długoterminowych komórkach T traktowanych ↑[H+] (dane rozszerzone, fig. 6e). Zgodnie z tymi obserwacjami, nadekspresja MYC znacząco przywróciła ekspresję SLC7A5 i SLC38A2 w komórkach T eksponowanych na ↑[H+] (dane rozszerzone, ryc. 6f). Wyniki te potwierdzają ważną rolę MYC w zmniejszonej ekspresji transporterów metioniny po ekspozycji na ↑[H+]. Co ciekawe, odkryliśmy, że suplementacja metioniną może również przywrócić ekspresję MYC i SLC7A5 w komórkach T eksponowanych na ↑[H+] (dane rozszerzone, ryc. 6g), co sugeruje, że suplementacja metioniną może przywrócić zdolność komórek T do wychwytu metioniny poprzez zwiększanie ekspresji transportera metioniny SLC7A5 w sposób zależny od MYC. Poprzednie badanie wykazało, że SLC7A5 jest najobficiej występującym transporterem metioniny w aktywowanych limfocytach T47. To, w połączeniu z naszymi wcześniejszymi ustaleniami, sugeruje, że SLC7A5 może odgrywać ważną rolę w indukowanym ↑[H+] ograniczeniu metioniny i utrzymaniu stanu przypominającego łodygę. Rzeczywiście odkryliśmy, że nadekspresja SLC7A5 częściowo zaburza fenotyp podobny do łodygi indukowany ↑[H+] (dane rozszerzone ryc. 6h, i), co dodatkowo potwierdza udział transportera metioniny SLC7A5 w pamięci komórek T indukowanej ↑[H+] -podobny fenotyp. Analizując różne subpopulacje limfocytów T CD8+ naciekających nowotwór, stwierdziliśmy zmniejszoną ekspresję zarówno MYC, jak i SLC7A5 w CD8+ TIL przypominających pamięć (dane rozszerzone, ryc. 7a, b), co jest zgodne z wynikami naszych badań in vitro. Zatem odkrycia te sugerują, że oś MYC – SLC7A5 – metionina może potencjalnie przyczynić się do zachowania statusu TIL przypominającego pamięć.

ryc. 2|↑ Ekspozycja na [H+ ] wyzwala przeprogramowanie metaboliczne i tłumi sygnalizację mTOR. a, analiza GO z wykorzystaniem danych o sekwencji RNA, pokazująca reprezentatywne geny metaboliczne o zróżnicowanej ekspresji w kontrolnych i kondycjonowanych kwasem mlekowym ludzkich komórkach T (skorygowana wartość P <4, 23 × 10–2). b, Schemat wzorców znakowania [13C6]glukozy lub [13C16]palmitynianu. c, Procent wskazanego m+3 mleczanu w stosunku do całkowitego mleczanu lub m+3 pirogronianu do całkowitego pirogronianu w komórkach T. n=3 niezależnych próbek. d, Procent izotopomeru dla półproduktów TCA, takich jak cytrynian (m+2), jabłczan (m+2) i bursztynian (m+2), pochodzących z [13C6]glukozy. n=3 niezależnych próbek. e, Procent wskazanego m+2 acetylo-CoA z całkowitego acetylo-CoA lub izotopu m+2 cytrynianu z całkowitego cytrynianu w komórkach T z palmitynianu [13C16]. n=4 niezależnych próbek. f, GSEA z analizą statystyczną zestawu genów związanych z sygnalizacją mTORC1 w grupie kontrolnej w porównaniu z ludzkimi komórkami T kondycjonowanymi kwasem mlekowym (po lewej) lub o pH 6.6-kondycjonowanymi (po prawej). g, h, Analiza metodą cytometrii przepływowej i oznaczenie ilościowe S6 fosforylowanego w Ser235 i Ser236 (g) oraz 4EBP1 fosforylowanego w Thr37 i Thr46 (h) w ludzkich limfocytach T CD8+ we wskazanych warunkach. n=3 niezależnych próbek. I, Analiza metodą cytometrii przepływowej i oznaczenie ilościowe energochłonnej syntezy białek w kontrolach lub ludzkich komórkach T kondycjonowanych kwasem mlekowym lub pH 6.6-. n=3 niezależnych próbek. Dane przedstawiono jako średnią ± sem. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą jednostronnego dokładnego testu Fishera z testem wielokrotnych porównań Benjaminiego–Hochberga (a) lub niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta (c–e, g–i). Nominalne wartości P i FDR obliczono metodą domyślną w oprogramowaniu GSEA (f).

ryc. 3|Zwiększony [H+ ] zmienia metabolizm metioniny komórek T, aby zachować łodygę epigenetyczną. wykres GSEA zestawu genów związanych z metabolizmem jednowęglowym oraz metabolizmem cysteiny i metioniny w kontroli w porównaniu z ludzkimi komórkami T kondycjonowanymi kwasem mlekowym. b, Schemat wzorców znakowania [13C5]metioniną. c, Procent wewnątrzkomórkowego SAM (m+5), SAH (m{+4) i MTA (m+1) ​​pochodzących z [13C5]metioniny, z ich odpowiednich pul całkowitych, w Komórki T hodowane w warunkach kontrolnych lub z 10 mM kwasem mlekowym lub 10 mM kwasem mlekowym uzupełnionym metioniną (10 mM + Met). n=3 niezależnych próbek. d, Względna obfitość [12C5]metioniny i [13C5]metioniny w limfocytach T. e, Reprezentatywny histogram i oznaczenie ilościowe TCF1 w ludzkich limfocytach T CD8+ hodowanych w różnych warunkach. n=3 niezależnych próbek. f, Wpływ suplementacji metioniną na metylację histonów w ludzkich komórkach T. H3K4me3, histon H3 trimetylowany w K4; H3K79me2, H3 dimetylowany w K79; H3K27me3, H3 trimetylowany przy K27; H3K9me2, H3 dimetylowany w K9. n=3 niezależnych próbek. g, Widok ścieżki genomu reprezentatywnych loci genów pokazujący piki H3K27me3 (czerwony, powyżej linii) lub H3K4me3 (niebieski, poniżej linii). Dane CUT&Tag-seq pochodzą z dwóch niezależnych próbek. Dane przedstawiono jako średnią ± sem Nominalne wartości P, a FDR obliczono przy użyciu domyślnej metody oprogramowania GSEA (a). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Tukeya (c–f).

Ekspozycja na ↑[H+ ] utrzymuje sprawność mitochondriów 

Biorąc pod uwagę zmniejszoną energochłonną syntezę białek w komórkach T kondycjonowanych ↑[H+], postawiliśmy hipotezę, że długoterminowa ekspozycja na ↑[H+] może skutkować znacznymi zmianami w komórkowym metabolizmie energetycznym. Zarówno kontrolne, jak i kondycjonowane ↑[H+] limfocyty T analizowano przy użyciu SCENITH42 w celu obliczenia zależności od glukozy, zależności mitochondrialnej, zdolności glikolitycznej oraz zdolności utleniania FAO i aminokwasów (ryc. 4a i dane rozszerzone ryc. 8a). Zgodnie z naszymi wynikami metabolomiki i śledzenia izotopów zaobserwowaliśmy zwiększony metabolizm mitochondriów w komórkach T eksponowanych na ↑[H+], podczas gdy tempo glikolizy było zmniejszone (ryc. 4b, c i dane rozszerzone ryc. 8b), co wskazuje na przeprogramowanie wewnątrzkomórkowych metabolizm energetyczny w limfocytach T kondycjonowanych ↑[H+]. Analiza konika morskiego ujawniła ponadto, że limfocyty T kondycjonowane ↑[H+] wykazywały wyższy współczynnik zużycia tlenu (OCR), jak również SRC, podstawową cechę komórek T CD8+ o pamięci długotrwałej22 i niższy stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego ( ECAR) (ryc. 4d – h i dane rozszerzone ryc. 8c – f). Ponieważ zwiększona masa/fuzja mitochondriów i zmniejszony potencjał błony mitochondrialnej (Δψm) są ważne dla utrzymania łodygi komórek T48–50, zbadaliśmy dalej ilość i jakość mitochondriów komórek T kondycjonowanych ↑[H+ ] i odkryliśmy, że ↑[H+ ] leczenie zwiększyło masę mitochondrialną zarówno w ludzkich, jak i mysich komórkach T (ryc. 4i, j i dane rozszerzone, ryc. 8g, h), które również utrzymują niższą Δψm (ryc. 4k i dane rozszerzone, ryc. 8i). Analiza ultrastruktury za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) ujawniła, że ​​komórki T eksponowane na ↑[H+] miały duże, gęsto upakowane mitochondria rozproszone w cytoplazmie i miały wiele ciasnych, wąskich cristae w porównaniu z kontrolnymi limfocytami T, co jest zgodne z opublikowanymi wynikami dotyczącymi na morfologię mitochondriów w limfocytach T pamięci (ryc. 4l, m). Zgodnie z tym odkryciem zaobserwowaliśmy również zwiększoną ekspresję genów kilku krytycznych regulatorów fuzji mitochondriów w komórkach T kondycjonowanych ↑[H+] (dane rozszerzone, ryc. 8j), co, jak sugeruje się, odgrywa niezbędną rolę w generowaniu komórek T pamięci50. W sumie odkrycia te wskazują, że ekspozycja na ↑[H+] zwiększa masę/fuzję mitochondriów i ich zdolność do promowania tworzenia komórek T przypominających łodygę.

Cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

↑ Ekspozycja na [H+ ] zwiększa działanie przeciwnowotworowe komórek T CD8+ 

Limfocyty T podobne do macierzystych sprzyjają wszczepianiu, ekspansji i skuteczności przeciwnowotworowej w immunoterapii adoptywnej51. Aby zbadać, czy długoterminowe in vitro limfocyty T CD8+ utrzymywane ↑[H+ ] wykazują zwiększoną ekspansję lub trwałość po przeniesieniu, CD45.1+ Limfocyty T OT-IT, które namnażano jako kontrolę lub ↑[ Kondycjonowaną pożywkę H+] adoptywnie przeniesiono do myszy CD45.2+C57BL/6N bez wszczepionego nowotworu (ryc. 5a). Chociaż wykryto nieznacznie zwiększoną liczbę komórek apoptotycznych po kondycjonowaniu ↑[H+] (dane rozszerzone, ryc. 9a), stwierdzono znacząco wyższy odsetek komórek T w krwi obwodowej myszy przeniesionych z limfocytami T namnożonymi w warunkach ↑[H+] w porównaniu z tymi ekspandowanymi w pożywce kontrolnej (kontrolne komórki T) (ryc. 5b). Podobnie wykryto znacznie wyższą częstotliwość limfocytów T w śledzionie i węzłach chłonnych (LN) (dane rozszerzone, ryc. 9b, c). Ponadto odkryliśmy znacznie zwiększoną akumulację limfocytów T w nowotworach, śledzionie i drenujących węzłach chłonnych u myszy z guzem B16-OVA, u których komórki ekspandowane ↑[H+] zostały przeniesione adopcyjnie w porównaniu z myszami, które otrzymały komórki kontrolne, co sugeruje, że limfocyty T CD8+ utrzymywane w ↑[H+ ] mają lepszą trwałość (ryc. 5c – e i dane rozszerzone ryc. 9d). Zgodnie z tymi odkryciami, odsetek limfocytów T pamięci był znacząco zwiększony w śledzionach i LN myszy, które otrzymały limfocyty T kondycjonowane ↑[H+] (ryc. 5f i dane rozszerzone ryc. 9e). Warto zauważyć, że komórki T OT-I ekspandowane ↑[H+] wykazywały znacząco opóźniony wzrost nowotworu w porównaniu z kontrolnymi komórkami T (ryc. 5g). Następnie zbadaliśmy skuteczność terapeutyczną limfocytów T CD19 ze zmodyfikowanym chimerycznym receptorem antygenu (CAR) z ekspandowanym ↑[H+] z modelem nowotworu in vivo, w którym komórki nowotworowe CD19-K562 wstrzyknięto podskórnie w boki Myszy NCG (ryc. 5h). Odkryliśmy, że ekspozycja na ↑[H+] również sprzyjała macierzystości komórek CAR-T, ale nie miała wpływu na apoptozę (dane rozszerzone, ryc. 9f), o czym świadczy znacznie zwiększony odsetek CAR-T przypominającego łodygę CCR7+ CD62L+ komórki, jak również zwiększoną ekspresję TCF1 (dane rozszerzone, ryc. 9g, h). Dodatkowo, zaobserwowano większą szybkość akumulacji komórek CAR-T w miejscach guza i śledzionie myszy NCG po infuzji komórek T kondycjonowanych ↑[H+] (Fig. 5i). Zgodnie z oczekiwaniami, myszy NCG, którym adopcyjnie przeniesiono komórki CAR-T, które namnożono w ↑[H+ ], wykazywały większy klirens wszczepionego guza CD19+ w porównaniu z tymi, które otrzymały namnożone komórki CAR-T w pożywce kontrolnej (ryc. 5j). Podsumowując, dane te wykazały, że leczenie ↑[H+] sprzyja trwałości in vivo i działaniu przeciwnowotworowemu limfocytów T.

Ekspozycja na ↑[H+ ] ogranicza wyczerpanie komórek T

Aby dokładniej zbadać wpływ trwałej ekspozycji na ↑[H+ ] na wyczerpanie komórek T in vitro, zmierzyliśmy ekspresję LAG-3 i TIM-3 w ludzkich komórkach T pobudzonych ↑[H+ ], które przeszły wiele rund dalszą stymulację przeciwciałami anty-CD3 i kondycjonowano w pożywce kontrolnej (ryc. 6a). Stwierdziliśmy, że zarówno ekspresja LAG-3, jak i TIM-3 była zmniejszona w limfocytach T eksponowanych na ↑[H+] (ryc. 6b i dane rozszerzone ryc. 10a), co wskazuje, że leczenie ↑[H+] skutkuje zmniejszonym Wyczerpanie komórek T. Ponadto odkryliśmy, że wysokie stężenie metioniny prowadzi do wzrostu ekspresji markerów hamujących, takich jak PD-1, LAG-3 i TIM-3, podczas gdy leczenie niskim stężenie metioniny nieznacznie zmniejszyło ekspresję tych markerów (rysunek uzupełniający 6a – c). Warto zauważyć, że po długotrwałej ekspozycji in vitro na ↑[H+ ] częstość infiltracji komórek T OT-IT i komórek T CD19-CAR w nowotworach przez TIM-3+ LAG-3+ była w dużej mierze zmniejszone po transferze adopcyjnym (ryc. 6c – e i dane rozszerzone ryc. 10b), co jest zgodne z ich mniejszym wyczerpaniem in vitro i lepszą zdolnością kontroli nowotworu in vivo. Ponadto wykazaliśmy, że długoterminowo kondycjonowane ↑[H+] komórki T wykazywały znacząco zmniejszoną ekspresję TOX zarówno in vitro, jak i in vivo (ryc. 6f, gi dane rozszerzone ryc. 10c, d). Jak opisano wcześniej, wyczerpane limfocyty T można ogólnie podzielić na podzbiór wyczerpany progenitorem lub ostatecznie wyczerpany, jak określono na podstawie ekspresji TCF1 i TIM-352,53. W związku z tym zmierzyliśmy wzór ekspresji TCF1 i TIM-3 w komórkach CD45.1+ TIL i zauważyliśmy, że częstotliwość limfocytów T terminalnie wyczerpanych TCF1−TIM-3+ była w dużym stopniu zmniejszona, przy znacznie zwiększony odsetek TCF1+ TIM-3 – progenitorowych komórek T poddanych kondycjonowaniu ↑[H+ ] (ryc. 6h). Co więcej, wykazaliśmy zwiększoną populację progenitorowych komórek T LY108+ TIM-3 (dane rozszerzone, ryc. 10e), a także zwiększoną częstotliwość IFN- + TNF- + T komórki (rozszerzone dane, ryc. 10f), co dodatkowo potwierdza fakt, że długoterminowe in vitro ↑[H+]-powiększone adoptywnie przeniesione limfocyty T ograniczają wyczerpanie i zachowują łodygę.

Dyskusja

ACT specyficzny dla nowotworu jest obiecującą metodą leczenia osób z nowotworami opornymi na leczenie, ale efekty terapeutyczne są w dużej mierze ograniczone przez dysfunkcję limfocytów T w TME. Ostatnio dużą uwagę poświęcono wstępnemu kondycjonowaniu limfocytów T przejściowym niedoborem glukozy, ograniczeniem glutaminy lub podwyższonym poziomem zewnątrzkomórkowego potasu (↑[K+ ]) podczas hodowli in vitro w celu zachowania łodygi komórek T i poprawy wyników terapeutycznych54-56. W tym badaniu wykazaliśmy, że hodowanie limfocytów T CD8+ przy wysokich poziomach [H+ ] podczas szczepienia nieoczekiwanie sprzyjało nabywaniu łodygi komórek T i zwiększonej odporności na wyczerpanie limfocytów T, znacznie poprawiając działanie przeciwnowotworowe adoptywnie przeniesione komórki T.

Nadmierne gromadzenie się kwasu mlekowego w TME od dawna uważane jest za kluczowy czynnik ucieczki odporności nowotworu. Na przykład wykazano, że kwas mlekowy i kwaśny TME hamują aktywność cytolityczną limfocytów T CD{{0}} i produkcję cytokin31–33,57. Zgodnie z tymi odkryciami odkryliśmy również, że krótkotrwała ekspozycja na ↑[H+] in vitro była wystarczająca, aby głęboko zahamować wytwarzanie cytokin efektorowych, ale nie miała wpływu na ekspresję TCF1 ani cechy metaboliczne związane z łodygą. Jednak długotrwałe leczenie ↑[H+] nieoczekiwanie promowało ekspresję TCF1 i utrzymywało fenotyp komórek T podobnych do łodygi poprzez przeprogramowanie metaboliczne i przebudowę epigenetyczną. Ekspozycja komórek T na ↑[H+ ] po ich pełnej aktywacji może również wywołać fenotyp podobny do łodygi, wykluczając w ten sposób możliwość, że komórki T wystawione na niskie pH po prostu stały się oporne na stymulację, zamiast przyjąć stan podobny do łodygi. Fizjologiczne stężenie kwasu mlekowego we krwi zdrowych osób wynosi około 1,5–3,0 mM, ale w TME może wzrosnąć od 10 mM do 40 mM35,58. Stosując model trwałej stymulacji anty-CD3/CD28, Feng i in. niedawno donieśli, że wysokie stężenie mleczanu sodu zwiększa poziomy H3K27ac w locus superwzmacniacza TCF7 poprzez hamowanie aktywności deacetylazy histonów, co prowadzi do zwiększonej ekspresji TCF1 i promowania pnia komórek T CD8+59. Natomiast odkryliśmy, że długoterminowa ekspozycja na stosunkowo niskie stężenie kwasu mlekowego (10 mM), ale nie mleczanu sodu, może łatwo wywołać sygnaturę przypominającą łodygę limfocytów T poprzez ograniczenie metabolizmu metioniny i regulację H3K27me3 odkładanie się w loci genów związanych z łodygą, co wyraźnie potwierdza wyraźną regulację epigenetyczną przez mleczan sodu i kwas mlekowy. Jednakże traktowanie niską kwasowością (pH 6,9) nie ma znaczącego wpływu na ekspresję TCF1 przy trwałej stymulacji anty-CD3/CD28, co sugeruje, że podobne do łodygi sygnatury limfocytów T CD8+ indukowane przez ↑[H+ ] ekspozycję można zastąpić stymulacją TCR. Aktywacja TCR może zwiększyć wychwyt metioniny i przeprogramować metabolizm metioniny, aby wspomóc aktywację limfocytów T19,60. Spekulowaliśmy, że stymulacja TCR może wzmacniać wychwyt metioniny w komórkach T traktowanych ↑[H+], które ograniczały metabolizm metioniny, zaburzając w ten sposób pnie epigenetyczne indukowane ↑[H+]. Ponadto komórki T mogą wykorzystywać jony mleczanowe jako zewnątrzkomórkowe źródło węgla, aby ułatwić uzyskanie łodygi w obecności lub przy braku trwałej stymulacji TCR. Aktywność metaboliczna jest ściśle związana z różnicowaniem limfocytów T, a pewne interwencje metaboliczne mogą w znacznym stopniu sprzyjać tworzeniu się komórek T pamięci długotrwałej21,37,61,62. W związku z tym nasze analizy metabolomiczne i śledzenie izotopów potwierdzają pogląd, że długoterminowa ekspozycja na ↑[H+] prowadzi do uderzającego przeprogramowania metabolicznego, takiego jak zmniejszony wychwyt glukozy i zmniejszony metabolizm glikolizy i cyklu TCA. Kilka badań wykazało, że komórki pamięci T CD8+ wykorzystują FAO do zaspokajania swoich potrzeb energetycznych, chociaż jest to prawdopodobnie adaptacja do różnicowania linii pamięci, a nadekspresja Cpt1 sprzyja długowieczności komórek T21,22,63,64. Jednakże w swoim modelu specyficznej dla limfocytów T delecji genetycznej Cpt1a Raud i in. niedawno wykazano, że LC-FAO jest w dużej mierze zbędny do aktywacji limfocytów T i tworzenia komórek pamięci T CD8+65. Wyjaśnienie takiej rozbieżności pozostaje wyzwaniem. W kontekście naszego badania spekulujemy, że przeprogramowanie metabolizmu kwasów tłuszczowych spowodowane kwasicą zewnątrzkomórkową jest prawdopodobnie związane z wytwarzaniem komórek T pamięci, chociaż dokładny mechanizm leżący u podstaw tej hipotezy wymaga dalszych badań. Ponadto odkryliśmy, że ekspozycja na ↑[H+] hamuje aktywność mTOR, która może być indukowana przez hamowanie glikolityczne. Warto zauważyć, że tłumienie sygnalizacji mTOR może również przyczyniać się do przejścia metabolicznego z glikolizy do oddychania mitochondrialnego. Rzeczywiście, te komórki T ekspandowane ↑[H+] wykazywały lepszą sprawność mitochondriów, o czym świadczy znaczny wzrost SRC i masy mitochondriów oraz zmniejszenie Δψm. Te sygnatury mitochondrialne, które są wzbogacone w macierzyste limfocyty T i są powiązane z długowiecznością i doskonałą aktywnością przeciwnowotworową in vivo, są ściśle modulowane przez dynamikę fuzji i rozszczepienia mitochondriów22,48,50. Białko fuzyjne mitochondrialnej błony wewnętrznej OPA1 odgrywa niezastąpioną rolę w wytwarzaniu komórek T pamięci50. Zgodnie z tym odkryliśmy, że kwasica zewnątrzkomórkowa promuje również ekspresję OPA1 w komórkach T, ostatecznie prowadząc do równowagi morfologicznej w kierunku fuzji w komórkach T. Wykazano, że wiele metabolitów komórkowych bezpośrednio przyczynia się do modyfikacji epigenetycznych. Na przykład metabolizm jednowęglowy może wygenerować uniwersalny donor metylu SAM do metylacji histonów66.

ryc. 4|Sprawność mitochondrialna utrzymuje się w komórkach T narażonych na ↑[H+]. analiza SCENITH ludzkich limfocytów T w komórkach kontrolnych lub komórkach T kondycjonowanych kwasem mlekowym. Pokazano reprezentatywny poziom translacji (anty-Puro) (n=3 niezależnych próbek). Linia przerywana przedstawia poziom tła uzyskany po traktowaniu 2-deoksy-d-glukozą + oligomycyną (2-DG+O). b, c, Analiza ilościowa pojemności glikolitycznej (b) i zależności mitochondrialnej (c) w obrębie a. n=3 niezależnych próbek. d – f, OCR (d) komórek T kontrolnych i kondycjonowanych kwasem mlekowym mierzono w czasie rzeczywistym w warunkach podstawowych w odpowiedzi na wskazane inhibitory. FCCP, cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon; ROT/AA, rotenon i antymycyna A. Reprezentatywna analiza statystyczna podstawowego OCR (e), maksymalnego oddychania (e) i SRC (f). n=9 testów; Analizie poddano 3 niezależne próbki i każdą próbkę mierzono 3 razy. g, h, ECAR (g) kontrolnych lub kondycjonowanych kwasem mlekowym komórek T mierzonych w odpowiedzi na wskazane inhibitory. Reprezentatywna analiza statystyczna podstawowego ECAR i akcentowanego ECAR (h). n=9 testów; Wykryto 3 niezależne próbki i każdą próbkę mierzono 3 razy. i, Analiza immunoblot COXIV i TIM23 w ludzkich komórkach T we wskazanych warunkach. Aktynę zastosowano jako kontrolę ładowania. j, k, reprezentatywne histogramy lub wykresy konturowe oraz analiza statystyczna odpowiednio masy mitochondrialnej (MTG) (j) i potencjału błony mitochondrialnej (TMRM) (k), odpowiednio w kontroli, kwasie mlekowym lub pH 6.{{30} }kondycjonowane ludzkie komórki T. n=3 niezależnych próbek. l, m, Reprezentatywna morfologia mitochondriów komórek T hodowanych w warunkach kontrolnych, kwasie mlekowym lub w warunkach pH 6,6 przez 12 dni, analizowana za pomocą EM (pasek skali, 1 μM) (l). Powierzchnia poszczególnych mitochondriów w limfocytach T (m), n=45 komórek. Dane przedstawiono jako średnią ± sem. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta.

ryc. 5|↑ Komórki T ekspandowane [H+] wykazują zwiększoną aktywność przeciwnowotworową. a, b, Limfocyty T CD8+ kontrolne lub ekspandowane w kwasie mlekowym analizowano pod kątem trwałości po transferze adopcyjnym (n myszy=6). Świeżo wyizolowane mysie CD45.1+ Limfocyty T OT-I aktywowano mysią IL-2 i związanymi z płytką przeciwciałami przeciw mysim CD3 i przeciw mysim CD28 przez 2 dni, a następnie utrzymywano w pożywce hodowlanej z mysz IL-2 aż do transferu adopcyjnego (CD3&CD28+IL-2). Schemat doświadczenia na zwierzętach (a), jak również reprezentatywne wykresy FACS i analiza statystyczna CD45.1+ i CD45.2+ Limfocyty T we krwi pokazano w (b). c–g, CD45.1+ Komórki T OT-I namnażano w pożywce kontrolnej lub z kwasem mlekowym przez 7 dni i przenoszono do myszy z nowotworem B16-OVA i oceniano stosunek naciekania (n=5 myszy). Schemat eksperymentu na zwierzętach z użyciem myszy z nowotworem B16-OVA (c), a także reprezentatywne wykresy FACS (po lewej) i statystyki dotyczące liczby (po prawej) przeniesionych CD45.1+ OT- Limfocyty T w guzie (d). sc, wstrzyknięcie podskórne. Statystyki dotyczące odsetka komórek CD45.1+ limfocytów T (e) i reprezentatywne dane (po lewej) oraz statystyki dotyczące odsetka (po prawej) CD62L+ CD44+ CD45.1+ limfocyty T (f ) w śledzionie. Krzywa wzrostu guza (g) (n=5 myszy, dzień 14). h–j, Komórki T CD19-CAR namnażano w pożywce kontrolnej lub kwasie mlekowym przez 12 dni i przenoszono do myszy NCG z nadekspresją CD19-z nowotworem K562, a współczynnik naciekania w guzie i śledzionie wynosił oceniano (n=6 myszy). Pokazano schemat doświadczenia na zwierzętach (h), reprezentatywny procent przeniesionych limfocytów T w guzie i śledzionie (i) oraz krzywe wzrostu nowotworu (j) (n myszy=6, dzień 10). Dane przedstawiono jako średnią ± sem. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta.

ryc. 6|↑ Ekspozycja na [H+ ] ogranicza wyczerpanie komórek T. a Schemat przewlekłej stymulacji ludzkich limfocytów T in vitro. b, Reprezentatywne wykresy FACS dla LAG-3 i TIM-3 w chronicznie stymulowanych ludzkich komórkach T hodowanych w warunkach kontrolnych lub w warunkach kwasu mlekowego. n=3 niezależnych próbek. c, Ekspresja LAG-3 i TIM-3 w CD45.1+ TIL od myszy C57BL/6N z nowotworem B16-OVA (n=5 myszy ). d, Kwantyfikacja ekspresji LAG-3, TIM-3 i PD-1 w CD45.1+ TIL z B16-C57BL/ niosącego guz OVA/ myszy 6N (n=5 myszy). e, Ekspresja LAG-3 i TIM-3 w komórkach T CD19-CAR naciekających nowotwór od myszy NCG z nowotworem CD19-K562, jak określono metodą cytometrii przepływowej (n=6 myszy). f, Ekspresja TOX w CD45.1+ TIL od myszy C57BL/6N z nowotworem B16-OVA (n=5 myszy). g, Histogramy i analiza statystyczna TOX w komórkach T CD19-CAR naciekających nowotwór od myszy NCG CD19-K562 z guzem (n=6 myszy). h, po lewej, reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej dla TIM-3 i TCF1 w CD45.1+ TIL od myszy C57BL/6N z nowotworem B16-OVA (n=5 myszy) . No właśnie, odsetek populacji TCF1+ TIM-3– lub TCF1– TIM-3+. Dane przedstawiono jako średnią ± sem. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta.

Doniesiono, że metabolity, takie jak S-2-hydroksyglutaran i -hydroksymaślan, działają jako epigenetyczne regulatory różnicowania komórek T pamięci67,68. Nasze wyniki wykazały, że trwałe leczenie ↑[H+] ogranicza wychwyt metioniny i metabolizm metioniny, powodując zmniejszenie wewnątrzkomórkowej metioniny, SAM i SAH poprzez hamowanie ekspresji transporterów metioniny. Wyniki te mogą częściowo wyjaśniać, dlaczego limfocyty T nie są w stanie konkurować z komórkami nowotworowymi o wychwyt metioniny w TME69. Mechanicznie wykazaliśmy, że ekspozycja na ↑[H+] radykalnie zmniejszyła ekspresję MYC i jej wiązanie z promotorem SLC7A5, w konsekwencji skutkując zmniejszoną ekspresją SLC7A5 i zaburzonym metabolizmem metioniny w limfocytach T. Co ciekawe, suplementacja metioniną może przywrócić ekspresję MYC i SLC7A5, a także przepływ cyklu metioninowego w komórkach T eksponowanych na ↑[H+], co sugeruje, że przywrócenie zdolności wychwytu metioniny było prawdopodobnie spowodowane zwiększeniem poziomu transportera metioniny SLC7A5 w sposób zależny od MYC. Doniesiono, że aktywność mTOR reguluje translację MYC70. W związku z tym spekulowaliśmy, że indukowana przez ↑[H+] regulacja w dół MYC jest prawdopodobnie spowodowana represją translacyjną poprzez postępujące hamowanie mTOR i upośledzony wychwyt metioniny. Takie tłumienie można odwrócić poprzez suplementację egzogenną metioniną, chociaż dokładny mechanizm wymaga dalszych badań. Uważa się, że SAM pochodzący z cyklu metioninowego pośredniczy w metylacji histonów i przebudowie epigenetycznej podczas różnicowania efektorowych komórek T8,71. Zgodnie ze spadkiem wewnątrzkomórkowego SAM w komórkach T ekspandowanych ↑[H+], odkryliśmy, że zarówno całkowita liczebność H3K27me3, jak i jego zajęcie w promotorze loci macierzystych komórek T były znacznie zmniejszone. H3K27me3 i H3K4me3 są selektywnie modyfikowane w sposób korelujący z ekspresją genów kluczowych dla programu efektorowego lub macierzystego komórek T14. Rzeczywiście, w komórkach T ekspandowanych ↑[H+] występowało mniejsze wzbogacenie H3K4me3 w promotory genu efektorowego. Zatem obniżone poziomy SAM będącego donorem metylu wynikające z upośledzonego wychwytu i metabolizmu metioniny w stanie ↑[H+] prowadzą do zmian epigenetycznych, które ostatecznie sprzyjają różnicowaniu komórek T w stan pamięci. Co ciekawe, dodatek metioniny w warunkach ekspozycji na ↑[H+ ] nie tylko ratuje ekspresję MYC i SLC7A5 w komórkach T eksponowanych na ↑[H+ ], ale także przywraca całkowity poziom ekspresji H3K27me3, wspierając ważną rolę MYC–SLC7A5 –oś metabolizmu metioniny w regulacji pnia epigenetycznego indukowanego ↑[H+]. Rzeczywiście, odkryliśmy, że nadekspresja SLC7A5 częściowo zaburzyła fenotyp podobny do łodygi indukowany ↑[H+], co dodatkowo potwierdza kluczową rolę transportera metioniny SLC7A5 w nabywaniu fenotypu podobnego do pamięci komórek T pod ekspozycją ↑[H+].

Historycznie uważano, że większość TIL jest wyczerpana z powodu ciągłej ekspozycji na TCR w nowotworach, ale paradoksalnie niewielki podzbiór klonotypów komórek T w TIL wyrażających czynnik transkrypcyjny TCF1 zachowuje właściwości podobne do komórek macierzystych. Nasze odkrycia ujawniły, że ekspozycja na ↑[H+] kompensuje funkcję efektorową komórek T i zachowuje łodygę komórek T poprzez oś metabolizmu MYC–SLC7A5–metionina, co zapewnia możliwe wyjaśnienie obecnego paradoksu, dlaczego niewielka część TIL nadal ma łodygę- jak pamięć lub właściwości prekursora. W rzeczywistości donoszono o podobnych odkryciach, zgodnie z którymi jony potasu w TME pełnią podwójną rolę, wpływając zarówno na funkcję efektorową komórek T, jak i na ich łodygę56,72, co dodatkowo potwierdza złożone działanie czynników immunosupresyjnych TME (na przykład przewlekła stymulacja TCR, niedotlenienie i niski poziom glukoza) na funkcję i różnicowanie limfocytów T. Ponadto kwaśne regiony w nowotworach są wysoce dynamiczne i regulowane zarówno przestrzennie, jak i czasowo, a sprawność limfocytów T przystosowanych do kwasicy zewnątrzkomórkowej jest prawdopodobnie przyćmiona, gdy napotykają inne ostre czynniki TME, które mogą wpływać na funkcję efektorową i różnicowanie wewnątrzguzowych komórek T. Ponadto zaobserwowaliśmy wyższą ekspresję MYC w komórkach T wyczerpanych terminalnie (LY108−TIM-3+ ) niż w komórkach T wyczerpanych progenitorami (LY108+ TIM-3–), co jest zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, że komórki T MYClo preferencyjnie nabywają los pamięci73. Zgodnie ze zmniejszoną ekspresją SLC7A5 i wychwytem metioniny w limfocytach T eksponowanych na ↑[H+], ekspresja SLC7A5 była również znacząco zmniejszona w populacji limfocytów T wyczerpanych LY108+ TIM-3 w obrębie guzów, co sugeruje, że oś regulacyjna MYC – SLC7A5 – metionina może również działać in vivo. Obecnie jest oczywiste, że mniej zróżnicowane komórki T pamięci podobnej do łodygi mają lepsze działanie przeciwnowotworowe ze względu na ich długoterminową trwałość i odporność na rozwój dysfunkcji51,74. Dostarczyliśmy tu przekonujących dowodów na to, że długoterminowo kondycjonowane ↑[H+] limfocyty T CD8+ wykazywały zwiększoną trwałość i doskonałe właściwości przeciwnowotworowe in vivo, przy zmniejszonej populacji komórek T terminalnie wyczerpanych (TCF1-TIM{ {39}} ) i zwiększony podzbiór komórek progenitorowych przypominających łodygę (TCF1+ TIM-3– ) w obrębie guzów. Podsumowując, nasze obecne badanie dostarcza wglądu w wielowymiarowy wpływ ekspozycji na ↑[H+] na supresję funkcji efektorowej komórek T i jej zbieżny wpływ na łodygę komórek T.

Metody

Myszy i linie komórkowe

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Instytutu Medycyny Systemowej w Suzhou (ISM-IACUC-0151-R), a zwierzęta trzymano w specjalnych pomieszczeniach dla myszy wolnych od patogenów. Myszy trzymano w standardowych warunkach, z cyklami światło/ciemność 12-h/12-h, ​​kontrolowaną temperaturą 22–24 stopni i wilgotnością 60%, z nieograniczoną ilością pożywienia i wody dostępność i były sprawdzane codziennie. Wszystkie obciążenia nowotworami nie przekraczały pozwolenia zatwierdzonego przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt Instytutu Medycyny Systemowej w Suzhou. CD45.1+ Samice myszy transgenicznych OT-I TCR na tle C57BL/6N trzymano razem. CD45.2+ Samice myszy C57BL/6N w wieku 6–8 tygodni zakupiono od rzeki Vital jako biorcy. Samice myszy NCG (NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) w wieku 6–8 tygodni zakupiono od GemPharmatech. W jednym niezależnym eksperymencie in vivo myszy CD45.1+ i CD45.2+ (6–12 tygodni) dobrano pod względem płci. Komórki T HEK-293z kolekcji American Type Culture Collection (ATCC) utrzymywano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Linię komórek czerniaka mysiego B16 z ATCC transdukowano w celu ekspresji OVA i utrzymywano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Komórki K562 z ATCC transdukowano w celu ekspresji ludzkiego CD19 i hodowano w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1% nieistotnych aminokwasów, 1 mM pirogronianu sodu i 50 μM -merkaptoetanol. Wszystkie powyższe odczynniki zakupiono od Gibco.

Izolacja, aktywacja i transdukcja pierwotnych limfocytów T

Mysie limfocyty T CD{{0}} Wyizolowano ze śledzion samców lub samic myszy OT-I w wieku 6–12 tygodni przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD8 naiwnych (BioLegend) i hodowano w RPMI{{5} } pożywka uzupełniona 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% aminokwasów egzogennych, 1% GlutaMAX, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 M HEPES i 50 µM -merkaptoetanolu w obecności mysiej IL -2 (20U/ml, Peprotech). W jednym niezależnym eksperymencie in vitro, samce i samice myszy (6–12 tygodni) dobrano pod względem płci. Oczyszczone komórki aktywowano przeciwciałami anty-mysim CD3 (2 ug/ml, BioLegend) i anty-mysim CD28 (1 ug/ml, BioLegend) przez 48 godzin. Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców zakupiono od Sailybio i hodowano w pożywce RMPI-1640 uzupełnionej 5% ludzką surowicą AB (Gemini), 1% penicyliną-streptomycyną, 1% nieistotnymi aminokwasami, 1% GlutaMAX, 1 mM pirogronian sodu, 0,1 M HEPES i 50 µM -merkaptoetanol w obecności ludzkiej IL-2 (100 U/ml, Peprotech). Do aktywacji PBMC przez 3 dni stosowano przeciwciała monoklonalne przeciw ludzkiemu CD3 (1 ug/ml, BioLegend) i przeciw ludzkiemu CD28 (1 ug/ml, BioLegend). Oczyszczone mysie i ludzkie komórki T aktywowano i namnażano we wskazanych warunkach hodowli: pH 7,4, pH 6,6, kwas mlekowy (Sangon) lub mleczan sodu (Sangon). Do uzupełnienia podłoża o pH 6,6 lub kwasu mlekowego (10 mM) stosowano następujące metabolity: metionina 800 µM (MCE), SAM 100 µM (MCE) lub SAH 100 µM (Sigma). W celu transdukcji wirusa aktywowano 1 x 106 PBMC na dołek w 24-dołkowych płytkach. Po 48 godzinach aktywacji większość pożywki zastąpiono niezatężonym supernatantem retrowirusa z 10 µg/ml polibrenu (Santa Cruz). Po wirowaniu przy 600 g przez 90 minut w temperaturze 30 stopni, komórki hodowano w inkubatorze przez 24 godziny w świeżej pożywce. Transdukcję powtórzono 24 godziny później, a następnie ponownie przeniesiono do świeżej pożywki do hodowli. Do ilościowego określenia skuteczności infekcji wykorzystano receptor czynnika wzrostu nerwów o niskim powinowactwie (LNGFR).

Cytometrii przepływowej

Komórki barwiono przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Do barwienia markera powierzchniowego komórki barwiono fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami i zestawem do barwienia żywych/martwych komórek martwych (Invitrogen) w buforze FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 2% FBS), a następnie utrwalano 2% paraformaldehydem (Casmart) przez 20 min w temperaturze pokojowej. W celu wewnątrzkomórkowego barwienia fosfobiałek wstępnie wybarwione komórki utrwalono buforem utrwalającym (BioLegend), a następnie wybarwiono przeciwciałami fosfospecyficznymi w buforze permeabilizacyjnym (Invitrogen). W celu wykrycia cytokin wewnątrzkomórkowych komórki stymulowano octanem mirystynianu forbolu (PMA) w obecności brefeldyny A (BFA) (BioLegend) przez 4,5 godziny. Następnie wstępnie wybarwione komórki utrwalono i wybarwiono przeciwciałami przeciwko cytokinom w buforze permeabilizacyjnym. W celu wybarwienia wewnątrzkomórkowego czynnika transkrypcyjnego komórki wstępnie wybarwiono zestawem do barwienia żywych/martwych komórek z możliwością utrwalania martwych komórek i fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w buforze FACS w celu wykrycia markerów powierzchniowych. Komórki następnie utrwalano przez 30 minut na lodzie przy użyciu buforu utrwalającego FOXP3/czynnik transkrypcyjny (Invitrogen) i barwiono przeciwciałami czynnika transkrypcyjnego w buforze permeabilizacyjnym. Po barwieniu komórki ponownie zawieszono w buforze FACS do cytometrii przepływowej. Dane cytometrii przepływowej zebrano za pomocą BD LSR Fortessa i BD FACSDiva (wersja 8.0.2) i przeanalizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (wersja 10.4). Reprezentatywne strategie bramkowania przedstawiono na rysunku 10b z danymi rozszerzonymi.

Sekwencjonowanie RNA

Analizę seq RNA przeprowadzono przy użyciu 12-dniowych limfocytów T hodowanych we wskazanych warunkach, jak pokazano na ryc. 1a. W skrócie, 12 dni po ekspansji komórek T, całkowity RNA ekstrahowano przez homogenizację w TRIzolu (Takara) i zamrożenie w probówkach wolnych od RNazy w ciekłym azocie. Integralność RNA oceniano za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Biblioteki skonstruowano przy użyciu zestawu do przygotowania próbki TruSeq RNA (FC-122-1001, Illumina). Biblioteki następnie zsekwencjonowano przy użyciu platformy Illumina NovaSeq 6000 (PE150) i wygenerowano około 40 milionów odczytów ze sparowanych końców (Novogene). Surowe liczniki odczytów wyodrębniono, a następnie znormalizowano według współczynników rozmiaru biblioteki przy użyciu DESeq2 (wersja 1.28.1). Do ustabilizowania wariancji pomiędzy próbkami zastosowano transformację logarytmu uregulowanego (r-log). Analizę wzbogacenia szlaków GO i KEGG genów o różnej ekspresji przeprowadzono z profilem klastrów (wersja 3.16.0). Mapy ciepła wyrażeń wygenerowano za pomocą pakietu R „pheatmap” (wersja 1.0.12). Do analizy GSEA użyto GSEA v.4.0.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq przeprowadzono jak opisano wcześniej75, stosując zestaw Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit dla Illumina (TD903, Vazyme). W skrócie, ludzkie komórki T namnażano przez 12 dni w warunkach kontrolnych, kwasie mlekowym lub kwasie mlekowym z 800 µM metioniny. Następnie 1 x 105 komórek T poddano lizie w celu ekstrakcji materiałów nukleinowych i inkubowano z kulkami ConA w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Komórki ponownie zawieszono w 50 µl buforu przeciwciał zmieszanego wstępnie z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-H3K27me3 lub anty-H3K4me3) i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Próbki inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie inkubowano wspólnie z transpozazą białka A/G-Tn5 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w celu zakłócenia fragmentacji DNA. Oczyszczone DNA wykorzystano do przygotowania biblioteki i zsekwencjonowano przy użyciu sekwencera PE150 firmy Illumina Nova6000.

Analiza CUT&Tag-seq

Do sprawdzenia jakości odczytu sekwencjonowania wykorzystano FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Jakość odczytów obniżono do minimalnego wyniku Phred wynoszącego 20 za pomocą trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Wszystkie odczyty wygenerowane przez CUT&Tag-seq H3K27me3 i H3K4me3 zostały dopasowane do ludzkiego genomu hg38 przy użyciu Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) z opcjami: –local– bardzo czuły-lokalny–bez-unal–nie-mieszany–bez niezgodności–phred33 -I 10 -X 700. Próbki bez wzbogaconego DNA normalizowano przy użyciu metody ChIPseqSpikeInFree, która jest nowatorska metoda normalizacji umożliwiająca skuteczne określenie współczynników skalowania dla próbek w różnych warunkach i poddawanych różnym zabiegom76. W przypadku H3K27me3 wartości szczytowe wywołano przy użyciu MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ szczyt_calling_macs .html) z opcjami '-g hs -f BAMPE-keep-dup all- broad-broad-cutoff 0,1'. W przypadku H3K4me3 w szczytowym wywołaniu wykorzystano MACS2 z parametrami „-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all”. Piki opatrzono adnotacjami za pomocą ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ChIPseeker/), a wizualizacje utworzono za pomocą deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) i pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT-PCR

Całkowity RNA wyizolowano za pomocą TRIzolu (Takara) i poddano odwrotnej transkrypcji na cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy HiScript (Vazyme), zgodnie z instrukcjami producenta. Do ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym zastosowano system ABI prism 7500 real-time PCR System (Thermo Fisher) i 2 x SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) zgodnie z instrukcjami producenta. Jako standard wewnętrzny zastosowano ACTB. Względną ekspresję mRNA obliczono metodą 2−ΔΔCT. Sekwencje starterów użyte do qPCR można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1.

Zachodni blotting

Do analizy ekspresji białka zebrano komórki i przemyto zimnym PBS, a całe białko ekstrahowano przy użyciu 1% SDS (Sangon) na lodzie. Stężenie białka mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Merck). Próbki białek rozdzielano w żelach SDS-PAGE, a następnie przenoszono na membrany PVDF (Millipore). Błony blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS zawierającym Tween20. Po zablokowaniu błony inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4 stopni i przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Sygnał HRP opracowano metodą elektrochemiluminescencji (ChemeMINI610) i zebrano za pomocą programu Sage Capture (wersja 2.19.12). Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ (v1.8.0).

Analiza morfologii mitochondriów

W każdym dołku płytek z {{0}}studzienkami komórki PBMC aktywowano ludzkimi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 przez 3 dni i hodowano w pożywce RPMI-1640 w różnych warunkach przez 12 dni. Następnie zebrano 1 x 106 PBMC i utrwalono we wstępnie schłodzonym buforze utrwalającym (2,5% aldehyd glutarowy, 0,1 M bufor fosforanowy (PB), pH 7,4) przez noc w temperaturze 4°C. Po trzykrotnym przemyciu PBS komórki utrwalono w 1% tetratlenku osmu w PBS przez 2 godziny, odwodniono i zatopiono w żywicy Spurra, zgodnie ze standardową procedurą. Ultracienkie skrawki barwiono octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Morfologię mitochondriów obrazowano przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) Hitachi HT-7800 (wersja 01.20) i kamery AMT-XR81DIR.

Przeciwciała i odczynniki

Do analizy metodą cytometrii przepływowej zastosowano następujące przeciwciała. APC anty-ludzki NGFR (nr kat. 345108, 1:1,000 dla FACS), FITC anty-ludzki CD4 (nr kat. 357406, 1:200 dla FACS), Pacific Blue anty-ludzki CD8 (nr kat. 300928, 1:200 dla FACS), APC-Cy7 anty-ludzki/mysi CD44 (nr kat. 103028, 1:200 dla FACS), PE anty-ludzki CCR7 (nr kat. 353204, 1 :200 dla FACS), PE anty-ludzki TNF- (nr kat. 502909, 1:200 dla FACS), PE-Cy7 anty-ludzki CD45RO (nr kat. 304230, 1:200 dla FACS), APC anty- ludzki IFN- (nr kat. 502512, 1:200 dla FACS), PE-Cy7 antyludzki LAG-3 (nr kat. 369310, 1:200 dla FACS), PE anty-ludzki TIM{{ 52}} (nr kat. 345006, 1:200 dla FACS), BV711 anty-ludzkie PD-1 (nr kat. 329928, 1:200 dla FACS), Percp-Cy5.5 anty-ludzkie CD62L (nr kat. 304824, 1:200 dla FACS), APC anty-ludzki CD27 (nr kat. 302810, 1:200 dla FACS), BV711 anty-mysi CD8 (nr kat. 100748, 1:200 dla FACS ), PE-Cy7 anty-mysi CD62L (nr kat. 104418, 1:200 dla FACS), APC-Cy7 anty-mysi CD45.2 (nr kat. 830789, 1:200 dla FACS), Pacific Blue anty- mysz CD45.1 (nr kat. 110722, 1:200 dla FACS), anty-mysz APC Ly108 (kat. NIE. 134610, 1:200 dla FACS), PE anty-mysi LAG-3 (nr kat. 125207, 1:200 dla FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC Antibody (nr kat. 626811, 1 :200 dla FACS), PE przeciw mysim TNF- (nr kat. 506306, 1:200 dla FACS) i APC przeciw mysim IFN- (nr kat. 505810, 1:200 dla FACS) zakupiono od BioLegend . Zestaw do barwienia żywych/martwych, utrwalalnych martwych komórek, PerCP-eFluor710 przeciw myszom PD-1 (nr kat. 46-9981-82, 1:200 dla FACS), fosfor PE-S6 (Ser235/236) (kat. nr 12-9007-42, 1:200 dla FACS), PE anty-ludzki/mysi TOX (nr kat. 12-6502-82, 1:200 dla FACS) i PE-Cy7 anty-mysi TIM{ {149}} (nr kat. 25-5870-82, 1:200 dla FACS) zakupiono w firmie Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anty-TCF1 (nr kat. 6709, 1:200 dla FACS) i fosfor-4E-BP1 (Thr37/46) (nr kat. 2846, 1:200 dla FACS) zakupiono w sklepie Technologia sygnalizacji komórkowej. Przeciwpuromycynę Alexa Fluor 647 (nr kat. MABE343-AF647, 1:800 dla FACS) zakupiono od firmy Merck. Przeciwciała stosowane w analizie Western blot były następujące. Królicze anty-fosfo-Akt (Ser473) (nr kat. 4060, 1:1,000 dla IB), anty-fosfo-NF-κB p65 (Ser536) (nr kat. 3033, 1:1 ,000 dla IB), anty-c-MYC (nr kat. 18583, 1:1,000 dla IB), anty-EZH2 (nr kat. 5246, 1:1,{ {200}} dla IB), anty-tri-metylo-histon H3 (Lys27) (nr kat. 9733, 1:1,000 dla IB), anty-tri-metylo-histon H3 (Lys4) (nr kat. 9751, 1:1,000 dla IB), anty-di-metylo-histon H3 (Lys9) (nr kat. 4658, 1:1,000 dla IB) , anty-dimetylo-histon H3 (Lys79) (nr kat. 5427, 1:1,000 dla IB), antyhiston H3 (nr kat. 9715, 1:1,{{242 }} dla IB), anty-COXIV (nr kat. 850, 1:1,000 dla IB), anty-królicze IgG (powiązane z HRP) (nr kat. 7074, 1:2,{ {253}} dla IB) i anty-mysie IgG (połączone z HRP) (nr kat. 7076, 1:2,000 dla IB) zakupiono od Cell Signaling Technology. Mysz anty-Tim23 (nr kat. 611223, 1:1,000 dla IB) pochodziła z firmy BD Biosciences. Mysie anty- -aktyna (nr kat. 66009-1-Ig, 1:5,000 dla IB), anty-SLC7A5 (nr kat. 67951-1-Ig, 1: 1,000 dla IB) i królicze anty-SLC38A1 (nr kat. 12039-1-AP, 1:1,000 dla IB) pochodziły z Proteintech. Królicze anty-SLC38A2 (nr kat. BMP081, 1:1,000 dla IB) zakupiono w Medical & Biological Laboratories.

Test metaboliczny komórek T

Aby sprawdzić wychwyt BODIPY FL C16 w komórkach T kontrolnych lub traktowanych ↑[H+], komórki T hodowano ze świeżo rozpuszczonym 1 µM BODIPY FL C16 (Invitrogen) przez 1 godzinę, następnie przemywano dwukrotnie PBS przed barwieniem powierzchni. Aby dokładniej zbadać zależność metaboliczną w różnych grupach terapeutycznych, przeprowadzono eksperymenty przy użyciu metody SCENITH (metabolizm energetyczny pojedynczych komórek poprzez profilowanie hamowania translacji)42. W skrócie, komórki T wysiano na 96-studzienkowe płytki w ilości 1 x 106 komórek/ml. Następnie komórki traktowano kontrolą (Ctrl), 2-deoksy-d-glukozą (końcowe stężenie 100 mM), oligomycyną (końcowe stężenie 5 µM) lub mieszanką inhibitorów w końcowych stężeniach przez 40 minut w 37 stopień . W ciągu ostatnich 30 minut dodano puromycynę (końcowe stężenie 10 ug/ml). Po traktowaniu puromycyną komórki przemyto zimnym PBS i wstępnie wybarwiono zestawem do barwienia żywych/martwych martwych komórek z możliwością utrwalania martwych komórek i przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym. Po barwieniu wewnątrzkomórkowej puromycyny przeprowadzono proces barwienia wewnątrzkomórkowych czynników transkrypcyjnych.

Analiza metabolomiczna za pomocą LC-MS/MS

Analizę metabolomiczną i pobranie próbek przeprowadzono tak jak w poprzednich raportach77. W skrócie, PBMC aktywowano indywidualnie w 24-dołkowych płytkach przez ludzkie anty-CD3/CD28 przez 3 dni i hodowano w pożywce RPMI 1640 z kontrolą lub kwasem mlekowym do 12 dnia. Następnie 8 × Zebrano 106 komórek na próbkę (n=4 niezależnych próbek na grupę) i przeniesiono do probówki o pojemności 1,5-ml w celu wirowania przy 300 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni, a następnie przemyto zimnym PBS. Po ponownym odwirowaniu przy 300 g przez 5 minut dodano 80% zimnego metanolu i energicznie wirowano w celu całkowitego rozbicia osadu komórkowego, a następnie komórki przeniesiono do zamrażarki w temperaturze -80 stopni. Próbki wirowano przy 12,000 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopnie. Zebrano supernatant. Na koniec ekstrakty liofilizowano i analizowano metodą UHPLC-MS/MS w Novogene. Surowe pliki danych wygenerowane przez UHPLC–MS/MS przetworzono przy użyciu Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) w celu wykonania wyrównania pików, wybrania pików i oznaczenia ilościowego każdego metabolitu. Do dalszej analizy danych wykorzystano oprogramowanie Metaboanalyst (v5.0), a następnie wybrano znacząco wzbogacone ścieżki przy użyciu P < 0,05.

Eksperymenty ze znakowaniem stabilnych izotopów

Przepływ metaboliczny 13C przeprowadzono na limfocytach T, stosując wcześniej opisane metody60,78,79. W skrócie, PBMC aktywowano w każdym dołku w 24-dołkowych płytkach z ludzkim anty-CD3/CD28 przez 3 dni, jak opisano powyżej. Do oznaczania poziomu glukozy [13C6] po 11 dniach zmieniono podłoże na wolne od glukozy RPMI (Gibco) uzupełnione 10% dializowanym FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% penicyliną-streptomycyną, 1% nieistotnymi aminokwasami, 50 µM -merkaptoetanol i 0,1 M HEPES zawierający 11 mM [13C6]glukozy (Cambridge Isotope Laboratories) z kontrolą lub 10 mM kwas mlekowy, przez 24 godziny. W celu śledzenia palmitynianu [13C16] aktywowano 2 x 107 komórek T i umieszczono w kompletnej pożywce z kontrolą lub w warunkach 10 mM kwasu mlekowego, jak opisano powyżej, w dniu 12, zawierającej 200 µM palmitynianu [13C16] (Cambridge Isotope Laboratories), na 8 H. W celu śledzenia [13C5]metioniny komórki T namnażano pod kontrolą kwasu mlekowego lub kwasu mlekowego z 800 µM metioniną przez 12 dni. Następnie 4 × 107 komórek T przełączono na pełną pożywkę RPMI wolną od metioniny (Gibco) i hodowano w warunkach kontrolnych, kwasie mlekowym lub kwasie mlekowym uzupełnionym metioniną (zawierającym 100 µM, 100 µM lub 800 µM [13C5]metioniny). (Cambridge Isotope Laboratories), przez 8 godzin. Zebrano odpowiednie supernatanty i następnie przechowywano w -80 stopniach. Komórki osadzono przez odwirowanie (300 g, 4 stopnie, 5 min), przemyto dwukrotnie solą fizjologiczną i natychmiast szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 stopni. Metabolity ekstrahowano przy użyciu lodowatego 80% metanolu do HPLC i krótko wirowano, a następnie dodano 200 ml wody do HPLC, następnie 500 ml chloroformu do HPLC (stosunek metanol:woda:chloroform, 5:2:5) ). Mieszaninę wirowano i odwirowano w celu uzyskania rozdzielenia faz. Supernatanty wysuszono przez wirowanie próżniowe w celu późniejszej derywatyzacji, a następnie inkubowano z 2% (wag./obj.) chlorowodorkiem metoksyaminy (226904, Sigma-Aldrich) w pirydynie przez 60 minut w temperaturze 37°C i sililowano N-metylo-N-( tert-butylodimetylosililo)trifluoroacetamid z 1% tert-butylodimetylochlorosilanem (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) przez 30 minut w temperaturze 45°C. Pochodne [13C6]glukozy analizowano za pomocą GC-HRMS, chromatografu gazowego Trace 1310 (Thermo Fisher) z kolumną DB–35MS (Agilent Technologies) i systemu Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS (Thermo Fisher). Testy metabolomiczne GC–MS/MS przeprowadzono w programie Metabo-Profile. Metabolity zidentyfikowano i oznaczono ilościowo za pomocą Xcalibur (wersja 4.1) i TraceFinder (wersja 5.1) (Thermo Fisher), włączając czas retencji, stosunek ładunku do masy fragmentów jonów i intensywność piku. Pochodne [13C16]palmitynianu i [13C5]metioniny analizowano za pomocą ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej ze spektrometrem mas z potrójnym kwadrupolem (UPLC–TQMS). Surowe dane z UPLC – TQMS analizowano przy użyciu oprogramowania Waters MassLynx (v 4.1, Waters) w celu ekstrakcji pików, integracji, identyfikacji i ilościowego oznaczenia metabolitów. Do późniejszej analizy statystycznej wykorzystano język R (wersja 4.1.1).

Model guza B16 i adoptywna immunoterapia transferowa komórek

Aby zbadać przeciwnowotworowe działanie limfocytów T in vivo, samicom myszy C57BL/6N wstrzyknięto podskórnie komórki czerniaka 0,2 x 106 B16-OVA. Dziewięć dni po wszczepieniu guza myszom wstrzyknięto dożylnie 5 x 106 komórek T pochodzących od samic myszy OT-I namnażanych przez 7 dni w różnych warunkach. Myszy z nowotworem otrzymały 5 Gy subletalnego napromieniania przed ACT. Powierzchnię guza mierzono co 2 dni i obliczano jako długość (mm) × szerokość (mm). Myszy z obszarem nowotworu zbliżającym się do 300 mm2 poddano eutanazji. Aby zbadać trwałość namnożonych limfocytów T w różnych warunkach, 4 × 106 CD45.1+ limfocytów T od samic myszy OT-I adoptywnie przeniesiono do samic myszy C57BL/6N. Tydzień później myszy uśmiercono i zliczono komórki z wyizolowanej krwi, śledziony i węzłów chłonnych. Proporcję przeniesionych komórek T określono poprzez bramkowanie komórek T wykazujących ekspresję CD45.1+ i CD45.2+ za pomocą cytometrii przepływowej.

Model myszy NCG i terapia CD19-CAR-T

Samicom myszy NCG wszczepiono podskórnie 1 × 106 komórek CD19-K562. Gdy objętość nowotworu osiągnęła 75 mm3, myszom podano 5 x 106 nietransdukowanych limfocytów T i limfocytów T CD19-CAR hodowanych w pożywce kontrolnej lub 10 mM kwas mlekowy. Wzrost guza mierzono co 2 dni za pomocą suwmiarki elektronicznej i obliczano jako długość (mm) × szerokość (mm). Myszy z obszarem guza większym niż 300 mm2 poddano eutanazji. Guzy zebrano, strawiono i poddano obróbce za pomocą Percoll (Sigma), a następnie określono funkcję limfocytów T i fenotyp za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza podstawowego zużycia tlenu i szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego

Do analizy cech metabolicznych oceniano OCR i ECAR za pomocą analizatora Seahorse XF24 (Agilent). W skrócie, ludzkie komórki T hodowane w różnych warunkach przez 12 dni traktowano wstępnie niebuforowaną pożywką XF (niebuforowana RPMI 1640 zawierająca 10 mM glukozy, 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM glutaminy). . Następnie ludzkie komórki T wysiano w ilości 0,5 x 106 komórek na studzienkę w mikropłytce do hodowli komórkowej XF24 i inkubowano w inkubatorze bez CO2 przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Aby zwiększyć przyleganie komórek, płytki wirowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 100 g przy zerowym hamowaniu. Zużycie tlenu i zakwaszenie zewnątrzkomórkowe analizowano w warunkach podstawowych oraz w odpowiedzi na 1,25 μM oligomycyny, 50 mM 2-deoksy-d-glukozy, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM rotenonu i 0,5 μM antymycyny A. SRC obliczono odejmując podstawowy OCR od maksymalnego OCR.

ChIP-qPCR

Immunoprecypitację chromatyny (ChIP) przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta dostarczonymi z zestawem do ekspresowego ścinania enzymatycznego ChIP-IT (Active Motif). W skrócie, 15 milionów ludzkich komórek T hodowanych w warunkach kontrolnych lub w warunkach 10 mM kwasu mlekowego utrwalono formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i reakcję utrwalania zatrzymano przez dodanie 1 x glicyny. Utrwalone komórki osadzono z PMSF i koktajlem hamującym białko i przechowywano w -80 stopniach przed lizą komórek. Następnie rozmrożony osad ponownie zawieszono w 1 ml lodowatego buforu do lizy z PMSF i koktajlem hamującym białko na lodzie przez 30 minut w celu uzyskania materiału jądrowego. Następnie osad jądrowy ponownie zawieszono i trawiono koktajlem enzymatycznym w celu ścinania chromatyny przez 15 minut w temperaturze 37 stopni. Ściętą chromatynę inkubowano z kulkami magnetycznymi białka G z anty-c-MYC (CST, nr kat. 18583, 1:100 dla ChIP) i anty-IgG (CST, nr kat. 2729, 1:100 dla ChIP) w temperaturze W nocy 4 stopnie. Następnie kulki magnetyczne przemyto czterokrotnie buforami ChIP i eluowano 50 ul buforu do elucji. Eluowany DNA poddano odwrotnemu usieciowaniu przez 2,5 godziny w temperaturze 65 stopni, a następnie oczyszczono metodą ekstrakcji fenolem-chloroformem. Oczyszczone DNA wykorzystano do przeprowadzenia ChIP-qPCR w celu wykrycia wzbogacenia MYC w promotory genów docelowych. Startery stosowane w ChIP – qPCR można znaleźć w tabeli uzupełniającej 2.

Analiza masy mitochondrialnej i potencjału błonowego

Masę mitochondriów i potencjał błonowy analizowano za pomocą MitoTracker Green i estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM). Komórki barwiono 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) lub 50 nM TMRM (Thermo Fisher) w inkubatorze w temperaturze 37 stopni (5% CO2) przez 1 godzinę przed barwieniem powierzchni komórek. Komórki przemywano trzykrotnie buforem FACS, a następnie barwiono markerami powierzchniowymi w celu dalszej analizy FACS.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 8.0. Wyniki przedstawiono jako średnią ± sem. Do porównania leczenia z grupami kontrolnymi zastosowano dwustronny test t-Studenta. Do porównań wielokrotnych zastosowano dwuczynnikową ANOVA z testem Sidaka Tukeya lub testem wielokrotnych porównań Dunnetta. Za statystycznie istotny uznano P < 0,05.

Bibliografia

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. i Bonini, C. T pamięciowe komórki macierzyste w zdrowiu i chorobie. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. i in. Komórki T pamięci podobne do komórek macierzystych: perspektywa z ciemnej strony. Immunol komórkowy. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA i Restifo, NP Adopcyjny transfer komórek jako spersonalizowana immunoterapia raka u ludzi. Nauka 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. i Wolchok, JD Immunoterapia nowotworów z wykorzystaniem blokady punktów kontrolnych. Nauka 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK i Youngblood, BA Stany macierzyste, efektorowe i hybrydowe komórek T pamięci CD8+. Trendy Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. i in. Dwa podzbiory progenitorów komórek T pamięci CD8+ przypominających łodygę, z odrębnymi zobowiązaniami dotyczącymi losu u ludzi. Nat. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. i in. Podzbiór ludzkich komórek T pamięci o właściwościach podobnych do komórek macierzystych. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR i Ho, PC Metaboliczna i epigenetyczna regulacja wyczerpania komórek T. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM i Cui, W. Transkrypcyjna kontrola różnicowania limfocytów T efektorowych i pamięciowych CD8+. Nat. Ks. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. i in. Pierwotne różnicowanie specyficznych dla nowotworu komórek T pamięci CD8+ jako odpowiadających w dobrej wierze na blokadę PD-1/PD-L1 w drenujących węzłach chłonnych. Komórka 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. i in. Wewnątrznowotworowe limfocyty T Tcf1+ PD-1+ CD8+ o właściwościach przypominających łodygę wspomagają kontrolę nowotworu w odpowiedzi na szczepienie i immunoterapię blokującą punkty kontrolne. Immunitet 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. i in. Zasadnicza rola efektora szlaku Wnt Tcf-1 w tworzeniu funkcjonalnej pamięci komórek T CD8. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. i Restifo, NP Epigenetyczna kontrola różnicowania komórek T CD8+. Nat. Ks. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG i in. Powiązanie linii podzbiorów komórek T CD8+ ujawniają się w postępujących zmianach w krajobrazie epigenetycznym. Komórka Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. i in. Krajobrazy epigenetyczne ujawniają czynniki transkrypcyjne regulujące różnicowanie limfocytów T CD8+. Nat. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. i in. Analiza metylacji histonów obejmująca cały genom ujawnia opartą na stanie chromatyny regulację transkrypcji genów i funkcji komórek T pamięci CD8+. Immunitet 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. i Ho, PC Programy metaboliczne dostosowują odporność limfocytów T w przypadku infekcji wirusowych, raka i starzenia. Metab.komórka. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT i in. Konstytutywny metabolizm glikolityczny wspiera różnicowanie pamięci efektorowej komórek T CD8+ podczas infekcji wirusowej. Immunitet 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV i in. Kontrola receptora antygenowego metabolizmu metioniny w komórkach T. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. i in. Limfocyty T pamięci CD8+ wykorzystują wewnątrzkomórkową lipolizę do wspomagania programowania metabolicznego niezbędnego do rozwoju. Immunitet 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL i in. Zwiększanie pamięci komórek T CD8 poprzez modulowanie metabolizmu kwasów tłuszczowych. Natura 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ i in. Mitochondrialna zdolność oddechowa jest krytycznym regulatorem rozwoju pamięci limfocytów T CD8+. Immunitet 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. i Pedersen, SF Kwaśne mikrośrodowisko nowotworu jako czynnik wywołujący raka. Annu. Ks. Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS i Schumacher, Dysfunkcja komórek T TN w chorobie nowotworowej. Komórka nowotworowa 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE i in. Mikrośrodowisko nowotworu hamuje biogenezę mitochondriów komórek T, powodując niewydolność i dysfunkcję metaboliczną wewnątrznowotworowych komórek T. Immunitet 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR i in. Zaburzona dynamika mitochondriów w CD8+ TIL wzmacnia wyczerpanie komórek T. Nat. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH i in. Konkurencja metaboliczna w mikrośrodowisku nowotworu jest czynnikiem powodującym progresję nowotworu. Komórka 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE i in. Stres mitochondrialny wywołany ciągłą stymulacją w warunkach niedotlenienia szybko powoduje wyczerpanie komórek T. Nat. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS i in. Nisza wewnątrzguzowa utrzymuje i różnicuje komórki T CD8 podobne do łodygi. Natura 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ i in. Definiowanie limfocytów T CD8+, które zapewniają wybuch proliferacyjny po terapii PD-1. Natura 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. i in. Mleczan reguluje obwody metaboliczne i prozapalne kontrolując migrację komórek T i funkcje efektorowe. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. i in. Komórki T wytwarzają nisze kwasowe w węzłach chłonnych, aby tłumić własne funkcje efektorowe. Nat. komuna. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. i in. Modulacja kwasowości mikrośrodowiska odwraca anergię w ludzkich i mysich limfocytach T naciekających nowotwór. Rak Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfried, E. i in. Kwas mlekowy pochodzący z nowotworu moduluje aktywację komórek dendrytycznych i ekspresję antygenu. Krew 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio OR i in. Funkcjonalna polaryzacja makrofagów związanych z nowotworem przez kwas mlekowy pochodzący z nowotworu. Natura 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. i in. Kwasica zewnątrzkomórkowa i hamowanie mTOR napędzają różnicowanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. i in. Hamowanie metabolizmu glikolitycznego poprawia pamięć limfocytów T CD8+ i działanie przeciwnowotworowe. J. Clin. Inwestować. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. i in. Modulacja sygnalizacji mTOR wyzwala tworzenie komórek T pamięci przypominających komórki macierzyste. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN i in. mTORC1 i mTORC2 selektywnie regulują różnicowanie limfocytów T CD8+. J. Clin. Inwestować. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. i in. Ssaczy cel kompleksu rapamycyny 2 kontroluje różnicowanie pamięci komórek T CD8 w sposób zależny od Foxo1-. Cell Rep. 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. i Huang, S. Rola sygnalizacji mTOR w ruchliwości, inwazji i przerzutach komórek nowotworowych. Aktualny Pept białkowy Nauka. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ i in. SCENITH: oparta na cytometrii przepływowej metoda funkcjonalnego profilowania metabolizmu energetycznego z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metab.komórka. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. i in. Biogeneza mitochondriów i przebudowa proteomów promują metabolizm jednowęglowy w celu aktywacji komórek T. Metab.komórka. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC i Zhang, L. Tankowanie odporności przeciwnowotworowej komórek T: ponowne spojrzenie na metabolizm aminokwasów. Immunol na raka. Rozdzielczość 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradov, B. i in. Wczesna transkrypcyjna i epigenetyczna regulacja różnicowania limfocytów T CD8+ ujawniona przez sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. Nat. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. i Zou, W. Aminokwasy i ich transportery w odporności limfocytów T i terapii nowotworów. Mol. Komórka 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ i Cantrell, DA Ilościowa analiza tego, jak Myc kontroluje proteomy komórek T i szlaki metaboliczne podczas aktywacji komórek T. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. i in. Potencjał błony mitochondrialnej identyfikuje komórki o zwiększonej łodygi na potrzeby terapii komórkowej. Metab.komórka. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. i in. IL15 zwiększa aktywność przeciwnowotworową komórek CAR-T poprzez zmniejszenie aktywności mTORC1 i zachowanie fenotypu pamięci ich komórek macierzystych. Immunol na raka. Rozdzielczość 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD i in. Dynamika mitochondriów kontroluje los komórek T poprzez programowanie metaboliczne. Komórka 166, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. i in. Limfocyty T CD8 podobne do macierzystych pośredniczą w odpowiedzi na adoptywną immunoterapię komórkową przeciwko ludzkiemu nowotworowi. Nauka 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML i in. Hierarchie dominacji antygenów kształtują fenotypy progenitorowych komórek T CD8 TCF1+ w nowotworach. Komórka 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. i in. Metaboliczne przeprogramowanie terminalnie wyczerpanych limfocytów T CD8+ przez IL-10 zwiększa odporność przeciwnowotworową. Nat. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI i in. Kondycjonowanie metaboliczne komórek T efektorowych CD8+ do adaptacyjnej terapii komórkowej. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. i Yamashita, M. Glutamina reguluje aktywność przeciwnowotworową limfocytów T CD8. Gan Do Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK i in. Pień i dysfunkcja limfocytów T w nowotworach są wywoływane przez wspólny mechanizm. Nauka 363, eau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. i in. Stronnicza aktywacja ludzkich limfocytów T z powodu niskiego zewnątrzkomórkowego pH jest antagonizowana przez kostymulację B7/CD28. EUR. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. i in. Nagromadzenie mleczanu w miejscu przewlekłego stanu zapalnego sprzyja chorobie poprzez indukowanie przebudowy metabolicznej komórek T CD4+. Metab.komórka. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. i in. Mleczan zwiększa łodygę limfocytów T CD8+, zwiększając odporność przeciwnowotworową. Nat. komuna. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG i in. Metabolizm metioniny kształtuje odpowiedzi komórek pomocniczych T poprzez regulację przeprogramowania epigenetycznego. Metab.komórka. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. i Romero, P. Metaboliczna kontrola decyzji dotyczących losu komórek T CD8+ i odporności przeciwnowotworowej. Trendy Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP i Gajewski, TF Niedobór glukozy hamuje wiele kluczowych zdarzeń związanych z ekspresją genów i funkcjami efektorowymi w limfocytach T CD8+. EUR. J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. i in. Limfocyty T pamięci CD8+ wykorzystują wewnątrzkomórkową lipolizę do wspomagania programowania metabolicznego niezbędnego do rozwoju. Immunitet 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. i in. Utlenianie kwasów tłuszczowych kontroluje przeżycie komórek T pamięci CD8+ w gruczolakoraku żołądka. Immunol na raka. Rez. 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. i in. Działanie etomoksiru na limfocyty T regulatorowe i pamięciowe jest niezależne od utleniania kwasów tłuszczowych za pośrednictwem Cpt1a. Metab.komórka. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. i Rando, OJ Metabolic wkłady do epigenomu. Metab.komórka. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA i in. S-2-hydroksyglutaran reguluje los limfocytów T CD8+. Natura 540, 236–241 (2016).

68. Zhang, H. i in. Beta-hydroksymaślan wytwarzany w wyniku ketogenezy jest epigenetycznym regulatorem rozwoju pamięci komórek T CD8+. Nat. Biol Komórkowy. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. i in. Rak SLC43A2 zmienia metabolizm metioniny w komórkach T i metylację histonów. Natura 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. i in. Kontrola translacyjna c-MYC przez rapamycynę promuje końcowe różnicowanie szpiku. Krew 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. i Weidinger, C. Metaboliczna kontrola epigenetyki i jej rola w różnicowaniu i funkcjonowaniu komórek T CD8+. Przód. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. i in. Jonowa supresja immunologiczna w mikrośrodowisku guza ogranicza funkcję efektorową komórek T. Natura 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. i in. Złożone składniki cBAF i MYC współpracują na wczesnym etapie losu limfocytów T CD8+. Natura 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM i Chi, H. Metaboliczna kontrola wytwarzania i łodygi komórek T pamięci. Harb zimnej wiosny. Perspektywa. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS i in. CUT&Tag do wydajnego profilowania epigenomicznego małych próbek i pojedynczych komórek. Nat. komuna. 10.1930 (2019).

76. Jin, H. i in. ChIPseqSpikeInFree: podejście do normalizacji ChIP – seq umożliwiające ujawnienie globalnych zmian w modyfikacjach histonów bez domieszki. Bioinformatyka 36, ​​1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Ekstrakcja metabolitów z komórek ssaków hodowanych w zawiesinie w celu globalnego profilowania metabolitów. Nat. Protokół. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. i in. Katabolizm aminokwasów reguluje proteostazę krwiotwórczych komórek macierzystych poprzez oś GCN2 – eIF2. Komórka macierzysta 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. i in. Mitochondrialny nośnik pirogronianu reguluje różnicowanie komórek T pamięci i działanie przeciwnowotworowe. Metab.komórka. 34, 731–746 (2022).