Ferrystatyna II skutecznie hamuje replikację SARS-CoV-2 w komórkach Vero

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakcyjny

Koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) nadal ma znaczący wpływ na zdrowie publiczne na świecie. Opisano wiele mechanizmów wejścia do komórki SARS-CoV-2; jednak niewiele uwagi poświęcono roli receptora transferyny 1 (TfR1) w zakażeniu SARS-CoV-2. Użyliśmy ferrytyny II do wywołania degradacji TfR1 na powierzchni komórek Vero i zbadania konsekwencji takiego traktowania na żywotność komórek i replikację SARS-CoV-2. Wykazaliśmy, że ferrytyna II jest nietoksyczna dla komórek Vero w stężeniach do 400 µM. Zgodnie z danymi z mikroskopii konfokalnej, na rozkład znakowanej transferyny i domeny wiążącej receptor (RBD) białka Spike znacząco wpływa 18-godzinne wstępne traktowanie 100 µM ferrytyny II w pożywce hodowlanej. Wychwyt białka RBD jest prawie całkowicie hamowany przez traktowanie ferrytyną II, chociaż białko to pozostaje związane na powierzchni komórki. Odkrycia zostały dobrze potwierdzone przez znaczące hamowanie infekcji SARS-CoV-2 komórek Vero przez ferrytynę II z wartościami IC50 wynoszącymi 27 µM (dla wirusa Wuhan D614G) i 40 µM (dla wirusa Delta). Znaczące zmniejszenie miana zakaźnego wariantu Omicron SARS-CoV-2 odnotowano przy stężeniu ferrytyny II tak niskim, jak 6,25 µM. Stawiamy hipotezę, że ferrytyna II blokuje wejście do komórki gospodarza SARS-CoV-2, w którym pośredniczy TfR1-; jednak potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić pełne mechanizmy hamowania tego wirusa, w tym wpływ ferrytyny II na inne receptory SARS-CoV-2, takie jak ACE2, Neuropilin-1 i CD147. Hamowanie wnikania wirusa poprzez celowanie w receptor na komórkach gospodarza, a nie w białko podatne na mutacje wirusa, jest obiecującą strategią terapeutyczną wobec COVID-19.

Słowa kluczowe: SARS-CoV-2;receptor transferyny 1; ferrytyna II; domena wiążąca receptor (RBD); Komórki Vero

Alexey Sokolov , Irina Isakova-Sivak * , Natalia Grudinina , Daria Mezhenskaya , Elena Litasova , Valeria Kostevich , Ekaterina Stepanova , Alexandra Rak , Ivan Sychev , Olga Kirik i Larisa Rudenko

Instytut Medycyny Doświadczalnej, 197376 Sankt Petersburg, Rosja

1. Wstęp

Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) spowodowana koronawirusem 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2) nadal stanowi znaczne obciążenie społeczno-ekonomiczne dla światowej populacji. Enzym konwertujący angiotensynę 2 (ACE2) jest uważany za główny receptor komórki gospodarza, który SARS-CoV-2 wykorzystuje do wchodzenia do komórek [1–4]; jednak zidentyfikowano kilka alternatywnych receptorów i koreceptorów zdolnych do ułatwiania wnikania do komórek SARS-CoV-2 i zakaźności, takich jak Neuropilin-1, CD147, receptor kinazy tyrozynowo-białkowej UFO (AXL) i inne [5–10]. Ponadto, do skutecznego wejścia SARS-CoV-2 do komórek po zaangażowaniu receptora komórki gospodarza przez wirusowe białko wypustek (S) wymagane są dwa etapy cięcia proteolitycznego. Pierwszy etap obejmuje cięcie granicy S1–S2 przez proteazę furyny w zakażonej komórce, podczas gdy cięcie miejsca S20 jest zależne od proteaz komórek docelowych, takich jak TMPRSS2 i katepsyna L, które aktywują białka S na błonie komórkowej i w odpowiednio endolizosom (przegląd w [11]).

cistanche na sprzedażdlazdolność odpornościowa

Oprócz dobrze zbadanych celów wejścia do komórki gospodarza SARS-CoV-2, istnieją dowody, że receptor transferyny 1 (TfR1) może być alternatywnym koreceptorem dla wejścia SARS-CoV-2 [12]. TfR1, 95 kDa homodimeryczna glikoproteina błonowa typu II, ulega obfitej ekspresji na błonie komórkowej większości komórek ludzkich i pośredniczy we wnikaniu transferyny (Tf) do komórek w celu dostarczania żelaza [13]. Rzeczywiście, istnieje szeroka gama ludzkich i odzwierzęcych wirusów, które mogą atakować komórki gospodarza poprzez interakcję z TfR1 i innymi czynnikami w szlaku wychwytu żelaza, w tym arenawirusy Nowego Świata, ludzki wirus niedoboru odporności, parwowirusy, wirus zapalenia wątroby typu C, alfawirusy i inne. [14]. Dlatego ukierunkowanie na szlak wejścia wirusa, w którym pośredniczy TfR1-, stanowi obiecującą strategię terapeutyczną dla zakażenia SARS-CoV-2. Wczesne badania przesiewowe zidentyfikowały dwa związki o małych rozmiarach (NCI11079 i NCI306711), które miały znaczący wpływ hamujący na wychwyt żelaza za pośrednictwem Tf przez komórki HeLa. Związek NCI306711 celuje w TfR1 poprzez indukowanie jego internalizacji i degradacji i został nazwany „ferrytyna” ze względu na jego niezwykłą właściwość hamowania transportu żelaza przez szlak zależny od cholesterolu [15]. Inna mała cząsteczka, ferrytyna II (NSC8679), działa w sposób podobny do ferrytyny i degraduje TfR1 poprzez wrażliwy na nystatynę szlak raftów lipidowych [16]. W świetle tych danych podjęliśmy próbę oceny zdolności ferrytyny II do hamowania replikacji SARS-CoV-2 w komórkach Vero-CCL81 i zbadania potencjalnych mechanizmów tego hamowania.

2. Materiały i metody

2.1. Wirusy, białka i związki chemiczne

SARS-CoV-2 izoluje hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (linia Wuhan D614G), hCoV-19 /Russia/SPE-RII-32759V/2021 (linia Delta) i hCoV-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (linia Omicron) uzyskano z Instytutu Badawczego Smorodintseva Grypa (Sankt Petersburg, Rosja). Wszystkie prace z wirusami zakaźnymi przeprowadzono w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3). Rekombinowane białko odpowiadające domenie wiążącej receptor (RBD) białka S SARS-CoV-2 było wyrażane w komórkach eukariotycznych przez BIOCAD JSC (St.Petersburg, Rosja). TF z ludzkiej surowicy nasycony żelazem (Fe2-TF) wyizolowano z ludzkiej surowicy krwi metodą chromatografii jonowymiennej na DEAE-Toyopearl, UNOsphere S i filtracji żelowej na Sephadex G-75 Superfine, jak opisano wcześniej [17]. Ferrystatyna II (Rysunek 1) została zakupiona w firmie Sigma (C-1144, St. Louis, MO, USA). Związek rozcieńczono w 150 mM NaCl, 10 mM buforze Na-fosforanowym, pH 7,4 (PBS) do końcowego stężenia 4 mm, a roztwór przesączono przez sterylną membranę o wielkości porów 0,22 µm (Sartorius, Niemcy) .

2.2. Rozmnażanie wirusa SARS-CoV-2 i ocena zdolności hamowania wirusa feristatyny II

Wirusy namnażano na komórkach Vero CCL81 przy użyciu DMEM uzupełnionego 1x antybiotykiem przeciwgrzybiczym, 10 mM HEPES i 2 procentami FBS (wszystkie z Capricorn, Ebsdorfergrund, Niemcy) (DMEM/2 procent FBS). Miana zakaźne określano w teście 50% dawki zakażenia hodowli tkankowej (TCID50), jak opisano w [18] i wyrażano w lgTCID50/ml.

Do oceny zdolności neutralizacji wirusa ferrytyny zastosowano zmodyfikowany test mikroneutralizacji. Dzień przed eksperymentami komórki Vero wysiano na {{0}}płytkach hodowlanych z dołkami (3 x 104 komórek na dołek) w DMEM uzupełnionym 1x antybiotykiem przeciwgrzybiczym i 10% FBS. Następnego dnia pożywkę usunięto, a komórki zakażono 100 TCID50 SARS-CoV-2 przygotowanym na DMEM/2 procent FBS przez 2 godziny w 37°C, 5% CO2. Kilka studzienek pozostało niezakażonych jako kontrola negatywna. Następnie inokulum usunięto i komórki przykryto 150 µl dwukrotnych rozcieńczeń ferrytyny II przygotowanych na DMEM/2% FBS, podczas gdy studzienki z kontrolą negatywną i pozytywną przykryto tylko pożywką. Każde rozcieńczenie ferrytyny II oceniano w trzech powtórzeniach. Płytki inkubowano przez 48 godzin (dla wirusa Wuhan G614D) lub 72 godziny (dla wirusów Delta i Omicron) w 37°C, 5% CO2, aż do zaobserwowania wyraźnego efektu cytopatycznego w studzienkach kontroli pozytywnej. Supernatanty ostrożnie zebrano do 0,2 mL probówek do ilościowego oznaczenia miana wirusa i komórki utrwalono 10% formaldehydem w 4°C przez 24 godziny.

Utrwalone płytki przeniesiono do laboratorium BSL{{0}} w celu przeprowadzenia procedury ELISA opartej na komórkach. Obejmowało to płukanie PBST (PBS z 00,05% Tween 20), permeabilizację komórek 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 15 minut, blokowanie 3% odtłuszczonym mlekiem w 37 ◦C przez 1 h i intensywne mycie PBST. Następnie dodano oczyszczone poliklonalne królicze przeciwciało anty-RBD (BIOCAD JSC, Sankt Petersburg, Rosja) w stężeniu 1,5 µg/ml przez 1 h, po czym przemyto PBST i dodano drugorzędowe anty-królicze anty-IgG HRP- skoniugowane przeciwciało (BioRad, Hercules, CA, USA) przez 1 godz. w 37°C. Płytki wywoływano stosując 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Reakcję zatrzymano 1M roztworem H2SO4 i wyniki odczytano przy 450 nm przy użyciu spektrofotometru xMark Microplate Spectrophotometer (BioRad, Hercules, CA, USA). Do obliczenia miana IC50 zastosowano czteroparametryczną analizę regresji nieliniowej, opartą na wartościach OD450 komórek wiruso-ujemnych i wiruso-dodatnich, jak opisano w [18].

gdzie kupić cistanche

Miana SARS-CoV-2 w supernatantach komórkowych obliczono metodą ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym. RNA oczyszczono ze 100 µl pożywki do hodowli komórkowej, jak również z SARS-CoV-2 o znanych mianach do generowania krzywych standardowych testu. Próbki RNA oczyszczono zestawem do ekstrakcji RNA (Biolabmix, Nowosybirsk, Rosja) zgodnie z protokołem producenta. Reakcję RT-PCR przeprowadzono w dwóch powtórzeniach ze starterem wyprzedzającym 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 i starterem wstecznym 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] przy użyciu jednoprobówki RT-PCR SYBR (Evrogen, Moskwa, Rosja) na Quantstudio 1 Real-Time PCR System (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, USA), z dodatkiem 50x Rox jako barwnika referencyjnego.

Cykl progowy (Ct) obliczono dla każdej próbki za pomocą oprogramowania QuantStudio Design and Analysis Software v1.5.1, a krzywą standardową wygenerowano na każdej płytce reakcyjnej. Miano wirusa w każdej studzience obliczono stosując wartości Ct znormalizowane do krzywych standardowych obliczonych na podstawie standardowego miareczkowania wirusa i wyrażonych w lgTCID50/ml. Aby określić, czy ferrytyna II może hamować początkowe etapy przyczepiania się wirusa do komórek, 100 TCID50 SARS-CoV-2 zmieszano z rozcieńczeniami ferrytyny II i po 1h inkubacji w 37◦C, tę mieszaninę dodano do Vero komórek, a następnie inkubacja przez 1 godzinę w 37°C. Po wchłonięciu wirusa, inokulum usunięto, a komórki przykryto 150 µl świeżej pożywki DMEM/2% FBS. Po 48 godzinach inkubacji w 37°C, 5% CO2 i widocznym CPE w komórkach kontroli pozytywnej, płytki utrwalono i poddano testowi ELISA opartemu na komórkach, jak opisano powyżej.

2.3. Ocena działania cytotoksycznego feristatyny II

Cytotoksyczność ferrytyny II dla komórek Vero została oceniona za pomocą {{0}}(4,5-dimetylotiazol- 2-ilu)-2,5-bromku difenylotetrazoliowego ( test redukcji MTT) [20]. Dwukrotne rozcieńczenia ferrytyny II przygotowano w pożywce DMEM/2% FBS, zaczynając od stężenia 400 µM i dodano do dołków płytek 96-dołkowych z monowarstwami komórek Vero. Po 48 godzinach inkubacji pożywkę usunięto i komórki delikatnie przemyto ciepłym PBS. Do każdego dołka dodano 0,5 mg/ml odczynnika MTT w objętości 100 µl i płytkę dalej inkubowano w 37°C przez 2 godz. Następnie odczynnik usunięto i komórki przemyto PBS i osuszono na powietrzu, po czym dodano 100 µl 96% etanolu w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Intensywność koloru rejestrowano za pomocą spektrofotometru przy długości fali 535 nm. Studzienki płytki niezasiane komórkami Vero zastosowano jako kontrole negatywne. 50% zahamowanie żywotności komórek (CC50) obliczono za pomocą czteroparametrycznej analizy regresji nieliniowej przy użyciu oprogramowania GraphPad Prizm.

2.4. Znakowanie transferyny surowicy ludzkiej i rekombinowanego białka RBD

Reakcję znakowania prowadzono w temperaturze plus 4◦C przez 12 h przez dodanie 5 mM roztworu estru NHS 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) w dimetylosulfotlenku do 30 µM roztworów Fe2-TF lub RBD w 200 mM NaHCO3, zachowując stosunek 5-TAMRA:białko=8:1 (mol/mol). Po usunięciu nadmiaru barwnika stopień znakowania oszacowano stosunkiem A541 i A280, który wynosił odpowiednio 3,5 i 3,2 mola TAMRA na mol Fe2-TF i RBD

2.5.Badanie wpływu feristatyny II na wychwyt TF i RBD przez komórki Vero

Komórki Vero hodowano przez 18 godzin w DMEM/2 procent FBS bez ferrytyny II iz dodatkiem 100 uM ferrytyny II ze szkiełkami nakrywkowymi do mikroskopii umieszczonymi uprzednio na dnie płytek hodowlanych. Następnie pożywkę zastąpiono na 15 godzin pożywką bez FBS zawierającą 1,2 μM Fe2-TF-TAMRA （0,25 mg/ml） lub 1,2 μM RBD-TAMRA (0,1 mg/ml). Po inkubacji komórki delikatnie płukano dwukrotnie PBS, utrwalano 4% paraformaldehydem (w/) w PBS przez 10 min, płukano dwukrotnie PBS przez 30 min. Następnie jądra komórek barwiono 360nM DAPI przez 5 min, przemywano PBS i szkiełkami nakrywkowymi i umieszczano na szkiełkach przy użyciu żywicy polimeryzacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej (DAKO, Glostrup, Dania). Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss, Jena, Niemcy), z obiektywem Plan-Apochromat 63×/1,40 Oil DIC M27. Do wzbudzenia fluorescencji TAMRA zastosowano laser A561 nm, { Do rejestracji fluorescencji użyto filtra {28}} nm, do wzbudzenia DAPI użyto lasera 405 nm. a do rejestracji fluorescencji zastosowano filtr 400-570 nm. Obrazy pozyskiwano i przetwarzano przy użyciu oprogramowania dostarczonego z mikroskopem.

3. Wyniki

Użyliśmy dwóch antygenowo odległych szczepów SARS-CoV-2, aby ocenić zdolność ferrytyny II do hamowania replikacji wirusa w komórkach Vero. W pierwszym etapie ocenialiśmy inhibicję wirusa przy stałej obecności związku w pożywce hodowlanej. Wykrycie antygenu wirusowego w komórkowym teście ELISA wykazało, że wartości IC50 dla ferrytyny II wynosiły 26,5 i 40,4 µM odpowiednio dla wirusów Wuhan D614G i Delta (Figura 2A). Oznaczenie ilościowe mian wirusa w pożywce hodowlanej potwierdziło, że uwalnianie wirusa z zakażonych komórek do pożywki hodowlanej było hamowane przez ferrytynę II, począwszy od stężenia 25 µM, a wartości IC50 obliczone ze zmniejszenia miana TCID50 wynosiły 24,0 i 25,2 µM odpowiednio dla wirusów Wuhan D614G i Delta. Ponadto, gdy związek został dodany w stężeniu 100 µM, nie wystąpiła replikacja wirusa w komórkach Vero (Figura 2B).

cistanche i tongkat ali

Ze względu na znaczące różnice w białkach RBD wariantów Wuhan D614G i Omicron SARS-CoV-2, tych ostatnich nie można było wykryć w komórkowym teście ELISA przy użyciu dostępnego przeciwciała anty-RBD, ponieważ RBD oryginalnego szczepu SARS-CoV-2. Niemniej jednak, zmniejszenie miana wirusa zakaźnego w obecności ferrytyny II było jeszcze bardziej wyraźne w wariancie Omicron w porównaniu z pozostałymi dwoma szczepami SARS-CoV-2: dziesięciokrotny spadek miana wirusa odnotowano przy ferrytynie II stężenie tak niskie, jak 6,25 µM, bez replikacji wirusa występującej przy stężeniach 50 µM i wyższych (Figura 3). Należy zauważyć, że to hamowanie SARS-CoV-2 wystąpiło tylko wtedy, gdy ferrytyna II była stale obecna w pożywce hodowlanej, podczas gdy tego efektu nie zaobserwowano, gdy komórki były wstępnie traktowane związkiem lub gdy wirus/ferrytyna Mieszaninę II zastosowano w etapie adsorpcji, a następnie inkubowano bez substancji (dane nie pokazane).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 odpowiednio dla szczepów Wuhan D614G, Delta i Omicron SARS-CoV-2.

Aby zbadać możliwe mechanizmy hamowania SARS-CoV-2 przez ferrytynę II, zbadaliśmy wpływ tej substancji na wnikanie wirusa za pomocą zastępczego testu wychwytu RBD. W ten sposób ustaliliśmy, jak 100 µM nietoksyczne stężenie ferrytyny II może wpływać na wychwyt RBD znakowanych tetrametylorodaminą (TAMRA) przez komórki Vero. Wiadomo, że TfR1, cel działania ferrytyny II, pośredniczy w wejściu Tf; dlatego jako kontrolę pozytywną zastosowano TF znakowany TAMRA. Hodowanie komórek Vero w obecności 100 µM ferrytyny II przez 18 godzin bez dodawania znakowanych białek nie miało znaczącego wpływu na morfologię jąder komórkowych (Figura 5, górny panel (Próba)), pośrednio wskazując na brak martwicy komórek i apoptozy. Inkubacja komórek z TF-TAMRA bez traktowania ferrytyną II skutkowała gromadzeniem się znakowanych białek wewnątrz komórek, bez wpływu na region jądra wybarwiony DAPI (lewa środkowa triada obrazów (TF-TAMRA) na Figurze 5). Traktowanie komórek 100 µM ferrytyny II skutkowało znacznym zmniejszeniem włączenia znakowanego TF (prawa środkowa triada obrazów (TF-TAMRA) na Figurze 5). Inkubacja komórek z RBD-TAMRA bez traktowania ferrytyną II, jak w przypadku znakowanego TF, skutkowała akumulacją znakowanych białek w cytoplazmie komórki, bez wpływu na region jądrowy (triada dolna lewa (RBD-TAMRA) na rycinie 5). ). Gdy komórki potraktowano 100 µM ferrytyny II, nastąpiła redystrybucja sygnału TAMRA. Zamiast wbudowywać znakowane RBD do komórek, sygnał TAMRA był rozprowadzany równomiernie na powierzchni komórki, przy czym tylko niewielka część klastrów tworzących znacznik częściowo zachodziła na barwienie jąder DAPI, co wskazuje na lokalizację znacznika TAMRA na powierzchni (na dole prawa triada (RBD-TAMRA) na rysunku 5). Wyniki pokazane na Figurze 5 wskazują, że traktowanie komórek Vero 100 µM ferrytyny II wpływa na włączenie znakowanej RBD do komórek. Biorąc pod uwagę, że obecnie nie są dostępne żadne dane dotyczące wpływu ferrytyny II na receptor ACE2, nie można wykluczyć, że obserwowany efekt jest spowodowany wiązaniem znakowanych RBD z powierzchnią komórki, ale brak TfR1 na komórkach uniemożliwia wbudowanie RBD w komórkach traktowanych ferrytyną II.

4. Dyskusja

SARS-CoV-2 wykorzystuje wiele mechanizmów do atakowania komórek gospodarza i wywoływania skutecznej infekcji wirusowej, a szeroki zakres inhibitorów wnikania do komórek gospodarza jest obecnie oceniany jako strategie terapeutyczne na COVID-19 [21]. W bieżącym badaniu przedstawiamy wstępne wyniki hamowania replikacji SARS-CoV-2 in vitro przez traktowanie komórek docelowych ferrytyną II, małą cząsteczką, która może selektywnie degradować receptor transferyny 1. Transferyna nasycona żelazem (Fe2-Tf lub holo-Tf) posiada wysokie powinowactwo do swoich receptorów, które jest wyrażane na powierzchni większości ludzkich komórek i jest internalizowane w kompleksie z holo-Tf przez endocytozę za pośrednictwem receptora. Tworzenie kompleksów między żelazem i Tf, jak również między holo-Tf i TfR jest zależne od pH i zapewnia uwalnianie żelaza z Tf i Tf z TfR w kwaśnym środowisku endosomu. Recykling endosomu powoduje powrót TfR do błony plazmatycznej i uwolnienie postaci apo Tf w kolejnej rundzie dostarczania żelaza do komórki. Wychwyt żelaza przez komórki ssaków jest ważnym procesem regulacji wzrostu komórek rakowych, które nie posiadają środków farmakologicznych o znanych mechanizmach działania. Badanie przesiewowe 2000 małych związków z biblioteki Diversity Set National Cancer Institute zidentyfikowało 10 inhibitorów transportu żelaza o wartościach IC50 w zakresie od 5 do 30 µM [22]. Ferrystatyna II była stosowana jako bloker TfR1 w badaniach infekcji komórek przez TfR1 wirusem zapalenia wątroby typu C [23,24], zakaźnym wirusem zapalenia żołądka i jelit [25] i reowirusem [26] (tabela 1). Należy zauważyć, że doświadczenia dotyczące degradacji TfR1 za pomocą ferrytyny II są prawie zawsze przeprowadzane w stałej obecności substancji w pożywce.

W podobnej konfiguracji testu stwierdziliśmy, że ferrytyna II była praktycznie nietoksyczna dla komórek Vero podczas 48-godzinnej ekspozycji na stężenie 400 µM. To stężenie jest wystarczające do całkowitej degradacji TfR1 na powierzchni hodowanych komórek [16]. Z jednej strony, efekt ten został potwierdzony przez zmniejszone pobieranie znakowanego Fe2-Tf przez komórki Vero traktowane wstępnie 100 µM ferrytyny II przez 18 godzin. W tym przypadku niecałkowite blokowanie wychwytu znakowanej Tf można wyjaśnić brakiem ferrytyny II w momencie dodawania znakowanych białek. Z drugiej strony, traktowanie komórek Vero przez ferrytynę II radykalnie zmieniło pobieranie RBD białek Spike. W tym wstępnym badaniu nie ocenialiśmy poziomu ekspresji innych receptorów SARS-CoV-2 pod wpływem leczenia ferrytyną II i nie indukowaliśmy nokautu tych znanych receptorów, aby udowodnić niezależną rolę TfR w pośredniczeniu w SARS - Wpis do komórki CoV-2, który jest obszarem naszych dalszych badań.

Niemniej jednak stosunkowo jednolite wiązanie RBD z powierzchnią komórek traktowanych ferrytyną II może wskazywać, że niektóre receptory SARS-CoV-2 na komórkach Vero pozostają funkcjonalne i wiążą wirusa, ale przy braku TfR1 wirus nie może dostać się do komórki. Ten receptor jest najprawdopodobniej ACE2 od Prabhakara et al. wykazali wzrost wychwytu znakowanej RBD wraz ze znakowaną transferyną przez komórki z nadekspresją ACE2, co sugeruje, że ACE2 promuje wychwyt RBD poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny, która jest wykorzystywana przez TfR1 [28]. Ponadto istnieją dowody na to, że SARS-CoV-2 może infekować komórki ACE2-ujemne przy użyciu alternatywnych ścieżek wejścia [29]; dlatego głębsza analiza działania ferrytyny II na różne typy komórek pozwala na zakażenie SARS-CoV-2 rzuci światło na rolę TfR1 w cyklu życiowym wirusa. Aby zrozumieć, jak obiecująca jest ta substancja w przyszłej terapii infekcji SARS-CoV-2, ważne jest, aby wiedzieć, jak ten związek jest metabolizowany in vivo. Szczury leczone ferrytyną II miały niższe poziomy TfR1 w wątrobie oraz zmniejszone wysycenie żelaza i Tf w surowicy bez zmian w wątrobie żelaza niehemowego [16].

Ponadto ferrytyna II indukowała ekspresję hepcydyny [16,30]. W innym badaniu oceniano ekspresję genów po podaniu ferrytyny II (w oleju kukurydzianym) do żołądków szczurów rasy Wistar w dawce 146 mg/kg/dzień przez 7 dni. Wśród genów białek regulujących żelazo zaobserwowano obniżoną ekspresję HFE oraz zwiększoną ekspresję CP, GDF15 i HAMP po podaniu ferrytyny II [31]. Warto zauważyć, że wpływ ferrytyny II na szlak sygnałowy zależny od p53- był najprawdopodobniej barierą ograniczającą jej zastosowanie jedynie jako inhibitora TfR1 w hodowlach komórkowych [31].

Ferrystatyna II jest również znana jako czerń bezpośrednia 38, czerń chlorazolowa E, CI 30235 lub CAS 1937- 37-7 i jest powszechnie stosowana jako barwnik do barwienia granulocytów i grzybicy paznokci [32, 33]. Co ważne, metabolity benzydyny bezpośredniej czerni 38, które mają potencjalne ryzyko raka pęcherza moczowego, zaobserwowano w próbkach moczu pracowników w małej jednostce produkującej ten barwnik [34]. Chociaż ferrytyny II nie można bezpośrednio stosować u ludzi, z tego powodu istnieje argument, że strategia hamowania wejścia SARS-CoV-2 do komórki przez blokowanie TfR1 jest obiecująca, ponieważ podejście to jest ukierunkowane na receptor na gospodarzu komórki, a nie wirusowe białko podatne na mutacje. Ponadto uzasadnione są dalsze badania w celu zidentyfikowania związków chemicznych, które działają jak cząsteczka ferrytyny II, ale bez tworzenia metabolitów potencjalnie zagrażających zdrowiu.

zaburzenia erekcji cistanche

Bibliografia

1 Scialo, F.; Daniele, A.; Amato, F.; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G.; Bianco, A. ACE2: główny receptor wejścia komórkowego dla SARS-CoV-2. Płuc 2020, 198, 867-877. [Odsyłacz] [PubMed]

2. Ni, W.; Yang, X.; Yang, D.; Bao, J.; Li, R.; Xiao, Y.; Hou, C.; Wang, H.; Liu, J.; Yang, D.; i in. Rola enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) w COVID-19. Kryt. Opieka 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J.; Tak, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C.; Aihara, H.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. Strukturalne podstawy rozpoznawania receptorów przez SARS-CoV-2. Natura 2020, 581, 221–224. [Odsyłacz] [PubMed]

4. Wan, Y.; Shang, J.; Graham, R.; Baric, RS; Li, F. Rozpoznawanie receptorów przez nowy koronawirus z Wuhan: analiza oparta na dziesięcioletnich badaniach strukturalnych nad koronawirusem SARS. J. Virol. 2020, 94, e00127-20. [Odsyłacz] [PubMed]

5. Zhang, Q.; Chen, Czechy; Swaroop, M.; Xu, M.; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradhan, M.; Hagen, N.; Chen, L.; i in. Siarczan heparanu wspomaga SARS-CoV-2 we wnikaniu do komórek i może być celem zatwierdzonych leków in vitro. Odsłon. komórki 2020, 6, 80. [Odsyłacz]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang Z.; Deng, Y.; Lian, JQ; Du, P.; Wei, D.; Zhang, Y.; Słońce, XX; Gong, L.; i in. Białko wypustek CD147-jest nową drogą zakażenia SARS-CoV-2 do komórek gospodarza. Transdukt sygnału. Cel. Tam. 2020, 5, 283. [Odsyłacz]

7. Wei, C.; Wan, L.; Yan, Q.; Wang, X.; Zhang, J.; Yang, X.; Zhang, Y.; Wentylator, C.; Li, D.; Deng, Y.; i in. Receptor HDL-scavenger typu B typu 1 ułatwia wejście do SARS-CoV-2. Nat. Metab. 2020, 2, 1391–1400. [Odn.]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K.; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Znak buta, Dania; Simon-Gracia, L.; Bauer, M.; Holandia, R.; i in. Neuropilina-1 jest czynnikiem gospodarza zakażenia SARS-CoV-2. Nauka 2020, 370, 861–865. [Odn.]

9. Wang S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X.; Xu, W.; Zheng, T.; Wu, P.; Xie, S.; Bian, W.; Zhang, C.; i in. AXL jest kandydatem na receptor SARS-CoV-2, który promuje infekcję komórek nabłonka płuc i oskrzeli. Komórka Res. 2021, 31, 126–140. [Odn.]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R.; Pedro, LD; Djannatian, M.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; i in. Neuropilin-1 ułatwia wnikanie do komórek SARS-CoV-2 i infekcyjność. Nauka 2020, 370, 856–860. [Odn.]

11. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mechanizmy wchodzenia SARS-CoV-2 do komórek. Nat. Ks. Mol. Biol. 2022, 23, 3-20. [Odsyłacz] [PubMed]

12. Tang, X.; Yang, M.; Duan Z.; Liao, Z.; Liu, L.; Cheng, R.; Kieł, M.; Wang, G.; Liu, H.; Xu, J.; i in. Receptor transferyny jest kolejnym receptorem dla wpisu SARS-CoV-2. bioRxiv 2020. [Odsyłacz]

13. Hentze, MW; Muckenthaler, MU; Andrews, NC Równoważenie działa: molekularnie kontroluje metabolizm żelaza u ssaków. Komórka 2004, 117, 285-297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Crossing the Iron Gate: Dlaczego i jak receptory transferyny pośredniczą w wejściu wirusa. Annu. Ks. Nutr. 2018, 38, 431-458. [Odsyłacz] [PubMed]

15. Horonczik, L.; Wessling-Resnick, M. Małocząsteczkowy inhibitor transportu żelaza ferrytyna/NSC306711 promuje degradację receptora transferyny. Chem. Biol. 2008, 15, 647-653. [Odn.]

16. Byrne, SL; Wiadro, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C.; Wessling-Resnick, M. Ferristatyna II promuje degradację receptora transferyny-1 in vitro i in vivo. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [Odn.]

17. Sokołow AV; Wojnowa, IV; Kostevich, VA; Własenko, AY; Zacharowa, ET; Wasiljew, VB Porównanie interakcji między ceruloplazminą a laktoferyną/transferyną: wiązać się lub nie wiązać. Biochem. Biochimiia 2017, 82, 1073-1078. [Odn.]