Interakcje między przeciwutleniaczami polifenolowymi kwercetyna i naringenina dyktują charakterystyczne chemiczne i biologiczne zachowanie ich mieszanin związane z redoks. Część 3

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

Aktywność przeciwutleniająca w teście DPPH.

Oznaczenie aktywności przeciwutleniającej badanych przeciwutleniaczy i ich mieszanin przeprowadzono metodą:spektrofotometrycznytest z zastosowaniem rodnika DPPH, jak opisano wcześniej 13,55. Najpierw roztwór podstawowy rodnika DPPH rozcieńczono metanolem do uzyskania absorbancji 0.9±0.05 przy 515 nm. Po drugie, przeciwutleniacze i ich mieszaniny rozcieńczono odpowiednio 70% etanolem, aby uzyskać stężenia mieszczące się w liniowym zakresie oznaczenia355. Następnie roztwór DPPH (1 ml) zmieszano z rozcieńczonymi próbkami ~30 µl） i zmierzono absorbancję przy 515 nm po 10 minutach w 37°C. Wszystkie reakcje przeprowadzono na płytkach z 48-studzienkami. Pomiary absorbancji przeprowadzono za pomocą spektrofotometru TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Szwajcaria). Aktywność przeciwutleniającą próbki przeliczono na współczynnik stechiometrii ng, jak opisano wcześniej, z modyfikacjami5. W skrócie, liczbę rodników wymiatanych przez badane próbki obliczono na podstawie prawa Beera-Lamberta oraz molowego współczynnika ekstynkcji DPPH na podstawie pomiarów przeprowadzonych po 10 min reakcji roztworu przeciwutleniacza z rodnikiem55. Wartość n jest obliczana jako tangens zależności liniowej między liczbą moli DPPH oczyszczonych przez 1 mlprzeciwutleniacz(e)roztwory w zakresie stężeń, gdzie „roztwór podstawowy” ma stężenie „100 procent”, a pozostałe stężenia stanowią ułamek 100 procent, jak określono przez współczynniki rozcieńczenia.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Aktywność przeciwutleniająca przez miareczkowanie potencjometryczne i różnicową woltamperometrię impulsową.

Standardowe potencjały redukcji (E) dla Q i R zmierzono za pomocą miareczkowania potencjometrycznego (PT), jak opisano w innym miejscu5. W skrócie, badane związki i titrant(K,[Fe(CN)]) rozpuszczono w PBS. Stężenie oczyszczonych związków wynosiło 0,3 mg/ml, Mieszaniny zawierały 0,3 mg/ml każdego związku. Pomiary przeprowadzono przy użyciu aparatury JENCO 6230N ORP-146C Micro Oxidation-Reduction (USA) za pomocą elektrody odniesienia AglAgCl (RE) i platynowej elektrody pomiarowej. PT wykonano przy 37±00,01 stopnia, który był utrzymywany głównie przez Ultra Thermostat (PolvScience, USA). Do analitu dodano równą objętość titranta i odczytano potencjał stały. W rezultacie krzywe miareczkowania, E=f(V..), analizowano za pomocą oprogramowania SigmaPlot w wersji 13.0 (Systat Software Inc., Wielka Brytania) przez dopasowanie sigmoidalnych,5-parametrów matematycznych model do danych eksperymentalnych35. Potencjał w punkcie równoważności (EP vs. RE) został odczytany bezpośrednio z tego modelu w oparciu o parametr a. Jest równa objętości titranta dodanego w punkcie przegięcia. Na koniec obliczono wartości EP versus SHE (standardowy potencjał redukcyjny, EO). Składnik korekcyjny potencjału RE(c) został ustalony przez miareczkowanie par redoks, FeCl.6H,O i Na,S,O3.5H,O, charakteryzujących się znanymi standardowymi potencjałami redukcyjnymi.

Z kolei moc antyoksydacyjną (AOP) badanych związków i ich mieszanin mierzono metodą różnicowej woltamperometrii impulsowej (DPV), jak pokazano wcześniej z modyfikacjami. W skrócie, pomiary przeprowadzono przy użyciu potencjostatu Gamry Reference 60{{10}} (Gamry Instruments, USA) zawierającego układ trzech elektrod. Jako elektrodę pracującą (WE), pomocniczą (AE) i odniesienia (RE) zastosowano odpowiednio elektrodę z węgla szklistego (GC o średnicy 1,6 mm), drut platynowy oraz elektrodę AgAgCl (Hydromet SC, Polska)13. Przed eksperymentami powierzchnia WE była polerowana przy użyciu zawiesiny tlenku glinu （0.0cząstki 5 μm, Buehler, USA）na mikromacierzach (MF-1040, BASi, USA) i następnie oczyszczone wodą destylowaną i metanolem. Badane związki rozcieńczono w DMSO i buforze fosforanu sodu (pH=7.4±0.1), więc końcowe stężenie buforu fosforanowego wyniosło {{30}}.1 M w próbce. Bufor służył jako elektrolit podtrzymujący. Stężenie oczyszczonych związków wynosiło 3 mM. Mieszaniny zawierały 3 mM każdego związku. W celu wyeliminowania elektrochemicznie reaktywnego tlenu badane roztwory przed pomiarami odtleniano metodą perkolacji argonem. Woltamogramy DPV dla N-.N plus oraz mieszanin: ON- i RN plus zarejestrowano w przedziale -0.2 do plus 1,3 V, natomiast dla Q i R w przedziale -0.2 do plus 0,6 V vs. RE. Ustawiono potencjalną szybkość skanowania 0,1 V s, wysokość impulsu 0,05 V i czas impulsu 0,1 s przy 25 ± 0,01 stopnia.

Woltamogramy DPV analizowano za pomocą oprogramowania SigmaPlot wersja 13. 0 (Systat Software Inc., Wielka Brytania). Wartości AOP obliczono w dwóch krokach. W obliczeniach uwzględniono nie tylko szczytowy potencjał anodowy i prąd (E,; I,), ale także zadany potencjał i zmierzony prąd w każdym punkcie krzywej woltamperometrycznej. Pozwoliło to na uzyskanie bardziej precyzyjnych wartości niż te podane w naszej poprzedniej pracy3. Najpierw obliczono parametr energii antyoksydacyjnej (AOE) zgodnie z równaniem. 1:

gdzie AwE jest polem powierzchni WE (równym {{0}}.162±0.004 cm'w naszym badaniu), E jest ustalonym potencjałem w porównaniu do RE [V], jest współczynnik korekcyjny uwzględniający obecność ciekłego złącza pomiędzy WE i RE (tutaj 0,103 V), I jest prądem mierzonym względem prądu tła [A], to jest potencjalny czas próbkowania [dt=0 0,5 s].

Po drugie, AOP wyrażony w jednostkach W cm² obliczono na podstawie równania 2∶

gdzie tt;—jest różnicą między czasem początku piku utleniania (t) a jego końcem (t).

W celu wyznaczenia Awp przeprowadzono cykliczną woltamperometrię dla roztworu 1.10-3MK,[Fe(CN).] w 0.1 M KCl. Wartość tę obliczono w oparciu o równanie Randlesa-Sevcika82 z nachylenia szczytowego prądu anodowego jako funkcji pierwiastka kwadratowego szybkości skanowania, I, =f(pi/2). Mierzono je w taki sam sposób jak w miareczkowaniu potencjometrycznym. Ponadto w niniejszej pracy parametrem termodynamicznym procesu utleniania był potencjał piku anodowego skorygowany przez złącze cieczy pomiędzy WE i RE (E.,=E.. plus e), natomiast parametry kinetyczne obejmowały przeniesiony ładunek ( Q) i prąd anodowy (I,).

Cistanche może poprawić odporność

Hodowlę komórkową. W prezentowanym badaniu linia komórkowa HT29 (ludzka okrężnicarak gruczołowy) z ATCC zastosowano jako model ludzkiego jelita. Komórki utrzymywano w pożywce McCoy's uzupełnionejantybiotyki(100 U/mL streptomycyny i 100 g/L penicyliny) oraz płodowa surowica bydlęca (100 mL/L)13. Linię komórkową HT29 utrzymywano w 37°C poniżej 5% CO, w atmosferze w inkubatorze komórkowym (Heal Force)3. Linię komórkową zastosowano między pasażami 6 i 11. Hodowane komórki testowano pod kątem skażenia mykoplazmą przy użyciu zestawu Universal Mycoplasma Detection Kit z ATCC (USA).

Ocena cytotoksyczności. Aby określić wpływ oczyszczonychprzeciwutleniacze(Q, N plus , R, N-) i ich mieszaniny (QN-, RN plus ) na wzrost komórek HT29, zastosowano MTTtest jak opisano wcześniej3,5. W skrócie, wykładniczo rosnące komórki wysiano w 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych (5×10 komórek na dołek w 00,18 ml pożywki) i pozostawiono do osadzenia się na 24 godziny przy 37 stopniach poniżej 5 procent CO, Następnie komórki traktowano przez 6,24 lub 72 godziny 0.02 ml różnych stężeń czystych przeciwutleniaczy lub ich mieszanin3,5. Przeciwutleniacze i ich mieszaniny rozpuszczono w etanolu (naringenina, naringina i mieszaniny—30% (v/v), kwercetyna-40% (v/v), rutyna—20% (v/v). )). Ostateczne stężenia oczyszczonych związków wahały się od 10 nM do 100 uM. Mieszaniny zawierały równoważne stężenia każdego związku ~10 nM-100 μM）. Końcowe stężenie etanolu w pożywce hodowlanej wynosiło 2% (obj/obj) w przypadku rutyny, 3% (obj/obj) naringeniny, naringiny i mieszaniny oraz 4% (obj/obj) kwercetyny. Po 6 i 24 godzinach ekspozycji pożywkę odessano z dołków i zastąpiono 0,2 ml świeżej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C do 72 godzin całkowitego czasu inkubacji13,55. Po 72 godzinach inkubacji do wszystkich studzienek dodano 0,05 ml roztworu MTT (4 g/l) i komórki utrzymywano przez kolejne 4 godziny w 37°C13,5. Następnie pożywkę odessano ze studzienek i kryształy formazanu rozpuszczono w 0,05 ml DMSO. Absorpcję otrzymanych roztworów mierzono przy 540 nm za pomocą czytnika płytek TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Szwajcaria)15. Zabiegi wykonano w czterech powtórzeniach technicznych. Wykonano trzy niezależne powtórzenia każdego zabiegu. Wpływ badanych próbek na wzrost komórek HT29 wyrażono jako procent zahamowania wzrostu komórek wystawionych na działanie poszczególnych przeciwutleniaczy i ich mieszanin w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi samym rozpuszczalnikiem, których wzrost uznano za 100 procent 13,55

CAA (komórkowa aktywność antyoksydacyjna). Test CAA (The OxiSelect Cell Biolabs, Inc. USA) zastosowano do oceny komórkowej aktywności przeciwutleniającej samych związków (O, Nplus , R, N-) i mieszanin (ON-, RNplus ) w komórkach HT29, jak opisano wcześniej35. Wykładniczo rosnące komórki wysiano na 96-studzienkowych czarnych płytkach do hodowli tkankowych z przezroczystym dnem do pomiarów fluorescencji (3x104 komórki na studzienkę w 0.2 ml pożywki) i były pozostawiono do osiedlenia się przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni poniżej 5% CO,i3,55. Wszystkie przeciwutleniacze rozpuszczono w 10 procentach etanolu. Komórki następnie potraktowano 50{{50}} razy rozcieńczonym roztworem dioctanu 2',7'-dichlorofluoresceiny (0.05 ml) dostarczonym z zestawem i taką samą objętość różnych stężeń próbek przeciwutleniaczy przez 1, 3 lub 6 godzin. Końcowe stężenia oczyszczonych związków wahały się od 1 do 100 uM. Mieszaniny zawierały równoważne stężenia każdego związku (1-100uM). Komórki kontrolne potraktowano tylko 10 procentem etanolu (obj./obj.). Końcowe stężenie etanolu w pożywce hodowlanej wynosiło 5% (obj./obj.). Wszystkie zabiegi przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych i przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty. Kolejne kroki zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami producenta (https://www.cellbiolabs.com). Obliczenia przeprowadzono jak opisano wcześniej, Efekty genotoksyczne. W celu określenia efektów genotoksycznych wykazywanych przez poszczególne przeciwutleniacze (O, N plus , RN-) i ich mieszaniny (ON-, RN plus ) w komórkach HT29 zastosowano procedurę testu kometowego, jak opisano wcześniej. Wykładniczo rosnące komórki HT29 wysiano w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych (10 stopień komórek na dołek w 1,8 ml pożywki) i pozostawiono do osiadania przez 24 godziny w 37 stopniach pod 5% CO, 55. Następnie komórki traktowano przez 24 godziny 0,2 ml różnych stężeń przeciwutleniaczy, samych lub w mieszaninach. Ostateczne stężenia oczyszczonych związków wahały się od 1 do 100 uM. Mieszaniny zawierały równoważne stężenia każdego związku (1-100 uM). Końcowe stężenie etanolu w pożywce hodowlanej wynosiło 3% (obj./obj.). Komórki stosowane jako kontrole negatywne traktowano tylko rozpuszczalnikiem. Po czasie traktowania pożywkę odessano ze studzienek i komórki przemyto 0,5 ml PBS. Komórki następnie oddzielono przy użyciu 0,2 ml roztworu trypsyny (0,5 g/l)55. Aktywność trypsyny zatrzymano przez dodanie 1,8 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka. Komórki ponownie zawieszono, zliczono i podzielono na porcje do 1,5 ml probówek (30 x 103 3 komórek na probówkę). Zawiesinę komórek odwirowano (100 x g, 5 min, 4 stopnie). Osady komórkowe przemyto 1 ml PBS i ponownie odwirowano (100 x g, 5 min, 4 stopnie ~5. Następnie PBS odrzucono, a komórki ponownie zawieszono w 150 µl 0,5% agarozy LMP w wodzie przed ogrzano do 42 stopni C i 40 µl tej mieszaniny umieszczono jako dwie plamki na szkiełku mikroskopowym pokrytym 1% agarozą o normalnej temperaturze topnienia (agaroza NMP). Szkiełka przykryto szkiełkami nakrywkowymi. Agarozę pozostawiono do zestalenia przez umieszczenie szkiełek mikroskopowych na lodowatej tacce na co najmniej 5 min 5. Dla każdego stężenia badanych substancji przygotowano trzy szkiełka z dwoma powtórzeniami dla każdego stężenia badanych substancji Po całonocnej lizie w alkalicznym buforze o wysokiej zawartości soli (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA 0,01 M Tris, 1% Triton X100, pH 10), szkiełka umieszczono na platformie do elektroforezy Bio-Rad Sub-Cell GT (Wielka Brytania), pokrytej zimnym buforem do elektroforezy (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH 13) i chromatynę pozostawiono do odwinięcia przez 25 min przed elektroforezą Elektroforezę prowadzono w 26°C V i 300 mA (0,75 V/cm) przez 30 min w ciemności przy 4-8 stopniach. Po tym etapie szkiełka zostały przemyte najpierw PBS, a następnie wodą. Następnie DNA barwiono SybrGreen w buforze TE (0,1 M Trizma-Base, 1 mM EDTA, pH 7,5) przez 20 min. Po barwieniu szkiełka płukano wodą destylowaną przez 5 min. „Komety” DNA analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym (Zeiss ImagerZ2, USA) sprzężonym ze skomputeryzowanym systemem skanowania slajdów (Metafer4, Niemcy). Analiza komety polegała na zliczeniu 200 kolejnych jąder na próbkę5. Genotoksyczność analizowanych próbek wyrażono jako procent DNA w ogonie komety. Wykonano trzy niezależne powtórzenia każdego zabiegu.

Cistanche może poprawić odporność

Globalna metylacja DNA.

For the determination of global methylation of DNA, a modified comet assay procedure was developed. Methylation sensitive comet assay was performed according to Wentzel's procedure with significant modifications. The cells were seeded in 6-well tissue culture plates(4×105 cells per well in 3.6 mL of medium) and were allowed to settle for 24 h at 37°C under 5%CO,Then, the cells were treated with 0.4 mL, of different concentrations of the tested antioxidants or their mixtures for 24 h at 37C. The final concentrations of individual compounds and solvents were the same as used for genotoxic effect assessment. After incubation time, the medium was aspirated from the wells and the cells were washed with 2 mL of PBS. The cells were detached using 0.4 mL of trypsin solution (0.5 g/L). Then,3.6 mL of medium was added to each well. The cells were re-suspended, counted, and aliquoted into 1.5 mL tubes(30×10 cells per tube). The cell suspension was centrifuged (100×g,5 min, 4°C). The cell pellets were washed with 1 mL of PBS and centrifuged again(100×g 5 min,4℃C）.PBS was discarded and the cell pellet was re-suspended in 100μL of 1%LMP agarose in water pre-warmed to 45 °C. Then,40 μL of this mixture was placed as two spots on a microscope slide pre-coated with 1%normal melting point agarose(NMP agarose)5. The slides were then covered with coverslips and left to set on an ice-cold tray for at least 5 min to solidify agarose5. Each treatment embraced a set of 3 microscope slides. After overnight lysis in a high salt alkaline buffer(2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris,1% Triton X100, pH 10), the slides were washed twice with water>5. Ciasno upakowaną chromatynę rozwijano przez traktowanie jąder 1,5 mM roztworem proteinazy K (0,2 ml na szkiełko)3. Szkiełka przykryto parafilmem, umieszczono w plastikowym pojemniku wyłożonym wilgotną chusteczką, pozostawiono na 1 0 min w 37 stopniach, a następnie przemyto wodą3. W ten sposób przygotowano nukleoidy do trawienia endonukleazami restrykcyjnymi (Hall i MspI). Oba enzymy rozpoznają tę samą sekwencję restrykcyjną (5'-CCGG-3'), ale wykazują różną wrażliwość na metylowaną cytozynę. Przypuszcza się, że HpalI trawi tylko sekwencje niemetylowane. MspI może rozszczepiać sekwencje niemetylowane, jak również sekwencje w pełni zmetylowane. Zatem względne poziomy metylacji DNA sekwencji CpG są odzwierciedlone jako różnica między ogólną ilością DNA w ogonie komety obserwowaną przy trawieniu MspI a nukleoidami trawionymi HpalI. Aby stworzyć odpowiednie warunki do trawienia enzymatycznego, na każde szkiełko w zestawie nałożono {{20}.2 ml buforu Tango rozcieńczonego wodą o czystości molekularnej w stosunku 1:9 (obj./obj.). Szkiełka przykryto parafilmem, umieszczono w plastikowym pojemniku wyłożonym wilgotną chusteczką i pozostawiono na 1 0 min w 37 stopniach Celsjusza. Następnie usunięto nadmiar buforu. Każdy z trzech slajdów w zestawie został potraktowany inaczej. Na pierwszy (kontrolny) szkiełko nałożono tylko 0,15 ml rozcieńczonego buforu Tango. Jądra zatopione w agarozie na drugim szkiełku potraktowano 0,15 ml enzymu Halla 0,37 μjednostek）, podczas gdy do trzeciego szkiełka dodano taką samą objętość MspI （0,26 μjednostki）. Roztwory enzymów przygotowano przy użyciu rozcieńczonego buforu Tango. Slajdy przykryto parafilmem i umieszczono w wilgotnym plastikowym pojemniku. Trawienie enzymatyczne prowadzono przez 45 min w 37°C. Po trawieniu szkiełka zostały dwukrotnie przemyte wodą. Dalsze etapy testu kometowego, takie jak elektroforeza i barwienie DNA, przeprowadzono zgodnie z opisem w rozdziale „Globalna metylacja DNA”. "Komety" DNA analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym (Zeiss ImagerZ2, USA) sprzężonym z komputerowym systemem skanowania slajdów (Metafer4, Niemcy). Analiza komety została przeprowadzona za pomocą oprogramowania Comet score (USA) i obejmowała zliczenie 100 jąder na próbkę. Średni procent DNA w ogonie komety był miarą fragmentacji DNA. Aby obliczyć globalne DNAmetylacja(procent metylacji CpG), zastosowano następujące równanie: procent metylacji CpG=100—Hpal/MspI×100, gdzie Hpal/MspI to stosunek procentu DNA w ogonie komety nukleoidu trawionego HpalII i DNA procent w ogonie komety nukleoidu trawionego Mspl85. Artefakty uszkodzenia DNA uwzględniono odejmując procentową zawartość DNA w ogonie próbki kontrolnej od wartości uzyskanych dla próbek trawionych enzymami restrykcyjnymi. Wykonano trzy niezależne powtórzenia każdego eksperymentu.

Analiza mikromacierzy.

Analizę genomową przeprowadzono, jak pokazano wcześniej i355, komórki HT29 wysiano na 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych (105 komórek na studzienkę w 1,8 ml pożywki) i pozostawiono do osadzenia się przez 24 godziny w temperaturze 37 poniżej 5% CO. Następnie komórki traktowano przez 24 godziny 0,2 ml różnych stężeń przeciwutleniaczy, samych (Q, N-) lub w mieszaninie (QN-). Końcowe stężenia badanych związków wahały się od 1 do 10 uM. Mieszanina zawierała równoważne stężenia każdego związku. Komórki stosowane jako kontrole negatywne traktowano tylko rozpuszczalnikiem. Końcowe stężenie etanolu w pożywce hodowlanej wynosiło 3% (obj./rok). Izolacja RNA. Odwrotną transkrypcję i PCR w czasie rzeczywistym macierzy składającej się z 84 genów zaangażowanych w odpowiedź antyoksydacyjną oraz analizę danych przeprowadzono w sposób opisany wcześniej. Przeprowadzono trzy niezależne powtórzenia każdego traktowania komórek.

Analiza statystyczna.

Wszystkie wartości wyrażono jako średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów, o ile nie podano inaczej. Istotność statystyczną oznaczeń aktywności antyoksydacyjnej w układzie bezkomórkowym przy użyciu testów DPV i DPPH oraz w modelach komórkowych uzyskanych testem CAA zbadano niesparowanym testem Tukeya (p mniejsze lub równe 0.{{ 6}}5). Wyniki genotoksyczności i globalnej metylacji DNA analizowane za pomocą testów kometowych zbadano jednokierunkową ANOVA z testem post-hoc Dunnetta. Te analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., USA). Istotność statystyczną zmian w ekspresji genów między próbkami a kontrolami oceniano również za pomocą niesparowanego testu t Studenta dla każdego interesującego genu przy użyciu Centrum Analizy Danych GenGlobe (Qiagen, USA). Poziom istotności statystycznej ustalono na p Mniejszy lub równy 0,05.

Ten artykuł pochodzi zwww.nature.com/scientificreports