Odkładanie się amyloidu P w surowicy jest wrażliwą i specyficzną cechą podobnej do błoniaka glomerulopatii z maskowanymi złogami kappa IgG

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 i John M. Arthur2

SŁOWA KLUCZOWE:Kłębuszkowe zapalenie nerek; zamaskowane depozyty; spekrtometria masy; błoniastopodobna glomerulopatia; złogi podnabłonkowe

Cistanche może poprawić czynność nerek

Kłębuszkowatość błoniasta z maskowanymi złogami IgG kappa (MGMID) jest niedawno opisanym obrazem kłębuszkowego zapalenia nerek o unikalnej histopatologii. Wzór charakteryzuje się podnabłonkiem i/lub mezangiąodpornyzłogi, które są „zamaskowane”, do barwienia immunoglobuliny za pomocą rutynowej immunofluorescencji, ale silnie barwią się pod kątem łańcucha lekkiego IgG i kappa po trawieniu proteazą. Pacjenci z tym wzorem kłębuszkowego zapalenia nerek to najczęściej młode kobiety z białkomoczem i niejasną historią chorób autoimmunologicznych, takich jak przeciwciała przeciwjądrowe o niskim mianie. Tutaj porównaliśmy profil spektrometrii mas wychwytu laserowego z mikrodysekcji kłębuszków nerkowych z dziewięciu biopsji nerkowych MGMID z ośmioma biopsjami wykazującymi inne wzorce błoniastej glomerulopatii. Białkiem o najbardziej znaczącym zwiększeniu w MGMID był amyloid P w surowicy. Immunobarwienie wykazało, że amyloid P w surowicy był kolokalizowany z IgG w kłębuszkach MGMID, ale nie z glomerulopatią błoniastą związaną z PLA2R. Amyloid P w surowicy był dodatni w kłębuszkach wszystkich 32 biopsji MGMID, ale ujemny w biopsjach innych typów błoniastych kłębuszków nerkowych, takich jak te związane z PLA2R i THSD7A. Spośród 173 biopsji, które nie spełniały kryteriów MGMID lub amyloidozy, przeprowadzono cztery biopsje z barwieniem kłębuszkowego amyloidu surowicy P. Wszystkie cztery z tych biopsji z dodatnim barwieniem surowiczym amyloidem P miały błoniasty wzór glomerulopatii ze złogami IgG kappa, które różniły się od MGMID jedynie brakiem „maskowania”. Zatem dodatnie barwienie złogów kłębuszkowych dla amyloidu surowicy wskazuje na unikalną postać kłębuszkowego zapalenia nerek, która prawdopodobnie ma wspólny patofizjologiczny mechanizm choroby.

Kłębuszkowatość błoniasta z maskowanymi złogami IgG kappa (MGMID) to histopatologiczny wzór kłębuszkowego zapalenia nerek opisany w 2014 roku, który był pierwszym opisem tego, co nazwano maskowanymi złogami kłębuszkowymi.1 Charakterystyczna histopatologia tej choroby obejmuje obecność mezangium i podnabłonka. złogi z restrykcją IgG kappa. Co ciekawe, chociaż barwienie składnika 3 (C3) dopełniacza jest często widoczne w rutynowej immunofluorescencji na zamrożonej tkance, barwienie Ig często maskuje, co oznacza, że ​​pokazuje fałszywie ujemne barwienie w rutynowej immunofluorescencji, ale barwienie dodatnie po powtórzeniu na tkance zatopionej w parafinie po trawieniu proteazą. Tak więc, jeśli patolog nie utrzyma wysokiego wskaźnika podejrzeń dla tej jednostki, może ona zostać błędnie zdiagnozowana jako glomerulopatia C3. Inne jednostki, które zostały opisane w celu wykazania tego zjawiska maskowania w złogach kłębuszkowych, obejmują błoniastoproliferacyjne kłębuszkowe zapalenie nerek z maskowanymi monotypowymi złogami Ig i krioglobulinemiczne kłębuszkowe zapalenie nerek.2,3

Pacjenci, u których podczas biopsji stwierdzono MGMID, to najczęściej młode kobiety<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 procent) było ujemnych pod względem monoklonalnych Igs w elektroforezie białek surowicy i nie zaobserwowano żadnych przypadków związanych z leżącym u podstaw nowotworem hematologicznym.4

Postawiono hipotezę, że wspólne odkrycia kliniczno-patologiczne wśród pacjentów z MGMID mogą wskazywać na wspólny molekularny mechanizm patofizjologiczny napędzający ich chorobę. Naszym zamiarem w pierwszym zgłoszeniu tej jednostki było zdefiniowanie kohorty do dalszej analizy.1 Opisujemy tutaj obecność białka surowicy amyloidu p (SAP) znalezionego wyjątkowo w złogach kłębuszków MGMID. Immunobarwienie pod kątem SAP w złogach kłębuszkowych jest czułą i specyficzną techniką diagnozowania MGMID, która zapewnia również wgląd w patogeny.

Rysunek 1|Składnik amyloidu P w surowicy (SAP) jest znacząco wzbogacony w mikrorozcięte kłębuszki od pacjentów z błoniastopodobną glomerulopatią z maskowanymi złogami IgG kappa. Do analizy statystycznej zastosowano znormalizowane, oparte na intensywności bezwzględne wartości kwantyfikacji z MaxQuant (Instytut Biochemii Maxa Plancka, Planegg, Niemcy). Linie przerywane przedstawiają heurystyczne odcięcia dla zmiany fałd i wartości P. (a) Wykres wulkanu porównujący 3 błoniaste przypadki dodatnie dla receptora fosfolipazy A2 (PLA2R) z innymi identyfikuje 2 białka, które są wyraźnymi wartościami odstającymi w prawym górnym kwadrancie. (b) Wykres wulkaniczny porównujący 2 przypadki błoniaste zawierające trombospondynę typu 1, zawierającą domenę 7A (THSD7A) z innymi, identyfikuje 2 białka, które są wyraźnymi wartościami odstającymi, przy czym THSD7A wykazuje największą krotność zmiany. (c) Wykres wulkanu porównujący próbki błoniastopodobnej glomerulopatii z zamaskowanymi złogami kappa IgG ze wszystkimi innymi typami przypadków błoniastych identyfikuje 6 białek, które są wyraźnie odstającymi w prawym górnym kwadrancie. C6, dopełniacz składnik 6; C7, dopełniacz składnik 7; CFHR1, białko 1 związane z czynnikiem H dopełniacza; HP1BP3, białko wiążące heterochromatynę 1 białko 3; HPRT1, fosforybozylotransferaza hipoksantyny 1; IGHG3, Ig ciężkie stałe gamma 3.

WYNIKI

Spektrometria masowa kłębuszków wycinanych laserowo

Analizę metodą spektrometrii masowej przechwyconych laserowo kłębuszków wypreparowanych metodą mikropreparacji z 9 przypadków MGMID porównano z 8 przypadkami glomerulopatii błoniastej (MG), w tym 3 przypadkami receptora fosfolipazy A2 (PLA2R)-dodatniego MG, 2 przypadkami domeny 7A zawierającej trombospondynę typu 1 ( THSD7A) – dodatni MG i 3 przypadki tocznia MG. W analizie tej zidentyfikowano łącznie 1695 białek. Przeprowadzono analizę dowodu zasady w celu sprawdzenia, czy białka zaangażowane w patogenezę choroby MG można wykryć za pomocą spektrometrii masowej. Dla każdego znanego typu błoniastego porównywano obfitość różnicowania białek z pozostałymi grupami przy użyciu znormalizowanych wartości bezwzględnej kwantyfikacji opartej na intensywności (iBAQ). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Welcha, a wyniki zwizualizowano na wykresie wulkanu. PLA2R był znacznie bardziej obfity w przypadkach MG związanego z PLA2R i wykazywał najsilniejszą zmianę krotności (ryc. 1a). THSD7A wykazywał najsilniejsze krotność zmian w MG związanym z THSD7A, aczkolwiek z większą wartością P ze względu na małą liczebność próby w tej grupie (n=2; Rysunek 1b). Ogólnie rzecz biorąc, ta analiza dowodu zasady wykazała, że ​​spektrometria mas wychwytywanych laserowo kłębuszków nerkowych poddanych mikrowycięciu może zidentyfikować białka istotne dla patogenezy choroby w glomerulopatii błoniastej.

Następnie staraliśmy się zidentyfikować białka potencjalnie zaangażowane w patogenezę MGMID przy użyciu tego podejścia. Łącznie 6 białek było znacznie bardziej obfite w próbkach MGMID w porównaniu z innymi grupami (tabela 1). Białkiem o największej krotności zmiany był SAP (Figura 1c). Pozostałe białka składały się z IgG Kappa, 3 białek dopełniacza i białka wiążącego 1 heterochromatynę 3 (HP1BP3). SAP został uznany za najlepszego kandydata, ponieważ został wykryty we wszystkich próbkach MGMID i wykazał największą różnicę w obfitości w stosunku do próbek innych niż MGMID. Wszystkie Igs zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas w wyciętych laserowo kłębuszkach nerkowych metodą mikropreparowania z przypadków błoniastopodobnej glomerulopatii ze złogami IgG kappa przedstawiono w tabeli uzupełniającej S1. Zliczenia spektralne przez próbkowanie wszystkich białek, które wykazały 1 log2 zwiększoną obfitość w próbkach MGMID i wartość P #0.1 pokazano w tabeli uzupełniającej S2.

Cistanchemoże poprawićnerkafunkcjonować

Barwienie SAP w przypadkach błoniastopodobnej glomerulopatii

Poliklonalne przeciwciało królicze przeciwko białku SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) wykazywało silne dodatnie barwienie wzdłuż błon podstawnych kłębuszków nerkowych w przypadkach MGMID, które kolokalizowały z IgG w analizie konfokalnej. SAP nie wykazywał kolokalizacji z IgG w kłębuszkach z MG związanego z PLA2R (Figura 2). Poliklonalne przeciwciało królicze przeciwko HP1BP3 badano w 4 biopsjach z użyciem MGMID i we wszystkich 4 przypadkach wykazywało ujemne zabarwienie w złogach kłębuszków nerkowych.

Barwienie SAP przeprowadzono na łącznie 211nerkabiopsjez kłębuszkowym zapaleniem nerek (tab. 2). W sumie 36 przypadków ze złogami typu immunologicznego wybarwionymi na obecność SAP. Wszystkie przypadki, które wybarwiły się dodatnio, miały pewne cechy histopatologiczne, w tym obecność złogów mezangialnych i podnabłonkowych z restrykcją IgG kappa i brak zmian wewnątrzkapilarnych lub błonoproliferacyjnych w mikroskopie świetlnym. SAP był ujemny we wszystkich przypadkach, z maskowanymi złogami, które nie były MGMID, w tym 3 przypadki krioglobulinemicznego kłębuszkowego zapalenia nerek i 3 przypadki maskowanego błoniastoproliferacyjnego kłębuszkowego zapalenia nerek. Wynik był również ujemny we wszystkich 19 przypadkach proliferacyjnego kłębuszkowego zapalenia nerek ze złogami monoklonalnych Ig (PGNMID), w tym z IgG1 kappa (4 przypadki), IgG2 lambda (1 przypadek), IgG 3 kappa (8 przypadków) i IgG3 lambda (6 przypadków) ). We wszystkich 30 przypadkach poliklonalnej glomerulopatii błoniastej (PLA2R, THSD7A, toczeń i segmentalna) nie stwierdzono SAP. Zbadano również dodatkowe postacie kłębuszkowego zapalenia nerek, które dały wynik ujemny. Wśród zapalenia kłębuszków nerkowych związanych z infekcją 7 było dodatnich pod względem barwienia IgG, a 6 miało oznaki podnabłonkowych złogów garbowych. Zgodnie z oczekiwaniami, we wszystkich 6 przypadkach amyloidozy stwierdzono dodatnie zabarwienie złogów amyloidowych. Jednak rozmazany wzór osadzania był w wyraźnym kontraście z ziarnistym barwieniem obecnym w przypadkach MGMID. Reprezentatywne mikrofotografie kłębuszków na barwieniu SAP z wielu różnych chorób nerek są pokazane na Rycinie Uzupełniającej S1.

Wszystkie 32 przypadki wcześniej zidentyfikowane jako MGMID były pozytywne dla SAP. Ponadto stwierdzono dodatnie barwienie pod kątem SAP w kłębuszkach z 4 z 25 przypadków błoniastych kłębuszków z monotypowym odkładaniem IgG, które nie maskowały rutynowo

immunofluorescencja, w tym 4 z 13 przypadków z IgG1 kappa, 0 z 2 przypadków z IgG1 lambda, 0 z 5 przypadków z IgG2 kappa, 0 z 4 przypadków z IgG3 kappa i {{ 12}} 1 przypadku z IgG4 kappa. Ogólnie rzecz biorąc, 32 z 36 (89%) glomerulopatii SAP-dodatnich zostało zamaskowanych i dopasowanych do kategorii MGMID, podczas gdy pozostałe 4 z 36 (11%) zostało zdemaskowanych i zdiagnozowanych jako MG ze złogami kappa IgG1. Pacjenci z monotypową błoniastą glomerulopatią, która nie maskowała się, ale wykazywali obecność SAP, mieli średni wiek 33 lat, ze stosunkiem kobiet do mężczyzn wynoszącym 4:0. Przypadki z monotypową błoniastą glomerulopatią, które nie maskowały się, ale były ujemne pod względem SAP, miały średni wiek 59,3 lat ze stosunkiem kobiet do mężczyzn wynoszącym 15:4.

Tabela 1|Białka istotnie zwiększone w kłębuszkach u pacjentów zbłoniastopodobna glomerulopatiaz zamaskowanymi złogami kappa IgG, jak pokazano za pomocą spektrometrii masowej

Reaktywność surowicy do SAP

Surowice od 22 pacjentów z MGMID, 12 z PLA2R-dodatnimi glomerulopatią błoniastą i 6 normalnych kontroli zbadano pod kątem reaktywności IgG z SAP za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Chociaż istniała pewna zmienność wśród pacjentów w każdej grupie, nie było znaczącej różnicy w reaktywności IgG wobec SAP między grupami (rysunek uzupełniający S2).

Rysunek 2|Kolokalizacja IgG i surowiczego składnika P amyloidu (SAP). (a-c) Eksperymenty immunofluorescencyjne przeprowadzone na próbce z biopsji nerki od pacjenta ze zdiagnozowaną błoniastopodobną glomerulopatią z zamaskowanymi złogami kappa IgG wykazują ziarniste barwienie błony podstawnej kłębuszków pod kątem (a) SAP i (b) IgG. (c) W złogach kłębuszkowej błony podstawnej występuje silna kolokalizacja SAP i IgG. (d–f) Eksperymenty immunofluorescencyjne przeprowadzone na próbce z biopsji nerki od pacjenta z 3 fosfolipazami błoniastymi kłębuszkami nerkowymi z dodatnim receptorem A2 wykazały (d) ujemne barwienie kłębuszkowej błony podstawnej pod kątem SAP i (e) dodatnie barwienie ziarnistych kłębuszków błony podstawnej pod kątem IgG. (f) Brak kolokalizacji u tego pacjenta z błoniastymi kłębuszkami nerkowymi związanymi z receptorem A2 3 fosfolipaz. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu w Tabeli 2|Wyniki barwienia składnika surowiczego amyloidu p (SAP) w biopsjach nerki

AA, amyloid A; AL, lekki łańcuch amyloidowy; C3, dopełniacz składnik 3; GBM, kłębuszkowa błona podstawna; MG, błoniasta glomerulopatia; MGMID, błoniastopodobna glomerulopatia z zamaskowanymi złogami kappa IgG; MPGN, membranoproliferacyjny; Kłębuszkowe zapalenie nerek; PGMNID – proliferacyjne kłębuszkowe zapalenie nerek z monoklonalnymi złogami kappa IgG; PLA2R, receptor fosfolipazy A2; THSD7A, domena 7A zawierająca trombospondynę typu 1.

DYSKUSJA

MGMID jest niedawno opisanym i unikalnym wzorem glomerulopatii charakteryzującym się złogami podnabłonkowymi i mezangialnymi, które wybarwiają się pod kątem IgG kappa za pomocą parafiny IF (Figura 3). Pacjenci z tym wzorem glomerulopatii to zazwyczaj młode kobiety (wiek<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP jest białkiem pentamerycznym 25-kDa z rodziny pentraksyn, które jest kodowane przez gen APCS i występuje obficie w surowicy oraz jako składnik błony podstawnej kłębuszków nerkowych.5 Chociaż dokładna funkcja SAP jest niejasna, wiadomo oddziałuje w osoczu z szeroką gamą białek, w tym składnikami dopełniacza, apolipoproteinami oraz regulatorami krzepnięcia i proteolizy.6 Tworzy stabilne, zależne od wapnia interakcje ze swoimi ligandami, w tym białkami, lipoproteinami i DNA, chroniąc je przed degradacją. SAP służy jako rozpuszczalna cząsteczka rozpoznająca wzorce zaangażowana we wrodzoną odpowiedź immunologiczną, rozpoznając różne wzorce molekularne związane z patogenami i uszkodzeniami, w tym składniki drobnoustrojów i szczątki komórek apoptotycznych.7 Interakcja SAP z cząsteczkami związanymi z patogenami lub uszkodzeniami wspomaga usuwanie resztek komórek apoptotycznych za pośrednictwem dopełniacza przez bezpośrednie wiązanie ze składnikiem 1q dopełniacza (C1q) i aktywację klasycznego szlaku dopełniacza. Pomimo aktywacji dopełniacza wiadomo, że SAP nadaje immunoregulację, zmniejszając liczbę neutrofilówzapaleniew tkankach poprzez zmniejszoną adhezję śródbłonka,8 zmniejszoną funkcję elastazy,9 i zmniejszone naprowadzanie do tkanek.10 SAP jest również znanym białkiem wiążącym DNA i chromatynę w osoczu.11

W chorobie SAP jest najbardziej znany z tego, że wchodzi w skład złogów amyloidozy. Chociaż jest mniej dobrze zbadany, istnieją również dowody na to, że może odgrywać rolę w ludzkich i zwierzęcych modelach chorób autoimmunologicznych. Przeciwciała SAP zostały zidentyfikowane u pacjentów z:autoimmunologicznychorobyi wykazano, że zmniejszona ekspresja SAP promujeautoimmunizacjaw modelach mysich. Przeciwciała przeciw SAP są identyfikowane u 44 procent pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym, a miana przeciwciał korelują z aktywnością choroby.12 Stwierdzono, że niedobór SAP powoduje rozwój spontanicznej autoimmunizacji u podatnych na autoimmunologię myszy C57BL/6 oraz u myszy nieautoimmunologicznych podatne myszy 129/Sv po skrzyżowaniu z myszami C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13, ale nie w samym szczepie 129/Sv, co sugeruje, że u podstaw niedoboru SAP może być wymagana podatność genetyczna w celu wywołania autoimmunizacji. myszy wykazują produkcję przeciwciał przeciwjądrowych, przeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA, przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA i czynników reumatoidalnych. Rozwijają proliferacjęodpornyzłożone kłębuszkowe zapalenie nerek, częściej u kobiet.13 W mysim modelu toczniowego zapalenia nerek, w którym kłębuszkowe zapalenie nerek jest indukowane przez wstrzyknięcie aktywowanego własnego DNA do surowicy, terapia genowa SAP przez wektor plazmidowy zmniejszyła wytwarzanie przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA , odkładanie się kompleksów immunologicznych i zapalenie nerek oraz zapobiegały wystąpieniu toczniowego zapalenia nerek.15

Rysunek 3|Wyniki biopsji nerki w błoniastopodobnej glomerulopatii z zamaskowanymi złogami kappa IgG. Fotomikrografie z biopsji pokazane na rycinie 2 są pokazane tutaj. (a) Odcinkowe kolce są obecne wzdłuż błon podstawnych kłębuszków nerkowych, przez barwienie srebrem Jonesa z methenaminą (pierwotne powiększenie x 400). (b) Mikroskopia elektronowa ujawnia złogi podnabłonkowe obecne wzdłuż błony podstawnej kłębuszków (pierwotne powiększenie x 12, 000). (c) Wybarwienie kłębuszków nerkowych negatywne na IgG w rutynowej immunofluorescencji na świeżej tkance (bezpośrednia immunofluorescencja; oryginalne powiększenie x 400). (d) Kłębuszki z tego samego przypadku wybarwiają się dodatnio na tkance zatopionej w parafinie po trawieniu proteazą (bezpośrednia immunofluorescencja; oryginalne powiększenie x 400). (e) Kłębuszki wykazują barwienie kappa i (f) nie lambda na trawionej proteazą tkance zatopionej w parafinie (bezpośrednia immunofluorescencja; oryginalne powiększenie x 400). Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.nerka-international.org.

Pomimo ograniczenia łańcucha lekkiego obserwowanego podczas biopsji, obecnie nie ma dowodów na związek tej jednostki z chorobami limfoproliferacyjnymi lub krążącymi monoklonalnymi Igs. czas. Rola autoprzeciwciał SAP jest również niepewna. W przeciwieństwie do innych postaci błoniastej glomerulopatii z białkiem specyficznie obecnym w złogach immunologicznych, takich jak choroba związana z PLA2R,16 MGMID nie wydaje się być napędzany przez autoprzeciwciała skierowane przeciwko SAP, ponieważ nie wykryliśmy reaktywności przeciwciał w surowicy przeciwko SAP u pacjentów z MGMID . Alternatywnym wyjaśnieniem jest to, że IgG kappa występuje w wyniku normalnej interakcji między tymi dwoma białkami, a nie w wyniku autoimmunologicznej interakcji antygen-przeciwciało, ponieważ wiadomo, że łańcuch Ig kappa jest częścią normalnego interaktomu SAP surowicy. chociaż przydatne w diagnostyce tkankowej tej jednostki, badanie przeciwciał SAP w surowicy nie służy obecnie jako nieinwazyjna diagnostyka, a przyczyna tej choroby pozostaje tajemnicą.

Wyniki kliniczne w MGMID są niezwykle zmienne, począwszy od spontanicznej remisji, przez progresję, aż do schyłkowego stadiumnerkachorobaz nawrotem w przeszczepie. Analiza retrospektywna nie wykazała żadnego związku między zastosowanym leczeniem a wynikami klinicznymi.4 Odkrycie udziału SAP w tej chorobie może mieć wpływ na terapię. Terapie bezpośrednio ukierunkowane na SAP okazały się wcześnie obiecujące w leczeniu amyloidozy.17,18 Ponadto wyniki spektrometrii mas wskazują, że terapie ukierunkowane na kaskadę dopełniacza mogą być przydatne w leczeniu tej postaci kłębuszkowego zapalenia nerek, biorąc pod uwagę, że większość białek, które zostały zwiększone w MGMID kłębuszki są związane z dopełniaczem. Potrzebne są dodatkowe badania, aby zidentyfikować biomarkery aktywności tej choroby, a także terapie.

Powód maskowania złogów immunologicznych w biopsjach MGMID w rutynowej immunofluorescencji pozostaje tajemnicą. Obecność SAP w złożach rodzi nowe możliwe wyjaśnienia tego zjawiska w przypadku MGMID. Na przykład wiadomo, że oddziaływania białka SAP są silnie zależne od Ca2þ6, a wiele nośników transportowych i buforów stosowanych w przetwarzaniu tkanki z biopsji nerki do immunofluorescencji jest pozbawionych Ca2þ. Ten brak Ca2þ in vitro może spowodować rozerwanie złogów immunologicznych, tak że nie są one już dostępne do wykrywania za pomocą immunofluorescencji na zamrożonej tkance. Złogi kompleksów immunologicznych pozostałyby jednak dostępne do wykrywania w tkance utrwalonej w formalinie, w wyniku indukowanych formaliną kowalencyjnych wiązań chemicznych między białkami w tkance.

Po raz pierwszy opisujemy tutaj unikalną obecność SAP w kłębuszkowych złożach MGMID. Dodatkowo pokazujemy, że wybarwienienerkabiopsjefor SAP identyfikuje przypadki z cechami kliniczno-patologicznymi podobnymi do tych w MGMID, bez maskowania, za pomocą rutynowej immunofluorescencji. Biorąc pod uwagę te wyniki, uważamy, że pozytywne barwienie złogów kłębuszkowych pod kątem SAP identyfikuje unikalną postać kłębuszkowego zapalenia nerek, która ma wspólny patofizjologiczny mechanizm choroby. Do czasu niedawnego opisu MGMID przypadki te diagnozowano w wielu różnych kategoriach, od glomerulopatii C3 przez zapalenie kłębuszków nerkowych związane z infekcją do atypowej glomerulopatii błoniastej.1 Szybka ewolucja kryteriów diagnostycznych i nasze zrozumienie tej postaci kłębuszkowego zapalenia nerek uwydatnia siłę mas spektrometria zapewniająca patofizjologiczny wgląd w zapalenie kłębuszków nerkowych o podłożu immunologicznym.

METODY

Techniki przetwarzania biopsji nerki

Zastosowano standardowe techniki biopsji nerki, w tym mikroskopię świetlną, immunofluorescencyjną i elektronową.19,20 Wszystkie próbki z mikroskopii świetlnej barwiono hematoksyliną i eozyną, srebrem Jonesa z metenaminą, trichromem Massona i odczynnikiem kwasu nadjodowego-Schiffa. Wszystkie skrawki bezpośredniej immunofluorescencji pocięto na 4 mm i poddano reakcji z poliklonalnymi króliczymi przeciwciałami antyludzkimi przeciwko IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrynogenem oraz łańcuchami lekkimi k i l znakowanymi fluorosceiną (Dako, Carpenteria, CA) przez 1 godzinę i spłukać; nałożono szkiełko nakrywkowe przy użyciu wodnych środków do zamykania. Wybrane przypadki wybarwiono na znakowane flfluoresceiną poliklonalne mysie przeciwciała antyludzkie przeciwko IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Immunofluorescencję parafinową przeprowadzono po trawieniu proteazą, jak opisano wcześniej.2,3 Do analizy metodą spektrometrii masowej wybrano łącznie 9 biopsji MGMID i 8 porównawczych biopsji kontrolnych z błoniastą glomerulopatią innych typów. Protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję ds. oceny rozwiązań i zgodny z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

Cistanche możetonizowaćnerka

Spektrometria masowa kłębuszków wycinanych laserowo

Tkankę z biopsji nerki z tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie pocięto na grubość 1 0 mm na szkiełka ramy membrany Leica PET (Leica, Wetzlar, Niemcy). Szkiełka te następnie wybarwiono hematoksyliną. Kłębuszki zostały mikropreparowane do probówek do mikrowirówki przy użyciu mikroskopu Leica DM60{{20}}0B. Mikrorozcięte kłębuszki poddano lizie w 2% dodecylosiarczanie sodu i 0,1 M ditiotreitolu w temperaturze 99° przez 1 godzinę i poddano obróbce przez przygotowanie próbki z użyciem filtra (FASP).21 Sklarowany lizat przeniesiono do koncentratorów Vivacon 500 (MWCO 30 kDa; Sartorius , Getynga, Niemcy). Dodecylosiarczan sodu usunięto przez wielokrotne przemywanie 8 M mocznikiem w 0,1 M tris(hydroksymetylo)aminometanie/Cl, pH 8,5; próbki następnie alkilowano 0,05 M jodoacetamidem. Jodoacetamid usunięto przez 3 przemycia 8 M mocznikiem/0,1 M tris(hydroksymetylo)-aminometanem/Cl, pH 8,5, a następnie 3 przemycia 0,05 M wodorowęglanem amonu. Białka trawiono trypsyną (klasa do sekwencjonowania, Promega, Madison, WI) w stosunku wagowym 40:1 w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Peptydy zebrano przez odwirowanie i odsolono na końcówkach C18-Stage (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Trawione peptydy analizowano za pomocą tandemowej spektrometrii masowej NanoLC przy użyciu spektrometru masowego Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Peptydy załadowano na kolumnę pułapki z odwróconą fazą (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) zawierającą 2,5 mm naładowaną hybrydową żywicę powierzchniową Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) sprzężoną z 150 mm X 0.075 mm kolumna analityczna zawierająca tę samą żywicę z odwróconą fazą, jaką zastosowano w pułapce. Następnie zastosowano ultrawydajny system chromatografii cieczowej nanoAcquity (Waters Corp.) do wygenerowania 60-minutowego gradientu od 98:2 do 60:40 stosunek buforu A:B (bufor A=0,1 procent kwasu mrówkowego 0,5% acetonitrylu; bufor B=0,1% kwas mrówkowy, 99,9% acetonitrylu).

Peptydy eluowano z kolumny za pomocą zintegrowanej końcówki rozpylającej (Picofrit, New Objective) i jonizowano przez elektrorozpylanie (2,0 kV), a następnie przeprowadzono tandemową analizę spektrometrii masowej przy użyciu dysocjacji indukowanej zderzeniami o wyższej energii (HCD). Skany przeglądowe prekursorów peptydowych przeprowadzono w rozdzielczości 240K (przy 400 m/z) z docelową liczbą jonów 5x10⁵. Spektrometrię mas tandemową przeprowadzono przez izolację przy 1,6 Th z kwadrupolem, fragmentację HCD przy znormalizowanej energii zderzenia 30 i analizę spektrometrii masowej szybkiego skanowania w pułapce jonowej. Uzyskane dane tandemowej spektrometrii masowej zostały przeszukane w oparciu o najnowszą ludzką bazę danych Uniprot zawierającą zarówno wpisy Swiss Prot, jak i TREMBLE przy użyciu

MaxQuant (Instytut Biochemii im. Maxa Plancka, Planegg, Niemcy). Wizualizacja danych została wykonana przy użyciu Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Współczynnik fałszywego wykrywania ustalono na 1 procent dla dopasowań peptydu do widma. Do oceny ilościowej zastosowano znormalizowane wartości iBAQ z MaxQuant. Rozkłady iBAQ dla każdej próbki skorygowano o medianę w celu kontroli różnic w obciążeniu. Z zestawu danych usunięto wartości iBAQ równe zero. Dla testowania hipotez statystycznych, dla każdego białka wykonano 2-test t Welcha przy użyciu znormalizowanych wartości iBAQ dla 2 grup. Jeśli białko zostało wykryte tylko w jednej grupie, wykonano 1-próbkę testu t Welcha, stosując najmniejszą wykrytą wartość iBAQ jako hipotezę zerową.

Barwienie SAP

Skrawki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie, przycięte na 3 mm, odparafinowano i przeprowadzono odzyskiwanie antygenu pod kątem 99 stopni. Skrawki poddano reakcji z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-SAP (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA), a następnie z kozim drugorzędowym przeciwciałem przeciwkróliczym sprzężonym z czerwienią rodaminą, które zostało zaadsorbowane na fazie stałej, aby zapewnić minimalną reakcję krzyżową z ludzkim IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Każdy przypadek prowadzono z kontrolą pozytywną i negatywną. Barwienie oceniano standardową mikroskopią immunofluorescencyjną. Uznano, że jest dodatni, jeśli w kłębuszku występuje dodatnie barwienie ziarnistej pętli kapilarnej, a ujemne, jeśli nie ma pętli włośniczkowej

barwienie w kłębuszkach. Kolokalizacja IgG i SAP w kłębuszkowych błonach podstawnych była badana za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu laserowego mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Niemcy). Do tej analizy, poliklonalne (skoniugowane z izotiocyjanianem flfluoresceiny) królicze anty-ludzkie IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) poddano reakcji z tkanką odzyskaną przez ciepło po wybarwieniu na SAP, jak opisano powyżej. Kontrole negatywne przeprowadzono w celu zapewnienia swoistości przeciwciał przez pominięcie przeciwciał pierwszorzędowych. Cztery przypadki MGMID zbadano na obecność HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) przez barwienie immunoperoksydazą.

Testowanie przeciwciał surowicy na SAP

Białko SAP (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) rozcieńczono do 3 ng/ml w buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 9,6) i pokryto {{ 6-studzienkowa płytka Immulon H2 (Thermo Scientific) przez noc w 4 stopniach. Płytki płukano trzykrotnie przy użyciu 200 ml buforu do płukania (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami i 0,05% tween) i blokowano przez 2 godziny buforem blokującym (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 0,05% tween, 1% żelatyny rybiej). Płytki następnie przemyto 3 razy 200 ml buforu do płukania. Dwadzieścia mikrolitrów rozcieńczonej surowicy (1:100 w buforze do płukania) dodano na studzienkę i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Płytki płukano x 7 200 ml buforu do płukania, a następnie dodano przeciwciało wykrywające, anty-ludzkie IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Płytki przemyto x 7 200 ml buforu do płukania. Następnie substrat peroksydazy 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny i substrat peroksydazy Sol B zmieszano w stosunku 1:1 i dodano 100 ml do płytki. Reakcję zatrzymano przez dodanie 100 ml 2M H2SO4, pozostawiono na ławce na 20 minut przed odczytem przy 450 nm. W celu kontroli, aby upewnić się, że białko SAP jest związane z płytką, użyliśmy króliczego anty-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) w seryjnym rozcieńczeniu, a następnie anty-królicze IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Kontrola wykazała dobrą korelację między rozcieńczeniem przeciwciała a absorbancją, ze średnią wartością R-kwadrat 0,95.

Cistanche do poprawynerkafunkcjonować

UJAWNIENIE

Wszyscy autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

UZUPEŁNIAJĄCY

MATERIAŁ Dodatkowy plik (PDF)

Rysunek S1. Reprezentatywne obrazy barwienia kłębuszkowego SAP z różnych chorób nerek.

Rysunek S2. Badania seroreaktywności anty-SAP w teście immunoenzymatycznym.

Tabela S1. Wszystkie Igs zidentyfikowane za pomocą spektrometrii masowej w wychwytywanych laserowo kłębuszkach z mikropreparacją z przypadków błoniastopodobnej glomerulopatii ze złogami IgG kappa.

Tabela S2. Zliczenia spektralne przez pobranie próbek wszystkich białek wykazały 1 log2 zwiększoną obfitość w próbkach MGMID i wartość P # 0.1.

BIBLIOGRAFIA

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM i in. Błoniastopodobna glomerulopatia z zamaskowanymi złogami kappa IgG.Nerkawewn. 2014; 86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Immunofluorescencja parafinowa w laboratorium patologii nerek: więcej niż technika ratunkowa. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD i in. Błoniastoproliferacyjne kłębuszkowe zapalenie nerek z zamaskowanymi monotypowymi złogami immunoglobulin. Nerka wewn. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et al. Cechy kliniczno-patologiczne błoniastopodobnej glomerulopatii z maskowanymi złogami kappa IgG. Kidney Int Rep. 2016; 1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. Struktura pentamerycznego składnika P amyloidu surowicy ludzkiej. Natura. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM i in. Interaktom surowiczego składnika amyloidu P (SAP) w ludzkim osoczu zawierający fizjologiczne poziomy wapnia. Biochemia. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et al. Rozpoznawanie wzorców przez pentraksyny. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98-116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M i in. Pentraksyny PTX3 i SAP w odporności wrodzonej, regulacji stanu zapalnego i przebudowie tkanek. J Hepatol. 2016;64:1416-1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Składnik ludzkiego amyloidu P: inhibitor elastazy. Scand J Immunol. 1984;20:219-226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Amyloid P w surowicy: ogólnoustrojowy regulator wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Cząsteczki ochronne — białko C-reaktywne (CRP), surowiczy amyloid P (SAP), pentraksyna3 (PTX3), lektyna wiążąca mannozę (MBL) i apolipoproteina A1 (Apo A1), i ich autoprzeciwciała: występowanie i znaczenie kliniczne w autoimmunizacji. J Clin Immunol. 2005;25:582-591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Przeciwciała przeciw surowiczemu składnikowi amyloidowemu P u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym korelują z aktywnością choroby. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698-1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Składnik amyloidu P w surowicy kontroluje degradację chromatyny i zapobiega autoimmunizacji przeciwjądrowej. Nat Med. 1999; 5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. Autoimmunizacja i kłębuszkowe zapalenie nerek u myszy z celowaną delecją genu składnika surowiczego amyloidu P: niedobór SAP czy kombinacja szczepów? Immunologia. 2004; 112: 255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B i in. Złagodzenie toczniowego zapalenia nerek przez terapię genową składnika P amyloidu surowicy z różnymi mechanizmami zmienianymi w różnych stadiach choroby. PLOS Jeden. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et al. Receptor fosfolipazy A2 typu M jako antygen docelowy w idiopatycznej nefropatii błoniastej. N Engl J Med. 2009;361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC i in. Terapeutyczne usuwanie amyloidu przez przeciwciała przeciwko składnikowi surowiczego amyloidu P. N Engl J Med. 2015;373:1106–1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV i in. Powtarzane dawki przeciwciała przeciw składnikowi amyloidu P surowicy usuwają złogi amyloidowe u pacjentów z amyloidozą układową. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Wytyczne praktyki dotyczące biopsji nerki. Mod Pathol. 2004;17:1555-1563.

20. Policja Walkera. Biopsja nerki. Laboratorium Arch Pathol Med. 2009;133:181–188.

21. Wiśniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Uniwersalna metoda przygotowania próbki do analizy proteomu. Metody Nat. 2009;6: 359–362.