Gossypitryna, naturalnie występujący flawonoid, łagodzi uszkodzenia neuronów i mitochondriów wywołane przez żelazo: część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

2.5. Wykrywanie kompleksów Gos-Fe(I)

Prawdopodobną hipotezą wyjaśniającą powyższe wyniki jest to, że Gos tworzy przejściowy kompleks z Fe(ll), który ułatwia jego utlenianie tlenem. Ten przejściowy kompleks mógłby dostarczać swoje elektrony łatwiej niż Fe()-cytrynian, tworząc bardziej stabilny kompleks z Fe(III). Figura 6A przedstawia typowe widmo Gos z maksymalną absorpcją przy 276, 332 i 380 nm (czarna linia). Dodanie Fe() wywołało zależny od stężenia spadek pików maksymalnej absorpcji i pojawienie się nowego w pobliżu 500 nm (Rysunek 6A). Występowanie szeregu widm pochodzących z widma Gos potwierdzono obecnością punktu izobestycznego przy λiso=405 nm （patrz czarne kropki）, co wskazuje na równowagę chemiczną (kompleksowanie) między wolnym i skompleksowanym Gos. Wstawka (Figura 6A) pokazuje tworzenie kompleksu o stechiometrii 2:1 (Gos-żelazo). Stechiometrię takich kompleksów Gos-żelazo określono metodą Joba, która wykazuje punkt pękania przy stosunku molowym 0,5.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Dalsze dowody na korelację między żelazem i Gos uzyskano za pomocą spektroskopii IR (ryc. 6B). Dla wolnego Gos i jego kompleksu żelaza, szerokopasmowy znajdujący się w zakresie 3000-4000 cm – uznano za rozciąganie wodoru- związane grupy hydroksylowe ze względu na obecność cząsteczek wody. Tryb rozciągania v(C=O) wolnego Gos występuje przy 1654 cm-I, który został przesunięty w kierunku tworzenia kompleksu 1636 cm-Iupon. Wynik ten sugeruje, że Fe(Ⅱ) jest skorelowane z tlenem karbonylowym [31]. Ponadto obecność drgań rozciągających v(Fe-O) przy 630 cm-I potwierdza powstawanie kompleksu żelazo-Gos, ponieważ wolny Gos nie wykazuje takiego pasma.

Rysunek 6.(A)Wpływ Fe(II) na widmo Gos UV-VIS (200-600 nm). Mieszanina inkubacyjna zawierająca 125 mM sacharozy, 65 mM KCl, 10 mM bufor HEPES (pH 7,2), 2 mM cytrynian i Gos 1,6 μM. Stężenia Fe（I） od góry do dołu wynosiły {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 i 1.12 μM.Wstawka∶ Wykres Joba dla kompleksu Gos-Fe（II） przy stałym stężeniu całkowitym 【Fe（D）】 plus 【Gos】=1.6 μM. Czarna kropka wskazuje punkt izobestyczny. Strzałki skierowane w dół i w górę wskazują odpowiednio spadek i wzrost wartości absorbancji przy 380 i 500 nm. Eksperymenty przeprowadzono w 28 stopniach. Szybkość skanowania wynosiła 2nm/sA linię podstawową ustalono z mieszaniną inkubacyjną plus 1,6 μM Fe（I）.（B） widma w podczerwieni Gos i Gos-Fe（I）. Pokazano typowe przykłady.

2.6. Gos zapobiegł redukcji Fe(III) przez askorbinian

Żelazowy stan żelaza promowany przez Gos reprezentuje wiarygodny mechanizm antyoksydacyjny, ponieważ hamuje katalityczną aktywność Fe(II). Niemniej jednak, Fe(III) można jeszcze ponownie zredukować do postaci żelaznej za pomocą naturalnych środków redukujących, takich jak askorbinian. Te ostatnie mogłyby przeładować systemy biologiczne Fe(II), który uczestniczy w reakcjach Fentona-Habera-Weissa, generując niezwykle reaktywny rodnik·OH. Aby zbadać te możliwości, użyliśmy 1,10-fenantroliny do pomiaru poziomów tworzenia Fe（II） z roztworu Gos （100 μM）traktowanego 2 mM askorbinianem i różnymi stężeniami Fe（II） （{{6} } μM）. Rysunek 7 pokazuje, że brak Gos pozwolił na maksymalną szybkość redukcji Fe(II) do Fe(II) (czarna linia o nachyleniu 5,85×10-3); jednak proces ten został spowolniony przez obecność Gos (1-min inkubacji, zielona linia), a po 5 minutach inkubacji z Gos, tempo redukcji Fe(I) przez askorbinian zmniejszyło się prawie 3 razy (czerwona linia o nachyleniu 2,04× 10-3). Ten wynik pokazuje zdolność Gos do hamowania redukcji Fe() za pośrednictwem askorbinianu do Fe(I)

Figura 7. Gos hamuje redukcję Fe(ⅢI) przez askorbinian w nieobecności mitochondriów wątroby szczura. Warunki doświadczalne: 125 mM sacharoza, 65 mM KCl, 10 mM bufor HEPES (pH 7,2), 1 mM cytrynian, Gos 100 μM. Eksperymenty przeprowadzono w 28 stopniach. Po 1 min lub 5 min inkubacji Gos-Fe(I) dodano askorbinian（4 mM） i 5 mM 1,10-fenantrolinę. Linie są reprezentatywne dla trzech testów.

2.7. Gos chroni przed 2-degradacją oksydacyjną dezoksyrybozy

Aby udokumentować zdolność Gos do preferencyjnego działania na żelazo zamiast na wolne rodniki, przeprowadzono badania konkurencji w celu oceny skuteczności Gos i dwóch zmiataczy OH (DMSO i salicylany) w ochronie 2,8 lub 28 mM 2-deoksyrybozy przed żelazem mediowane uszkodzeniem oksydacyjnym (Rysunek 8). Zmiatacze OH w stężeniu 20 mM chroniły 28 mM 2-deoksyrybozy znacznie mniej niż 2,8 mM2-deoksyrybozy (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Rysunek 8. Wpływ zmiataczy Gos i·OH, dimetylosulfotlenku (DMSO) i salicylanu, na uszkodzenie oksydacyjne 2,8 lub 28 mM 2-dezoksyrybozy indukowane przez Fe(II)-EDTA plus askorbinian. Roztwory inkubowano przez 30 min w 37 stopniach i zawierały 10 mM bufor fosforanowy (pH 7,2), 2-deoksyrybozę (2,8 lub 28 mM）, 150 μM EDTA i 50 μM Fe（ⅢI） Reakcje rozpoczęto przez dodanie askorbinianu do końcowego stężenia 2 mM.Słupki pokazują średnie ± SD (n=3).Kontrole zawierają tylko DMSO (0,001 procent), które jest stężeniem rozpuszczalnika w próbkach Gos. Dla*p . zastosowano jednostronny test t<0.05, n.s.,="">

3. Dyskusja

Żelazo uwalniane w kilku stanach neurodegeneracyjnych, w tym w udarze niedokrwiennym i krwotocznym, powoduje deregulację homeostazy żelaza w mózgu, prowadząc do patofizjologii urazu neurologicznego [4,32-34]. Na poziomie subkomórkowym wydaje się, że upośledzenie mitochondriów jest zaangażowane w śmierć neuronów, w której pośredniczy żelazo [10,15,35-38]. Dowody przedkliniczne potwierdzają przewagę stosowania chelatorów żelaza, głównie mesylanu deferoksaminy, przeciwko neurodegeneracji, w tym wszystkim rodzajom udaru mózgu [7,16]. Jednak ich wysoki koszt i niedostępność, a także szeroki zakres działań niepożądanych klasycznych chelatorów żelaza, doprowadziły do ​​zastosowania naturalnych chelatorów do zarządzania żelazem w dyshomeostazie [39, 40].

Cistanche może poprawić odporność

Ochronne działanie Gos pokazano na komórkach HT-22 i mitochondriach mózgu szczura inkubowanych z mieszaniną żelaza i cytrynianu, gdzie znaleźliśmy silną ochronę przed uszkodzeniami oksydacyjnymi wywołanymi przez żelazo. Mysie hipokampowe komórki HT-22 wystawione na przeładowanie żelazem (24 h) wykazywały zmniejszoną żywotność, która była ściśle związana z wczesnym rozpraszaniem potencjału błony mitochondrialnej i redukcją ATP (odpowiednio Figura 2A-C). Sugeruje to, że upośledzenie mitochondriów przyczynia się do śmiertelności neuronów. Rzeczywiście, w naszych warunkach oczekuje się, że przynajmniej część Fe(II) przesłanego do neuronów dotrze do organelli, ponieważ śmierć neuronów wywołana żelazem była poprzedzona utratą funkcji mitochondriów. Wykazano zatem, że przeładowanie żelazem indukuje śmierć komórek hipokampa HT-22 myszy i fragmentację mitochondriów [41,42]. Podobnie utrzymująca się ekspozycja na żelazo zwiększa poziom mitochondrialnych ROS w komórkach dopaminergicznego nerwiaka niedojrzałego SHSY5Y [43]. Ponadto po ekspozycji na 100 µM żelaza żelazawego weryfikowano rozległy napływ żelaza do neuronów hipokampa, a także uszkodzenie mitochondriów [36]. Tutaj zaobserwowaliśmy, że indukowane przez Gos zachowanie żywotności neuronów hipokampa dotkniętych żelazem jest ściśle związane z zachowaniem ich potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ATP.

Podobnie jak w nienaruszonych komórkach, bezpośrednia ekspozycja mitochondriów na żelazo żelazawe wywołała rozległy obrzęk organelli, rozproszenie potencjału błonowego i utratę ATP (odpowiednio Rysunek 3A-C). mitochondria przeładowane żelazem, co wyrażało się zachowaniem wyżej wymienionych parametrów. W tym sensie zaobserwowano, że mitochondria obciążone mikromolowym stężeniem żelaza uległy otwarciu porów przejścia mitochondrialnego i rozproszeniu △Y w sposób, który jest wrażliwy na chelatację żelaza, ale nie zależny od antyoksydacyjnego działania katalazy |44]. Co ciekawe, stwierdzono, że przeciwutleniacz Mito-Tempo chroni neurony hipokampa przed uszkodzeniem spowodowanym przeładowaniem żelazem poprzez zmiatanie mitochondrialnego anionorodnika ponadtlenkowego i zachowanie integralności morfologicznej mitochondriów i potencjału błonowego [36]. Niedawno opisaliśmy działanie przeciwutleniające tego flawonoidu i jego zdolność do ochrony komórek PC12 przed śmiercią wywołaną niedotlenieniem chemicznym [29], gdzie stwierdzono, że zmiatanie wolnych rodników i zdolność antyoksydacyjna Gos jest częściowo zaangażowana w ochronę przed żelazem. HT-22 i uszkodzenia mitochondriów. Jednak ulepszona skuteczność Gos przeciwko lipoperoksydacji za pośrednictwem żelaza w porównaniu z lipoperoksydacją za pośrednictwem wodoronadtlenku tertbutylu (odpowiednio Figura 4A, B) silnie sugeruje, że jego zdolność do oddziaływania z żelazem jest głównym mechanizmem przeciwko uszkodzeniom wywołanym przez żelazo.

Aby dokładniej scharakteryzować interakcję Gos-Fe, przeprowadzono kilka eksperymentów bez komórek i bez mitochondriów. Zaobserwowaliśmy, że gdy polifenol był koinkubowany z Fe (II), stężenie jonów metali spada, podczas gdy następuje odpowiedni wzrost zużycia tlenu (Rysunek 5A-C). Efekty te sugerują, że Gos usuwa Fe(II) z kompleksu cytrynianowego i utlenia go do postaci żelazowej w procesie, który wymaga O2 jako akceptora elektronów. W konsekwencji, Gos promuje spadek stężenia Fe(II), który może hamować rodniki hydroksylowe poprzez reakcje Fentona. Ponieważ kompleks Gos-Fe(II) umożliwia utlenianie odpowiednich środków redukujących, takich jak askorbinian, co prowadzi do tworzenia/regeneracji Fe(II), byliśmy w stanie wykazać, że Gos hamuje redukcję Fe(II) za pośrednictwem askorbinianu do Fe(II).

Hipoteza, że ​​Gos silnie oddziałuje z żelazem, została również tutaj potwierdzona za pomocą technik spektroskopowych i potwierdziła wcześniejsze wyniki, w których różne macierze

Stechiometrię kompleksu gos-żelazo scharakteryzowano metodą spektroskopii masowej z jonizacją elektronową [45].

Wyniki te dowiodły ochronnego działania Gos przeciwko uszkodzeniom neuronów, w których pośredniczy żelazo, prawdopodobnie poprzez interakcję z jonami żelazawymi, utrudniając jego udział w tworzeniu katalitycznych reaktywnych form tlenu. Ponadto sugeruje to tworzenie się przejściowego kompleksu z przeniesieniem ładunku między Fe(Ⅱ) i Gos, przyspieszającego utlenianie Fe(II) i tworzenie bardziej stabilnego kompleksu Fe(III)-Gos, który nie może uczestniczyć w fazie propagacji lipidów. peroksydacja. Co więcej, biologicznie istotny czynnik redukujący, taki jak askorbinian, nie był w stanie zredukować żelaza żelazowego w obecności Gos, ograniczając właściwości prooksydacyjne niektórych flawonoidów zaangażowanych w recykling jonów żelazawych. [30]. Gos w stężeniach mikromolowych był skuteczniejszy niż klasyczne zmiatacze w zapobieganiu utlenianiu 2-dezoksyrybozy za pośrednictwem żelaza. Ta wysoka skuteczność może być przypisana tworzeniu się Gos-Fe(II)/() o aktywności redoks, jak wcześniej zaobserwowaliśmy dla innych polifenoli, które poprawiły swoje działanie jako przeciwutleniacze po ich interakcji z żelazem w różnych paradygmatach uszkodzeń oksydacyjnych in vitro [ 22,46-48].

Ustalono, że czynniki chelatujące zawierające tlen jako ligand (oxoligand, O2-) mogą chelatować żelazo i sprzyjać utlenianiu Fe(I), stabilizacji Fe(II), a w konsekwencji powodować zmniejszenie jego potencjał redukcyjny49]. W fizjologicznym pH katechole łatwo tworzą termodynamicznie trwałe biskompleksy z żelazem żelazowym, czemu sprzyjają niskie stężenia ligandów. Obecność ugrupowania katecholowego w strukturze Gos sugeruje podobny mechanizm interakcji z żelazem, co może wyjaśniać osiągniętą ochronę przed uszkodzeniem komórek neuronalnych i mitochondriów wywołanym żelazem. W związku z tym wcześniej wykazaliśmy również, że mangiferyna i gutaferon A stymulują utlenianie żelaza żelazawego i hamują redukcję żelaza żelazowego [23,24,26-28].

Zdolność Gos do chelatowania żelaza może również pobudzać ścieżki sygnałowe, które przyczyniają się do neuroprotekcji. Na przykład, enzymy domeny hydroksylazy prolilowej (PHD), klasyczne enzymy modyfikujące hydroksylację czynnika indukowanego niedotlenieniem-lalfa(HIF-1o) pod wpływem normoksji, zostały zidentyfikowane jako krytyczne cele chelatorów żelaza, które są klinicznie korzystne w wielu zaburzenia neurologiczne [50,51]. Jest to zrozumiałe, ponieważ PHD zależy od żelaza dwuwartościowego jako czynnika sprzęgającego [52]. Kilka genów zaangażowanych w neuroprotekcję jest regulowanych przez HIF-1 a, takich jak eNOS, VEGF i EPO [53]. Co więcej, aktywacja HIF wynikająca z hamowania PHD może zapobiegać upośledzeniu mitochondriów i apoptozie wywołanym stresem oksydacyjnym, niezależnie od jego roli jako czynnika transkrypcyjnego [54].

Ferroptoza, niedawno scharakteryzowana regulowana śmierć komórek zależna od żelaza, została zaproponowana jako mechanizm, poprzez który umierają neurony narażone na uszkodzenie krwotoczne [8]. Dysfunkcja mitochondriów była ostatnio związana ze śmiercią komórek ferroptozy [55]. Dlatego też hamowanie ferroptozy, które chroni funkcje mitochondriów przed uszkodzeniem przez żelazo, może być również prawdopodobnym mechanizmem neuroprotekcji przed zaburzeniami neurologicznymi związanymi z żelazem chronionymi przez Gos, który zasługuje na dalszą uwagę. Należy przeprowadzić dodatkowe badania nad przypuszczalnym korzystnym wpływem Gos na zwierzęce modele in vivo neurodegeneracji związanej z żelazem, aby zaproponować ten flawonoid jako interwencję terapeutyczną przeciwko uszkodzeniom tkanki mózgowej indukowanym przez deregulację homeostazy żelaza.