Surowe polisacharydy z Cistanche Deserticola Y.C. Ma jako immunoregulator i adiuwant do szczepionki przeciwko pryszczycy

Aby uzyskać więcej informacji prosimy o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej

Abstrakt

Cistanche deserticola Y. C. Ma (CD) są idealnymi ziołowymi środkami na problemy zdrowotne. W tym badaniu aktywność modulatora CPCD na aktywacjękomórki dendrytyczne(DC) i potencjał adiuwantowy szczepionki przeciwko pryszczycy (FMDV) został poddany ocenie. CPCD bezCytotoksycznościindukowana aktywacja dc poprzez regulację fenotypową markery i wychwyt antygenu. Przeciwciała TLR-2 lub TLR-4 tłumiły poziomy CD40 i CD86 za pośrednictwem CPCD jako a także IL-6 i IL-1β w DC. CPCD indukował fosforylację cząsteczek związanych z MAPKs i NF-κB. Kiedy współwstrzyknięte domięśniowo z FMDV u myszy, CPCD zwiększył przeciwciało specyficzne dla FMDV, proliferację limfocytów, efektorowe limfocyty T. W szczególności CPCD wywołał odpowiedź Th1, na co wskazują wyższe wyrażenia CD4 + IFN-γ, CD8 + IFN-γ i odpowiedź CTL. CPCD poprawił ekspresję MHC-II, CD80, CD86 i CD40 w DC i obniżona częstotliwość Tregs. Dlatego CPCD może skutecznie stymulować silniejsze odpowiedzi humoralne i komórkowe poprzez modulowanie aktywacji DC poprzez związane z TLR-2 / TLR-4 MAPK i szlaki NF-κB.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Wprowadzenie

Większośćpolisacharydypochodzące z ziół leczniczych cieszą się rosnącym zainteresowaniem w dziedzinie adiuwantów ze względu na ich niską toksyczność i wzmacniacz immunologiczny o szerokim spektrum działania (Chen & Huang, 2018; On i in., 2020). Wielu badaczy z powodzeniem stosowało zioła lecznicze jako kandydatów na adiuwanty dla wielu szczepionek. Typowe polisacharydy, w tym polisacharyd Astragalus, polisacharyd żeń-szenia Panax, polisacharyd Poria cocos i lentinan, są szeroko stosowane jako adiuwanty do szczepionek przeciwko kilku chorobom zakaźnym (P. Li & Wang, 2015; ReyLadino, Ross, Cripps, McManus, & Quinn, 2011; B. Sun i in., 2018). Cistanche deserticola Y. C. Ma (C. deserticola, "Rou Cong-Rong" w języku chińskim) jest tradycyjnie stosowany jako ziołowy suplement tonizujący do leczenia chorób w Tradycyjnej Medycynie Chińskiej (TCM) zgodnie z Farmakopeą Chińską od wieków (S. Li, Wu, & Le, 2021; Yong & Tu, 2009). Badania in vivo i in vitro wykazały, że ekstrakty z C. deserticola wykazywały wielefunkcje farmakologicznew tym łagodzenie zmęczenia orazprzeciwzapalne, funkcje neuroprotekcyjne, przeciwwirusowe i immunomodulujące (Fu, Fan, Wang, & Gao, 2018; Tian Wang, 2012). Udowodniono, że polisacharydy z C. deserticola, aktywnych składników C. deserticola, mają szeroki zakres aktywności biologicznej, w tym modulację odpowiedzi immunologicznej i przeciwutleniające działanie przeciwzapalne oraz funkcje przeciwzmęczeniowe (Dong, Yao, Fang, & Ding, 2007; W. Zhang i in., 2016). W 2018 i 2019 roku wykazaliśmy, że surowe polisacharydy C. deserticola (CPCD) działały jako adiuwant dla antygenu OVA faworyzującego odpowiedzi immunologiczne Th1 / Th2. CPCD może indukować aktywację DC przez receptor Toll-like 4 (TLR-4) (Zhang et al., 2018). Stwierdzono również, że CPCD wywołuje odpowiedzi immunologiczne Th1, w tym wydzielanie IFN-γ i generowanie IgG2a przeciwko szczepionce przeciw grypie u myszy (Zhao, Lian, Wang, Li, & Zhang, 2019). Dlatego konieczne jest odkrycie mechanizmu leżącego u podstaw odpowiedzi immunologicznej wywołanej PRZEZ CPCD i immunopotencjującego wpływu CPCD na inaktywowaną FMDV.

Pryszczyca (FMD) jest ważną chorobą wirusową u zwierząt, ponieważ może prowadzić do wysokich strat ekonomicznych i konsekwencji społecznych. Inaktywowane szczepionki przeciwko pryszczycy (FMDV) są najskuteczniejszymi środkami kontroli pryszczycy. Obecne inaktywowane FMDV są bezpieczne, ale słabo immunogenne ze względu na niską produkcję przeciwciał, krótki czas trwania przeciwciał, a także słabą odpowiedź immunologiczną u świń (Y. Cao, Lu, & Liu, 2016; Doel, 2003). Wyższe dawki szczepionek lub wydłużony czas leczenia, różne drogi wstrzykiwania (szczepienie domięśniowe i śródskórne) oraz przyspieszone programy dawkowania zostały wykorzystane jako ważne strategie poprawy skuteczności ochronnej szczepionek. Coraz więcej dowodów wykazało, że adiuwanty mogą zwiększyć skuteczność szczepionek przeciwko chorobom zakaźnym (Steven G. Reed, Orr, & Fox, 2013; N. Zhang et al., 2010). Nowe adiuwanty i ich włączenie do FMDV mogą zwiększyć immunogenność, a nawet poprawić czas trwania ochrony (Y. Cao, 2014; Dar, Kalaivanan, Sied, Mamo, & Kondabattula, 2013). Obecnie wiele wysiłków poświęca się opracowaniu bezpiecznych i skutecznych adiuwantów, które mogą zmaksymalizować immunogenność dzięki dostosowanej odpowiedzi immunologicznej (Pulendran & O'Hagan, 2021). Do szczepionek wymagane są różne adiuwanty. W porównaniu z tradycyjnymi adiuwantami, adiuwanty polisacharydowe z TCM mogą być pomocne w wywieraniu immunopotencjalnego działania na FMDV poprzez modulowanie poziomów limfocytów, cytokin i przeciwciał oraz generowanie silniejszych komórkowych i humoralnych odpowiedzi immunologicznych.

Udowodniono, że aktywacja komórek dendrytycznych (DC) inicjuje adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne i reguluje równowagę odporności Th1 / Th2 (Kapsenberg, 2003). Należy wyjaśnić wpływ nowych adiuwantów na DCS. Polisacharydy TCM mogą poprawić ekspresję cząsteczek powierzchniowych na DC, w tym MHC II, CD80, CD86 i CD40, oraz zwiększyć poziom cytokin prozapalnych, takich jak IL-6 i IL-1β (J. Li, Li, & Zhang, 2015). Działanie immunomodulujące polisacharydów TCM osiąga się poprzez bezpośrednie wiązanie receptorów błonowych na DC (Jiang, Zhu, & Jiang, 2010). Innymi słowy, aktywność immunoadiuwantowa CPCD jest związana z działaniem immunomodulującym na DC. Dodatkowo, TLR są receptorami wartowniczymi promującymi aktywację i rekrutację DC oraz wyzwalającymi odpowiedzi limfocytów B i limfocytów T. Szlaki kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) i czynnika jądrowego kappa-B (NF-κB) są krytycznymi szlakami TLR, a aktywacja tych szlaków może indukować produkcję cytokin prozapalnych, w tym IL-6 i IL-1β (Akira & Takeda, 2004). Dlatego konieczne jest zbadanie dalszych szlaków związanych z TLR w celu zrozumienia odpowiedzi komórek odpornościowych na infekcję.

W tym badaniu mysz ICR była zwykle wybierana jako zwierzę modelowe w laboratorium FMDV w celu określenia zależności między adiuwantem a moc szczepionki z powodu niewygodnego stosowania docelowych zwierząt, i CPCD jako adiuwant FMDV badano in vitro i in vivo do zbadać jego rolę w aktywacji DC przez TLR-2/ TLR-4 MAPKs i ścieżki NF-κB. Badanie to stanowi podstawę do zrozumienia mechanizmów indukcyjnych działań immunomodulacyjnych poprzez: CPCD, a także potencjał CPCD jako adiuwantu polisacharydowego dla FMDV u docelowych zwierząt.

Materiał i metody

C. deserticola (Nr. CD17042001) został dostarczony przez Profesor Jiang He. Inaktywowany wirusowy antygen O-serotypu 146S FMD i Adiuwant ISA-206 został uprzejmie zaoferowany przez Tecon Biology Co., Ltd. (Chiny). Płodowa surowica bydlęca (FBS) pochodziła z Biological Industries. Prędkość obrotowa Zakupiono 1640 nośników od GIBCO (USA). polimyksyna B (PMB), Lipopolisacharyd (LPS), 3-(4,5-dimetylotiozol-2-ylo)-2,5- bromek difenylotetrazolu (MTT) był produktem Sigma. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pochodził z Biosharp (Chiny). Czynnik stymulujący kolonie mityńskie granulocyty-makrofagi (GM-CSF) pochodziły z PeproTech (Stany Zjednoczone). Zestawy IL-6 i IL-1β pochodziły z Boster (Chiny).

Golgistop, Cytofix/Cytoperm, Bufor Perm/Wash i przeciwciała przeciwko CD3, CD4, CD8, CD44, CD11c, MHC-II, CD80, CD86, CD40 pochodziły z BD Biosciences (USA). Zestawy do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej oraz BCA zestawy do oznaczania ilościowego białek pochodziły z Cwbiotech (Chiny). Anty-TLR-2 i Przeciwciała anty-TLR-4 zostały zakupione od Novus Biologicals (USA). Zestawy mapks i ścieżek NF-κB pochodziły z cell signaling technology (Stany Zjednoczone). Przeciwciała anty-mysie/królicze znakowane peroksydazą chrzanową (IgG/IgG1/IgG2a) z Southern Biotech (USA). Zestaw do barwienia Tregs od eBiosciences (USA).

wynik

Neutralną zawartość węglowodanów określono na 50,53% ± 1,28%, a zawartość kwaśnych węglowodanów na 17,81 ± 0,51%. Średnia masa cząsteczkowa (Mw) CPCD została obliczona na 46,77 kDa z czasem retencji (ryc. 1A). Skład monosacharydowy CPCD ujawnia, że głównymi składnikami cukru CPCD są Glc, Ara, Gal, Rha, GlaA i Man w procentach molowych 33,17%, 28,98%, 16,39%, 10,97%, 8,05%, 2,42% (ryc. 1B). Rys. 1C pokazuje widmo FT-IR CPCD. Marki na poziomie 3383,64 cm− 1 były spowodowane grupą hydroksylową. Pasma absorpcyjne grupy alkilowej obserwowano przy 2926,97 cm− 1 i 1417,99 cm− 1 . Pasma absorpcyjne grupy karbonylowej obserwowano przy 1635,56 cm− 1 . Sygnały od 1257,06 do 1032,02 cm− 1 wskazywały na obecność pierścieni piranozowych. Aby dokładniej zbadać, czy szlaki MAPK i NF-κB zostały aktywowane przez leczenie CPCD, DC były stymulowane CPCD w innym czasie i badano ekspresję kluczowych białek zaangażowanych w te dwa szlaki. CPCD indukował fosforylację JNK, ERK i p38 w sposób zależny od czasu, a poziomy fosforylacji JNK, ERK i p38 były najwyższe po 15-30 minutach (ryc. 5AD). Ponadto fosforylacja cytoplazmatycznych NF-κB p65, IκBα, IKKα/β i jądrowych NF-κB p65 również była indukowana w sposób zależny od czasu. Poziomy fosforylacji cytoplazmatycznych p65, IκB i IKKα/β oraz proporcja p65 w jądrze były najwyższe po różnym czasie: 15–30 min dla p65, 30 min dla IκB, 60 min dla IKKα/β i 20 min dla proporcji p65 w jądrze (ryc. 5E-5 J).

Wydobywanie zJournal of Functional Foods 87 (2021) 104800 strona główna czasopisma: www.elsevier.com/locate/jff