Nadekspresja GRP78 wyzwala RÓŻOWY1-Mitofagia neuroprotekcyjna za pośrednictwem IP3R, część 2

2.5. Western Blot

Głęboko znieczulaliśmy szczury preparatem Dolethal (n=4) przy 7 dpi, aby uzyskać segmenty rdzenia kręgowego L4–L5 (długość 5- mm) do analizy Western blot. Próbki zamrażamy szybko w ciekłym azocie.

W ostatnich latach coraz więcej wyników badań pokazuje, że istnieje ścisły związek pomiędzy protein blot a pamięcią. Białko blot to technika analityczna służąca do wykrywania ekspresji białek, która jest szeroko stosowana w badaniach neurologicznych.

Połączenie między neuronami jest ściśle związane z przechowywaniem pamięci. Analiza białek może wykryć stan połączeń między neuronami oraz ekspresję białek przed- i postsynaptycznych, co dodatkowo ujawnia ważną rolę białek w tworzeniu i przechowywaniu pamięci.

Badania wykazały, że ekspresja presynaptycznych białek neuronalnych jest ściśle powiązana z tworzeniem i przechowywaniem pamięci. Na przykład podczas procesu uczenia się i zapamiętywania neurony zmieniają ekspresję białek presynaptycznych, a zmiana ta wiąże się z tworzeniem i przechowywaniem nowych wspomnień. Ponadto niektóre badania wykazały również, że zmiany w ekspresji niektórych białek są powiązane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Dlatego blot białek może zapewnić dogłębne zrozumienie stanu połączeń między neuronami i zmian w ekspresji powiązanych białek, ujawniając molekularny mechanizm neuronów. Ma to ogromne znaczenie w badaniu mechanizmu powstawania pamięci i chorób neurodegeneracyjnych.

Krótko mówiąc, związek między blotem białek a pamięcią pokazuje rolę białek w połączeniach między neuronami i magazynowaniu pamięci. Dostarcza to nowych pomysłów i kierunków badania mechanizmu powstawania pamięci i chorób neurodegeneracyjnych. Aktywnie promujmy badania z zakresu neuronauki i przyczyniajmy się do zdrowia i długowieczności! Można zauważyć, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwstarzeniowe, co może pomóc zmniejszyć reakcje oksydacyjne i zapalne w mózgu, chroniąc w ten sposób zdrowie układu nerwowego system. Ponadto Cistanche może również promować wzrost i naprawę komórek nerwowych, poprawiając w ten sposób łączność i funkcjonowanie sieci neuronowych. Efekty te mogą pomóc poprawić pamięć, zdolność uczenia się i szybkość myślenia, a także mogą zapobiegać występowaniu dysfunkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

Próbki przechowywano lub poddano dalszej obróbce poprzez homogenizację w buforze do lizy (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM sacharoza, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA i koktajl proteazy (Sigma-Aldrich) i inhibitorów fosfatazy (Roche, Bazylea, Szwajcaria) ) za pomocą homogenizatora Pottera na lodzie.

Po odwirowaniu lizatów przy 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C zebraliśmy supernatant jako frakcję pojądrową i oznaczono ilościowo białka za pomocą testu BCA (Pierce Chemical Co.).

Do analizy Western blot załadowaliśmy 30 µg frakcji postjądrowych segmentów L4–L5 od każdego zwierzęcia na 12% żele poliakryloamidowe SDS w celu przeprowadzenia elektroforetycznego rozdziału białek, a następnie przeniesiono je na membranę PVDF w systemie BioRadcuvette w 25 mM Tris, pH 8,4, 192 mM glicyna, 20% (v/v) metanol.

Blokowaliśmy błony 5% BSA w PBS plus 0,1% Tween-20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowaliśmy w temperaturze 4°C przez noc z pierwszorzędowym przeciwciałem: mysią anty- -aktyną ( 1:10000; SigmaAldrich), mysie anty-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), mysie anty-CV (1:1000, Invitrogen), królicze anty-HSP60 (1:500, Przeciwciała-online), mysie anty- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), mysie anty-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), królicze anty-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, UK), mysie anty-PINK1 (1:500, Abcam), królik anty-NRF2 (1:500, Abcam), anty-MNF2 (1:500, Abcam), królik anty-GRP75 (1:500, Abcam).

Po kilku przemyciach błony inkubowano przez 2 godziny z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z peroksydazą chrzanową (1:5000, Vector). Błonę wizualizowano stosując mieszaninę chemiluminescencyjną 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM kwas p-kumarowy, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) i (8,8 M nadtlenek wodoru, 1 M Tris-HCl; pH 8,5) i obrazy wykonano aparatem Gene Genome i analizowano za pomocą oprogramowania Gene Snap i Gene Tools (Syngene).

2.6. Model in vitro

Komórki NSC34 hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle'a o wysokiej zawartości glukozy (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Sigma-Aldrich), 100 jednostek/ml penicyliny i 0,5 X roztworu penicyliny/streptomycyny (Sigma-Aldrich) i trzymano w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C pod 5% CO2, zasadniczo jak opisano wcześniej [26].

Po 4 dniach hodowli komórkowej bez zmiany pożywki komórki NSC34 wykazywały zróżnicowany fenotyp charakteryzujący się obecnością długich neurytów. W dniu 4 do komórek dodano leki. Roztwory Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) i EFV (Bristol-Myers Squibb, Nowy Jork, USA) przygotowano w stężeniu 10X i rozpuszczono w DMEM.

Po 24 godzinach oceniano żywotność komórek poprzez inkubację komórek z roztworem MTT o stężeniu 4 mg/ml przez 3 godziny. Utworzone niebieskie kryształy formazanu rozpuszczono w DMSO i zmierzono absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofekcja

Transfekowaliśmy milion komórek 2 µg plazmidu w celu ekspresji GFP, GRP78, HAPARK, mysiego sh-eGFP, mysiego sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mysiego sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) i /lub mysz sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) przy użyciu zestawu Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Bazylea, Szwajcaria) i zestawu Nucleofactor V (Lonza) zgodnie z zaleceniami producenta.

Do statycznej analizy cytometrycznej wysiano komórki do {{0}}studzienek pokrytych 10% kolagenem. Po hodowli utrwaliliśmy komórki 4% PFA, przepłukano dwukrotnie PBS i przechowywaliśmy lub następnie dodaliśmy bufor blokujący zawierający 0,3% (v/v)Triton X-100 PBS i 10% płodowej surowicy bydlęcej. Po 3 dniach hodowli komórkowej dodano leki rozpuszczone w DMEM.

Do tych eksperymentów użyliśmy 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) lub 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). Po 5 godzinach od zabiegu albo utrwaliliśmy komórki do badań immunocytochemicznych za pomocą 4% PFA, albo homogenizowaliśmy je w modyfikowanym buforze RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1% NP-40, 0,5% dezoksycholan sodu, 0,1% SDS, koktajle proteaz i fosfataz) do immunoblottingu. Immunohistochemię przeprowadzono poprzez dwukrotne przepłukanie próbek PBS i inkubację z buforem blokującym zawierającym PBS plus 0,3% (v/v) Triton X-100 i 10% płodowej surowicy bydlęcej.

Inkubowaliśmy z następującymi przeciwciałami pierwotnymi: królicze anty-IP3R (1:200, Abcam), mysie anty-HA (1:2000, Abcam), mysie anty-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) i królicze anty-HSP60 (1:500, Antibodies-online). Aby ocenić żywotność metodą MTT, jak opisano powyżej, pozostawiliśmy traktowanie na 24 godziny.

2.8. Pomiar produkcji mitochondrialnego ponadtlenku i ∆ψM

Komórki inkubowano z 2,5 µM MitoSOX do analizy ponadtlenkowej lub z 2,5 µMTMRM do analizy ∆ψM, zarówno z Molecular Probes, jak i Invitrogen, podczas ostatnich 30 minut leczenia. Fluorescencję wykrywano za pomocą mikroskopu IX81 Olympus i oceniano ilościowo za pomocą oprogramowania do cytometrii statycznej.

2.9. Elektrochemiczny pomiar zużycia tlenu

Komórki (1 x 106 na 1 ml w HBSS) mieszano w gazoszczelnej komorze w temperaturze 37°C. Pomiary wykonano za pomocą elektrody O2 typu Clark (Rank Brothers, Cambridge, UK) i zarejestrowano za pomocą danych Dup.18 urządzenie do pozyskiwania danych (WPI) natychmiast po 5-leczeniu pojazdem lub tunerem.

2.10. Frakcjonowanie mitochondrialne i cytozolowe

Komórki homogenizowano w buforze do lizy (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM sacharoza i koktajl proteaz (Sigma-Aldrich) i inhibitorów fosfatazy (Roche)) za pomocą homogenizatora Pottera na lodzie.

Po odwirowaniu lizatów przy 2000× g przez 5 minut, supernatant odwirowano przy 10 000 x g przez 12 minut. Supernatant uznano za frakcję rozpuszczalną (S2) i zawiera białka cytozolowe i mikrosomy.

Pellet (P2) był wzbogaconą frakcją mitochondrialną, którą ponownie zawieszono w zmodyfikowanym buforze RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, 0,5% dezoksycholan sodu, 0,1% SDS, koktajle proteaz i fosfataz), a stężenie białka oznaczono za pomocą testu BCA. Próbki następnie poddano analizie metodą Western blot.

2.11. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

Zanurzyliśmy segmenty L{{0}}L5 rdzenia kręgowego (plastry 1- mm) w utrwalającym roztworze 2% (w/v) PFA i 2,5% (v/v) aldehydu glutarowego (klasa EM) w 0,1 M PBS, pH 7,4 i umieszczono je na platformie kołysającej na 2 godziny, następnie utrwalono w 1% (w/v) PFA, a następnie utrwalono 1% (w/v) tetratlenkiem osmu (TAAB Lab ) zawierający 0,08% (w/v) heksacyjanożelazianu potasu (Sigma-Aldrich) w PBS przez 2 godziny.

Przeprowadziliśmy cztery płukania wodą dejonizowaną i kolejne odwodnienie w acetonie. Wszystkie zabiegi przeprowadzono w temperaturze 4°C, jak opisano wcześniej [33]. Próbki zatapialiśmy w żywicy EPON i polimeryzowaliśmy w temperaturze 60°C przez 48 godzin.

Próbki poddano obróbce w celu uzyskania półcienkich skrawków (1 µm) za pomocą mikrotomu Leicaultracut UCT, wybarwiono 1% (w/v) wodnym roztworem błękitu toluidynowego i zbadano pod mikroskopem świetlnym w celu zidentyfikowania obszarów rogów brzusznych wzbogaconych w MN.

Ultracienkie skrawki (70 nm) wycięto nożem diamentowym, umieszczono na powlekanych siatkach i porównano z konwencjonalnymi roztworami octanu uranylu i cytrynianu ołowiu Reynoldsa.

Na koniec obserwowaliśmy skrawki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Jeol 1400) wyposażonego w kamerę GatanUltrascan ES1000CCD. Wybraliśmy trzy wycinki na warunek, przeanalizowaliśmy trzy MN na sekcję i zmierzyliśmy obszary jąder w porównaniu z całkowitą powierzchnią MN za pomocą narzędzi ImageJ.

2.12. Bioinformatyka i statystyka

Wykorzystaliśmy analizę wariancji (ANOVA) do porównania wartości pomiędzy różnymi grupami eksperymentalnymi dla danych, które spełniły założenie normalności. Różnice między grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnych rozstępów post hoc Tukeya lub testu t-Studenta. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0,05 dla istotności).

3. Wyniki

3.1. Tekst

3.1.1. Analiza proteomiczna nadekspresji GRP78 ujawniła, że ​​głównym celem są mitochondria

W celu zidentyfikowania mechanizmów molekularnych prowadzących do neuroprotekcji za pośrednictwem nadekspresji GRP78, przeprowadziliśmy porównawczą analizę proteomiczną bez znaczników w celu zidentyfikowania zarówno ilościowych, jak i jakościowych różnic pomiędzy zwierzętami uszkodzonymi przez RZS zakażonymi adenowirusami pod kątem nadekspresji GRP78 (Ad-GRP78), wcześniej uznanego za neuroprotekcyjne MN lub beta-galaktozydazę (Ad-ß-Gal) jako kontrolę [20].

Zgodnie z wcześniejszymi badaniami przeprowadzonymi w naszym laboratorium, jako punkt czasowy do analizy wybrano siedem dni po urazie (dpi) [20,25]. W poprzednim porównaniu modelu regeneracji po dystalnej aksotomii i zszyciu nerwu kulszowego z naszym modelem zwyrodnieniowego RZS zaobserwowaliśmy, że zdarzenia sygnalizacyjne były podobne aż do 7 dpi, kiedy to po RZS pojawiły się rozbieżne zdarzenia prodegeneracyjne [20,25].

Analiza pozbawiona znaczników LC-MS/MS frakcji pozajądrowych z segmentów rdzenia kręgowego L4-L5 doprowadziła do identyfikacji 1420 białek, przy czym co najmniej dwa peptydy na białko, jak opisano wcześniej w innych próbkach i badaniach [25] .

W sumie 566 i 732 białek lub peptydów uległo istotnym zmianom z powodu odpowiednio nadekspresji Ad-GRP78 lub Ad-ß-Gal u zwierząt uszkodzonych przez RZS w porównaniu ze zwierzętami uszkodzonymi przez RZS i niezakażonych wirusem (p < 0 .05) (tabele S1 i S2).

Porównaliśmy obie listy i odkryliśmy, że 220 zostało jednoznacznie zmienionych z powodu nadekspresji Ad-GRP78 (Tabela S3). Adnotacja funkcjonalna tych białek przy użyciu narzędzia Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) pozwoliła nam zidentyfikować najważniejsze funkcje biologiczne w zbiorze danych (FDR < 0,05) [34,35].

Nadekspresja GRP78 skutkowała różnicami w poziomach białek zaangażowanych w procesy, funkcje i składniki mitochondriów (Tabela S4A – C, Rysunek S1A – C). Terminy Gene Ontology (GO) i analiza wzbogacenia szlaku KEGG tych danych ujawniły, że u zwierząt zakażonych Ad-GRP78 nastąpił znaczny spadek poziomu wielu białek pełniących funkcje mitochondrialne, w tym białek zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni mitochondriów, białek kompleksu oddechowego, i białka macierzy.

Potwierdziliśmy różnice w poziomach białek ujawnionych na liście proteomicznej, takich jak GRP75, który był podwyższony (p <0.05) i podjednostka kompleksu V (CV ), obniżony (p=0.03). w grupach GRP78 zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 1A).

Na całej liście najbardziej obniżone poziomy dotyczyły 2-oksoglutaranu/białka nośnikowego jabłczanu OGC (SCL25A11), MT-ND3 (supresor nowotworu, który bierze udział w transporcie temalianowo-asparaginianowym i regeneruje pulę NADH w macierzy mitochondrialnej, aby umożliwić kompleks I), podjednostka 3 dehydrogenazy NADH kompleksu I, aminotransferaza kwasu gammaaminomasłowego ABAT i podjednostka reduktazy ubichinol-cytochrom C kompleksu III. Natomiast bardzo niewiele białek uległo zwiększeniu (ryc. 1B).

Zgodnie z oczekiwaniami jednym białkiem o zwiększonej ekspresji był GRP78, a innymi białkami o zwiększonej ekspresji był transporter aminokwasów EAAT2, który jest zlokalizowany głównie w błonie komórkowej i czasami w mitochondriach w synapsach pobudzających, oraz dehydrogenaza hydroksyacylo-CoA HADHA, która katalizuje trzy ostatnie etapy mitochondrialnego beta -utlenianie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych.

Rozszerzyliśmy analizę, aby zbadać, czy inne białka w mitochondriach lub białkach związanych z funkcją mitochondriów zostały zmodyfikowane z listy proteomicznej w celu potwierdzenia funkcjonalnego wpływu na mitochondria (Rysunek 1C).

Zaobserwowaliśmy, że związana z konserwatywną dynaminą mitochondrialna atrofia optyczna GTPazy 1 (OPA1), która bierze udział w fuzji [36], uległa obniżeniu (p < 0.1); LONP1, proteaza zależna od ATP, która pośredniczy w selektywnej degradacji nieprawidłowo sfałdowanych polipeptydów, wykazywała tendencję do zwiększania się, ale nie zaobserwowano żadnych różnic w poziomach ubichinonu NDUFA9, czynnika transkrypcyjnego NRF2, który reguluje geny zawierające elementy odpowiedzi antyoksydacyjnej lub inną dynaminę -pokrewna GTPaza biorąca udział w infuzji, taka jak mitofuzyna 2 (MFN2) [36].

Kompleksowe podsumowanie zmian występujących w mitochondriach przedstawiono na schemacie na rycinie 1D. Dynamika mitochondriów jest ważna dla reakcji na stres, ponieważ uszkodzone mitochondria mogą łączyć się w celu wymiany materiału, a rozszczepienie mitochondriów umożliwia segregację uszkodzonych mitochondriów i późniejszą mitofagię [37].

Biorąc pod uwagę, że większość białek o obniżonej regulacji lokalizuje się w mitochondriach i nie zaobserwowano żadnych wyraźnych zmian dotyczących aktywności fuzji mitochondriów poprzez analizę MFN2 i stosunek form L/S OPA1 (ryc. 1C), zbadaliśmy markery związane z mitofagią.

Klasycznie, zależna od autofagii degradacja mitochondriów następuje po depolaryzacji i jest zwykle wywoływana przez zwiększoną akumulację domniemanej kinazy 1 (PINK1) indukowanej fosfatazą i tensinhomologiem (PTEN) na pełnej długości na zewnętrznej błonie mitochondrialnej.

Następnie, pośrednia ligaza ubikwitynowo-białkowa E3 Parkin jest rekrutowana do oznaczania mitochondrialnego białka błony zewnętrznej zdepolaryzowanych mitochondriów poprzez ubikwitylację [38–41]. Górna część Ryc. 2A nie pokazuje żadnych zmian w poziomach Parkina, ale znaczne zmniejszenie pełnej długości PINK1 powstałego w wyniku urazu RA w ipsilateralnym odcinku L4-L5 rdzenia kręgowego w porównaniu z kontrolą przy 7 dpi. Natomiast nadekspresja GRP78 zmniejszyła poziom Parkiny, ale podwoiła poziom PINK1 po RZS w porównaniu z kontrolną ekspresją niepowiązanego białka -Gal (Figura 2A, na dole).

Zwiększenie pełnej długości PINK1 jest zgodne z indukcją mitofagii [42], a redukcja Parkina może być związana z zaawansowanym stanem demontażu organelli, obserwowanym w przypadku pozostałych białek mitochondrialnych.

Dalej badamy kolokalizację mitochondriów i białek związanych z mikrotubulami 1A/1B łańcucha lekkiego 3 (LC3)-dodatniego puncta, kluczowego składnika rdzenia maszynerii makroautofagii i niezbędnego w procesie mitofagii [43].

Stosując mikroskopię konfokalną, zaobserwowaliśmy znaczny wzrost kolokalizacji mitochondriów, znakowanych anty-COX IV, z LC3-dodatnim puncta po RA tylko w uszkodzonych MN z nadekspresją GRP78 przy 7 dpi (Rysunek 2B).

Potwierdziliśmy istnienie mitofagii w uszkodzonych MN tylko w przypadku nadekspresji GRP78 poprzez analizę próbek przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronicznej.

Zaobserwowaliśmy liczne wakuole z pochłoniętymi mitochondriami, cechę charakterystyczną mitofagii [37], przypominające mitofagosomy, oraz kilka ERcisternae w ścisłym połączeniu z mitochondriami w obrębie MN zwierząt Ad-GRP78, ale nie wykryliśmy ich u zwierząt Ad- -Gal RA uszkodzonych próbki szczurów w rozdzielczości 5 dpi (Rysunek 2C).

Rycina 1. Nadekspresja GRP78 u zwierząt uszkodzonych przez RA atakuje białka mitochondrialne. (A) Immunoblot i wykresy słupkowe przedstawiające średnią krotność zmian (± SEM) poziomów białek GRP78, GRP75 i CV w segmentach L4-L5 rdzenia kręgowego w GRP78 w porównaniu z GRP78.

-Gal nadekspresjonujący szczury z uszkodzonym RA w 7 dpi. Poziomy normalizowano do wartości aktyny (n=4; * p < 0,05 vs.Ad- -Gal, test t-Studenta). (B) Histogram krotności zmian białek mitochondrialnych uzyskany poprzez analizę proteomiczną segmentów rdzenia kręgowego L4-L5 u zwierząt z uszkodzonym RZS, które wykazują nadekspresję GRP78 w porównaniu z grupą Ad- -Gal przy 7 dpi. (C) Immunoblot i wykresy słupkowe pokazujące średnią krotność zmian (± SEM) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 znormalizowanych do aktyny. (Brak istotnych różnic pomiędzy grupami. Test t-Studenta). (D) Schematyczne mitochondria z białkami zmienionymi przez nadekspresję GRP78 w segmentach rdzenia kręgowego L4-L5 od zwierząt uszkodzonych przez RA, zaznaczone na żółto (zmniejszenie) lub na niebiesko (zwiększenie) w rozdzielczości 7 dpi.

Rycina 2. Mitofagia jest modulowana in vivo po RZS u szczurów z nadekspresją GRP78. (A) Immunobloty i odpowiadające im wykresy słupkowe dla analizy krotności zmian PINK1 i PARK poziomów białek (średnie ± SEM) znormalizowanych do poziomów aktyny, w segmentach rdzenia kręgowego L4-L5 szczurów z RZS vs.

kontrola (na górze) lub z grup Ad{{0}}Gal i Ad-GRP78 (na dole) w rozdzielczości 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, test t-Studenta). (B) Po lewej, mikrofotografie reprezentatywnych MN w miejscu ipsilateralnym od zwierząt uszkodzonych przez RA, którym wstrzyknięto dooponowo grupy AAVrh10-GFP lub AAVrh10-GRP78 w 7 dpi. Próbki barwiono pod kątem COX IV (czerwony) i LC3 (zielony) i barwiono kontrastowo fluorescencyjnym Nissl (niebieski).

Pasek skali=10 µm i zoom cyfrowy we wstawkach 10X.

Należy zauważyć, że kolokalizację obserwuje się tylko w grupie AAVrh10-GRP78. Po prawej stronie wykres słupkowy przedstawiający analizę% punktów kolokalizacji COX IV i LC3. Średnia ± SEM kolokalizacji COX IV i LC3 (n=4; ** p < 0.01, test t-Studenta). (C) Reprezentatywne obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego, na których rozróżnia się mitochondria w obrębie MN rdzenia kręgowego: a, obraz cytoplazmy MN przedstawiający mitochondria u zwierzęcia kontrolnego; b, obraz cytoplazmy MN szczura z grupy Ad- -gal; uszkodzonego przez RA; c, obraz cytoplazmy MN szczura z grupy Ad-GRP78 uszkodzonego przez RA, z niektórymi pochłoniętymi mitochondriami, oznaczonymi czerwonymi gwiazdkami; d, obraz w większym powiększeniu pokazano w (C), wskazując duży kontakt mitochondriów i ER. Na rysunkach pokazano słupki skali.

W sumie wyniki te sugerują, że nadekspresja GRP78 może indukować MN odłączone od mitofaginy po RZS i może promować neuroprotekcję.

3.1.2. Nadekspresja GRP78 przywraca uszkodzoną funkcję mitochondriów

Następnie zbadaliśmy dalej wpływ nadekspresji GRP78 na mitochondria, stosując model stresu ER in vitro, ponieważ uraz ten pojawia się wcześnie po uszkodzeniu RA in vivo, jak opisano wcześniej [20,26], i jest to niezawodna metoda badania nowych środków neuroprotekcyjnych [2,44 ]

Model ten wykorzystuje tunikamycynę (Tun), która jest induktorem stresu ER, który powoduje tworzenie półproduktów N-acetyloglukozamino-lipidowych, zapobiegając w ten sposób glikozylacji nowo syntetyzowanych białek i prowadząc do nieprawidłowego fałdowania białek. Wykorzystaliśmy to, ponieważ donoszono również, że zatrzymanie szlaku wydzielniczego jest kluczowe w procesie neurodegeneracyjnym po RZS [26].

Najpierw sprawdziliśmy, że nukleofekcja komórek podobnych do neuronu ruchowego NSC34 odpowiednim wektorem spowodowała wytworzenie GRP78 (ryc. 3A). W tych komórkach ekspresja GRP78 znacząco zwiększała przeżycie w pożywce zawierającej Tun (Figura 3B).

Chociaż leczenie Tun zwykle indukuje samo GRP78, ta endogenna nadekspresja jest dość późna (o 24 godziny) (Rysunek S2). Zastanawialiśmy się również, czy moglibyśmy ustalić, czy nadekspresja GRP78 ma działanie neuroprotekcyjne w innym modelu in vitro, o którym wcześniej informowaliśmy, w celu odtworzenia kilku cech śmierci MN po urazie RA [26].

Model ten opiera się na uszkodzeniu cytoszkieletu wywołanym przez nocodazol, który zakłóca polimeryzację mikrotubul. Ekspresja GRP78 zwiększała żywotność komórek hodowanych również w obecności nocodazolu (Figura 3B).

Następnie oceniliśmy funkcję mitochondriów, mierząc wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) w mitochondriach przy użyciu MitoSOX, potencjał błony mitochondrialnej (∆ψm) przy użyciu estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM) i stopień zużycia O2 w naszych komórkach NSC34 poddanych stresowi ER z lub bez nadekspresji GRP78.

Jako kontrolę pozytywną zastosowaliśmy efawirenz (EFV), środek mitotoksyczny, który zmienia wszystkie trzy parametry [45]. Zaobserwowaliśmy, że poziomy MitoSOX stopniowo rosły po dodaniu Tun, osiągając istotność statystyczną po 24 godzinach i że wytwarzanie ROS wzrosło znacząco w komórkach traktowanych EFV od pierwszej godziny po leczeniu w porównaniu z kontrolami traktowanymi nośnikiem (Figura S3A).

Nadekspresja GRP78 skutkowała znacznie niższymi poziomami mitochondriów ROS w porównaniu z komórkami wyrażającymi GFP po 24 godzinach po leczeniu Tun lub EFV (Figura 3C). ∆ψm zapadło się po 5 i 24 godzinach leczenia Tun i po 24 godzinach leczenia EFV (rysunek S3B). Odzyskiwanie tego parametru uzyskano przez nadekspresję GRP78 w komórkach traktowanych Tun lub EFV (Figura 3D).

Szybkość zużycia O2 spadła w ciągu 80 minut analizy po dodaniu Tun w komórkach wyrażających GFP (nachylenie -0,063,R2=0,98), ale zużycie O2 było stabilny w komórkach z nadekspresją GRP78- pomimo obecności Tun (nachylenie -0,221, R2=0,99) (Rysunek 3E, po lewej).

Po 5 godzinach oddychanie było normalne w komórkach z nadekspresją GRP78- i poważnie utrudnione w komórkach z ekspresją GFP (Rysunek 3E, po prawej). Łącznie wyniki te sugerują, że GRP78 osłabia funkcję mitochondriów spowodowaną stresem ER lub mitotoksycznością.

For more information:1950477648nn@gmail.com