Ekspresja ludzkiej alfa defensyny 5 w ludzkich nerkach i drogach moczowych

Więcej informacji: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer i inni

Abstrakcyjny

Tło:Mechanizmy utrzymujące sterylność w drogach moczowych nie są do końca poznane. Ostatnie badania wskazują na znaczenie peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) w ochronie dróg moczowych przed infekcją. Tutaj charakteryzujemy ekspresję i znaczenie ludzkiej alfa-defensyny 5 (HD5) AMP u ludzinerkai dróg moczowych u osób zdrowych i zakażonych.

Metodologia/główne ustalenia:Korzystanie z RNA wyizolowanego od człowiekanerka, moczowodu i pęcherza moczowego, przeprowadziliśmy ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym, aby pokazać, że DEFA5, gen kodujący HD5, jest konstytutywnie wyrażany w drogach moczowych. W przypadku odmiedniczkowego zapalenia nerek ekspresja DEFA5 znacznie wzrosła wnerka. Stosując analizę immunoblot, produkcja HD5 wzrosła również w przypadku odmiedniczkowego zapalenia nerek. Immunobarwienie zlokalizowało HD5 w urotelium pęcherza moczowego i moczowodzie. W nerkach HD5 był wytwarzany głównie w dystalnych kanalikach nerkowych i zbiorczych. Stosując testy immunoblot i ELISA, HD5 nie było rutynowo wykrywane w próbkach moczu niezakażonych ludzi, co oznacza, że ​​produkcja HD5 w moczu wzrosła wraz z zakażeniem dróg moczowych E. coli.

Wnioski/znaczenie:DEFA5 ulega ekspresji w drogach moczowych u osób niezakażonych. W szczególności HD5 ulega ekspresji w nabłonku dróg moczowych dolnych dróg moczowych oraz w kanalikach zbiorczychnerka. Wraz z infekcją ekspresja HD5 wzrasta wnerka, a poziomy stają się wykrywalne w moczu. Zgodnie z naszą wiedzą, nasze odkrycia są pierwszymi, które mierzą ekspresję i produkcję HD5 w ludzkiej nerce. Co więcej, jest to pierwszy raport, w którym wykryto obecność HD5 w zakażonych próbkach moczu. Nasze wyniki sugerują, że HD5 może odgrywać ważną rolę w utrzymaniu sterylności dróg moczowych.

Skutki uboczne Cistanche i Cistanche tubulosa dlanerkachoroba, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

Wstęp

Układ moczowy, poza ujściem cewki moczowej, jest zwykle jałowy pomimo bliskości flory kałowej. Dokładne mechanizmy, dzięki którym układ moczowy utrzymuje swoją sterylność, nie są dobrze poznane. Proponowane mechanizmy przyczyniające się do obrony dróg moczowych obejmują przepływ moczu, zmiany pH i osmolarności moczu, regularne opróżnianie pęcherza, elementy obrony chemicznej nabłonka dróg moczowych oraz złuszczanie/napływ efektorowych komórek odpornościowych ze stymulacją bakteryjną [1]. Ponadto ostatnio wykazano, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) odgrywają ważną rolę w utrzymaniu sterylności dróg moczowych [2]. AMP, które służą jako naturalne antybiotyki wytwarzane przez prawie wszystkie organizmy, są wszechobecnym składnikiem wrodzonego układu odpornościowego. AMP to cząsteczki kationowe wyrażane przez fagocytarne krwinki białe i komórki nabłonkowe. U ludzi i innych ssaków defensyny są główną rodziną AMP. Defensyny mają zazwyczaj szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym, wirusom, grzybom i pierwotniakom [2,3]. Defensyny są początkowo syntetyzowane jako preproproteiny i poddawane obróbce do dojrzałych, biologicznie czynnych peptydów [4]. U ludzi defensyny są klasyfikowane do jednej z dwóch rodzin w zależności od ich wzorca mostkowania dwusiarczkowego – defensyny alfa lub beta-defensyny [5].

W drogach moczowych beta-defensyny są szeroko wyrażane w nabłonku moczowym. Komórki nabłonkowe wyściełającenerkapętla Henlego, kanalik dystalny i przewód zbiorczy konstytutywnie wyrażają ludzką beta-defensynę 1 (hBD1). Chociaż poziom hBD1 w moczu jest niewystarczający do zabicia inwazyjnych bakterii, hBD1 zapewnia szybko działającą powłokę przeciwdrobnoustrojową światła kanalików i zapobiega infekcji poprzez hamowanie przyczepiania się bakterii do nabłonka dróg moczowych [6]. Ostatnie badania wskazują, że stan redoks hBD1 znacząco wpływa na działanie przeciwdrobnoustrojowe, tak że zredukowany peptyd jest znacznie silniejszy niż utleniona forma z wiązaniami dwusiarczkowymi [7]. Znaczenie tego na powierzchni urotelialnej nie zostało określone. Inna defensyna, ludzka beta-defensyna 2 (hBD2), nie jest konstytutywnie wyrażana w zdrowej tkance nerek; jednak ekspresja hBD2 jest indukowana przez infekcję [8].

W przeciwieństwie do beta-defensyn, rola alfa-defensyn pochodzących z nabłonka nie jest dobrze opisana w drogach moczowych. Ekspresję i funkcję alfa-defensyn HD5 i HD6 opisano głównie w jelicie cienkim, gdzie są one wydzielane przez Panethcells do krypt jelitowych i przyczyniają się do równowagi mikroflory jelitowej [9]. HD5 zlokalizowano również w męskich i żeńskich narządach płciowych, a dowody sugerują, że jest indukowalna i ważna w zwalczaniu infekcji [10,11,12]. HD5 w moczu wykryto u pacjentów, którzy przeszli rekonstrukcję jelita krętego i odprowadzenie moczu do przewodu krętego, przy czym źródło produkcji HD5 przypisuje się przede wszystkim komórkom Panetha z jelita krętego [13,14]. HD5 wykazuje działanie przeciwbakteryjne wobec powszechnie występujących uropatogennych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych [15]. HD5 ma również działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko wirusom uropatogennym, takim jak adenowirus i wirus BK [16,17,18]. W tym badaniu przedstawiamy wstępny opis i ocenę ilościową ekspresji HD5 u człowiekanerkai dalej zdefiniować jego ekspresję w dolnych drogach moczowych podczas bezpłodności i infekcji.

Wyniki

mRNA DEFA5 ulega konstytutywnej ekspresji w ludzkim pęcherzu moczowym, moczowodzie i nerkach

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym pokazuje, że wszystkie badane pęcherze moczowe, moczowód inerkapróbki bez infekcji wyrażały konstytutywnie DEFA5. Ekspresja DEFA5 była znacząco większa w dolnych drogach moczowych niż w górnych drogach moczowych (p= 00,014). W pęcherzu (n=4) średnia ekspresja DEFA5 wynosiła 4656637 transkryptów na 10 ng RNA, a w moczowodzie (n=4) średnia ekspresja DEFA5 wynosiła 41126170 transkryptów na 10 ngRNA (ryc. 1A) . W nerce (n=6) średnia ekspresja DEFA5 wynosiła 29376274 transkryptów na 10 ng RNA. Ekspresję DEFA5 analizowano oddzielnie w korze nerkowej, rdzeniu i miednicy. Ekspresja DEFA5 nie różniła się znacząco w zależności od regionu nerki (p= 0.45).

Ekspresja DEFA5 i ekspresja peptydu HD5 wzrasta wraz z odmiedniczkowym zapaleniem nerek

Analiza ilościowa PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzona w dniutkanki nerek zodmiedniczkowe zapalenie nerek wykazało znaczny wzrost ekspresji DEFA5 w porównaniu z niezakażonymi tkankami nerki. W przypadku odmiedniczkowego zapalenia nerek (n= 6), średnia ekspresja DEFA5 wzrosła do 782961 052 transkryptów na 10 ng RNA (p= 00,019) (Figura 2A).

Aby dalej ocenić ten wzrost ekspresji z odmiedniczkowym zapaleniem nerek, przeprowadziliśmy analizę immunoblot na tym samymnerkatkanka użyta do analizy PCR w czasie rzeczywistym w celu oceny równoczesnego wzrostu produkcji peptydu HD5 (ryc. 2B, panel środkowy). Analiza immunoblottingu z użyciem poliklonalnych surowic odpornościowych HD5 wykazała znacznie większą produkcję peptydu HD5 w tkankach nerek z odmiedniczkowym zapaleniem nerek (n {{5} }) w porównaniu do niezainfekowanychnerkatkanki(n=6). Niezainfekowanynerkatkanki wyrażane 300625 ng HD5/gram mokrej masy tkanki podczasnerkatkanka z odmiedniczkowym zapaleniem nerek eksprymowanym 600621 ng HD5/gram mokrej masy tkanki (p,0,0001). Bloty ponownie sondowano GAPDH, aby służyły jako kontrola obciążenia (Figura 2B, panel środkowy) i przeprowadzono również barwienie srebrem w celu potwierdzenia równego obciążenia białka (Figura 2B, panel górny).

Peptyd HD5 jest produkowany w nerkach i drogach moczowych człowieka

Wykonano immunobarwienie w celu zlokalizowania produkcji HD5 w drogach moczowych. Immunohistochemia (IHC) wykazała, że ​​immunoreaktywność HD5 była obecna w całym urotelium moczowodu i pęcherza moczowego wszystkich badanych próbek (n=4, Ryc. 3). IHC wykazała również, że HD5 był wytwarzany w kanalikach kory i rdzenia nerkowego wszystkich próbki (n= 6, Rysunek 4). Immunofluorescencja (IF) wykazała, że ​​ekspresja HD5 była największa w dystalnym nefronie i kanalikach zbiorczych (Figura 5). Śródmiąższowe i kłębuszki nie wykazywały immunoreaktywności HD5. Barwienie immunologiczne pokazane na Figurach 3, 4 i 5 przeprowadzono przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-HD5 (8C8), które rozpoznaje propeptyd HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Wyniki były podobne przy użyciu króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-HD5, które rozpoznaje propeptyd HD5 i dojrzały peptyd (dane nie pokazane) – co sugeruje, że HD5 jest przechowywany jako propeptyd.

W przypadku odmiedniczkowego zapalenia nerek znacznie wzrosło immunobarwienie HD5. Immunoreaktywność HD5 wzrosła w całym nefronie proksymalnym, dystalnym i kanalikach zbiorczych (ryc. 4 i ryc. 5). Podobnie jak w próbkach niezainfekowanych, kłębuszki i śródmiąższowe nie wykazywały ekspresji HD5 podczas infekcji. Kontrole negatywne nie wykazały immunoreaktywności HD5.

Zakażony ludzki mocz zawiera mierzalne stężenia peptydu HD5

Analiza immunoblot, przy użyciu króliczej poliklonalnej surowicy odpornościowej, która wykrywa prekursor proHD5 i dalej przetworzone postacie, pozwoliła na zidentyfikowanie mierzalnych poziomów HD5 w 13 z 15 badanych próbek moczu zakażonych uropatogennymi bakteriami E.coli (Figura 6A i B). Poziom HD5, znormalizowany do kreatyniny w moczu, jeśli jest obecny, wahał się od 299,8–669.7630 ng HD5/mg Cr w moczu (110,67 ng/ml–276,67 ng/ml), co odpowiada 11,10–27,67 nmol/l. Niezakażone próbki moczu (n=15), HD5 było na poziomie lub poniżej granicy wykrywalności (<50 ng).="" test="" immunoabsorpcji="" enzymatycznej="" (elisa)="" na="" tych="" samych="" próbkach="" moczu,="" przy="" użyciu="" mysiego="" przeciwciała="" monoklonalnego="" (8c8),="" które="" wykrywa="" tylko="" prekursor="" prohd5,="" wykrył="" mierzalne="" poziomy="" prohd5="" w="" 13="" z="" 15="" badanych="" próbek="" zakażonych.="" stężenia="" prohd5="" w="" moczu="" wahały="" się="" od="" 122,78–490,060,03="" ng="" hd5/mg="" cr="" w="" moczu="" (30,02="" ng/ml–200,5="" ng/ml),="" gdy="" były="" obecne="" (ryc.="">

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy wstępną charakterystykę HD5 u człowiekanerka, moczowód i pęcherz. Wykazano, że HD5 jest ważnym AMP, który zapobiega inwazyjnej infekcji w jelicie i jest podwyższony w drogach rodnych podczas infekcji [11,18,19,20,21]. Wykazano, że pochodzące z nabłonka AMP, takie jak HD5, są ważne w utrzymaniu sterylności układu moczowego [8,22,23,24]. Niedobory tych wrodzonych mechanizmów obronnych błony śluzowej mogą skutkować ostrą i/lub przewlekłą infekcją [25,26].

Nasze ilościowe wyniki PCR w czasie rzeczywistym pokazują, że DEFA5 jest konstytutywnie wyrażana u ludzinerki, moczowody i pęcherz. Ekspresja DEFA5 wzrasta od górnych dróg moczowych do dolnych dróg moczowych – zgodnie z przepływem strumienia moczowego i coraz większą bliskością miejsca inwazji mikroflory. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie, w którym oceniano ilościowo ekspresję DEFA5 w ludzkiej nerce i pęcherzu moczowym. Niedawno Townes i wsp. wykazali, że prawidłowy dystalny moczowód może wyrażać DEFA5 [14]. Nasze wyniki sugerują również, że DEFA5 jest konstytutywnie wyrażany przez dystalny moczowód. Chociaż ekspresja DEFA5 w drogach moczowych jest prawie 100-razem niższa niż w tkankach przewodu pokarmowego, podstawowa ekspresja DEFA5 nabłonka dróg moczowych jest porównywalna z ekspresją wcześniej opisanych wzmacniaczy dróg moczowych, takich jak katelicydyna, hBD-1, hBD -2 i rybonukleazę 7[6,8,22,24,27].

W przeciwieństwie do dojrzałego przewodu pokarmowego, w którym DEFA5 jest wyrażana na wysokim poziomie zarówno w stanie zdrowia, jak i infekcji/zapaleniu, nasze ilościowe dane PCR w czasie rzeczywistym wykazują, że ekspresja DEFA5 wnerkajest znacznie podwyższony wraz z infekcją [27,28,29]. Ten indukowalny wzorzec ekspresji jest analogiczny do ekspresji DEFA5 w żeńskim układzie rozrodczym, gdzie ekspresja DEFA5 wzrasta wraz z zapaleniem jajowodów [30]. W drogach moczowych Townes i wsp. wykazali tendencję w kierunku większej moczowodowej ekspresji DEFA5 u pacjentów z ZUM, którzy przeszli odprowadzenie moczu z przewodu krętego [14]

Nasza analiza immunoblot uzupełnia dane PCR w czasie rzeczywistym, wykazując, że produkcja peptydu HD5 wzrasta wraz z odmiedniczkowym zapaleniem nerek. Ten indukowalny wzór wytwarzania HD5 jest podobny do tego obserwowanego u niektórych członków rodziny beta-defensyn. hBD2 wykazuje indukowalny wzór wytwarzania z zakażeniem dróg moczowych i/lub przewlekłym odmiedniczkowym zapaleniem nerek [8,31,32]. Wykazano, że produkcja peptydu HD5 zwiększa się w górnym odcinku żeńskich narządów płciowych i męskiej cewce moczowej z zapaleniem [11,30].

Stosując immunobarwienie, pokazujemy, że HD5 jest równomiernie wytwarzany w nabłonku moczowodu i pęcherza moczowego. Ponieważ zdecydowana większość ZUM wynika z flory kałowej, która wstępuje do pęcherza moczowego, wyniki te sugerują, że ekspresja HD5 występuje w miejscach, w których najczęściej występuje ekspozycja drobnoustrojów [33]. Dlatego HD5 jest idealnie umiejscowiony, aby zapobiegać wznoszącej się infekcji drobnoustrojami. wnerka, HD5 jest produkowany głównie w dystalnym nefronie i kanaliku zbiorczym. Odkrycia te sugerują, że HD5 jest wytwarzany w miejscach, w których będzie miał optymalną aktywność przeciwdrobnoustrojową. Wcześniejsze badania wykazały, że właściwości przeciwdrobnoustrojowe defensyn zależą od stężenia soli – przy czym wyższe stężenia soli zmniejszają aktywność przeciwdrobnoustrojową [23,34,35]. Spekulujemy, że niskie stężenie soli w dystalnych nefronach i kanalikach zbiorczych zapewnia korzystne środowisko dla aktywności przeciwdrobnoustrojowej HD5.

Immunoblot i analiza ELISA wykazują również, że HD5 jest wydzielane do moczu na niskim poziomie. Biorąc pod uwagę wielkość (8,1 kDa i 3,7 kDa) i dodatni ładunek proHD5 oraz w pełni przetworzonego HD5, możliwe jest, że niektóre peptydy HD5 z moczu pochodzą, przynajmniej częściowo, z przesączu osocza. Jednak niewiele jest dowodów sugerujących, że HD5 utrzymuje się w osoczu [27]. Dodatkowo, aby pojawiła się w moczu, HD5 musiałaby wymknąć się wydajnym mechanizmom wchłaniania peptydów w kanaliku proksymalnym [6,36]. Na koniec, użyte próbki moczu poddano wirowaniu przed wykonaniem testów, usuwając komórkowe źródła HD5.

W wykrytych stężeniach jest mało prawdopodobne, aby HD5 w moczu wykazywał bezpośrednie działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko uropatogennym drobnoustrojom, ponieważ w pełni przetworzony HD5 ma minimalne stężenie hamujące (MIC) w zakresie 6–10 mg/ml przeciwko powszechnie występującym Gram-ujemnym bakteriom uropatogennym [15]. Jednak stężenie na powierzchni błony śluzowej będzie prawdopodobnie wyższe. Ponadto analiza immunoblot pokazuje, że stężenia HD5 są znacznie wyższe wnerka. Wyniki te sugerują, że HD5 bierze udział w obronie śluzówki dróg moczowych. Analogiczny wzorzec obserwuje się w przypadku hBD1, gdzie stężenia hBD1 w moczu są niewystarczające do wykazania aktywności przeciwdrobnoustrojowej, ale wyższe stężenia peptydów wykrywa się w pobliżu kanalików nerkowych [6, 31].

Ponieważ IHC pokazuje, że proHD5 jest główną formą HD5 wnerkaa ponieważ zarówno dojrzałe, jak i proHD5 są wykrywane w moczu, spekulujemy, że HD5 jest przede wszystkim wydzielana jako cząsteczka prekursorowa, a następnie przechodzi przetwarzanie proteolityczne w celu wytworzenia postaci dojrzałych – podobnie jak w przewodzie pokarmowym i moczowo-płciowym [11,30,37]. W jelicie cienkim komórki Panetha produkują trypsynę, która rozszczepia propeptyd HD5 tak, że w pełni przetworzony peptyd jest formą dominującą w świetle jelita [37]. W męskiej cewce moczowej kluczowymi enzymami przetwarzającymi i aktywującymi HD5 są proteazy neutrofili, wnoszone przez neutrofile rekrutowane do miejsca infekcji [11]. Wpływ trypsynogenu nabłonkowego, trypsyny moczowej i/lub proteaz neutrofilowych na przetwarzanie HD5 w drogach moczowych podczas infekcji pozostaje do ustalenia. Ponadto do ustalenia pozostaje wpływ zmian w środowisku moczowym na funkcję HD5 (zmiany osmolarności, pH i stężeń kationów).

Podsumowując, jest to pierwsze badanie, w którym zidentyfikowano i oszacowano ekspresję i produkcję HD5 w drogach moczowych. Nasze wyniki sugerują, że HD5 jest AMP pochodzenia nabłonkowego, który może odgrywać ważną rolę we wrodzonej odporności ludzkiego nabłonka dróg moczowych, zapobiegając translokacji inwazyjnych patogenów do krążenia. Wyjaśnienie czynników regulujących produkcję HD5 może dostarczyć nowego wglądu w patogenezę ZUM u pacjentów z ryzykiem ZUM i pacjentów z przewlekłymi zakażeniami.

Metody

Zatwierdzenie badania

Od wszystkich pacjentów biorących udział w tym badaniu uzyskano świadomą pisemną zgodę. W przypadku osób poniżej 18 roku życia uzyskano pisemną zgodę rodziców/opiekunów. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Szpitala Dziecięcego (NCH) zatwierdziła to badanie wraz z procesem uzyskiwania zgody i dokumentami (IRB07-00383).

Próbki tkanek ludzkich i moczu

Niezakażoną tkankę dystalnego moczowodu i pęcherza moczowego (n= 4) uzyskano od dzieci poddanych reimplantacji moczowodu z powodów innych niż nawracające zakażenie. Niezainfekowanynerkapróbki (n=6) otrzymano od pacjentów poddawanych nefrektomii z powodu guzów nerek. Próbki tkanek były wolne od makroskopowych oznak choroby lub zapalenia.Nerkatkanki od pacjentów z przewlekłym odmiedniczkowym zapaleniem nerek zostały dostarczone przez Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Dwóch niezależnych patologów potwierdziło rozpoznanie histopatologiczne odmiedniczkowego zapalenia nerek. Próbki tkanek zostały szybko zamrożone lub zakonserwowane jako skrawki zatopione w parafinie utrwalone w obojętnej formalinie. Wycinki niezainfekowanej tkanki nerki zostały przed przechowywaniem wypreparowane z kory, rdzenia lub miedniczki nerkowej (n=4).

Niezakażone i zakażone próbki moczu pobrano od dzieci zgłaszających się na oddział ratunkowy NCH lub klinikę nefrologiczną. Rozpoznanie ZUM postawiono na podstawie dodatniego posiewu moczu zgodnie z wytycznymi American Academy of Pediatrics Guidelines [39]. Wszystkie zainfekowane próbki moczu zawierały 0,106 CFU/ml E.coli. Wartości pH moczu wahały się od 5,5 do 8,5 (średni mocz 6,9). Nie mierzono składu jonowego moczu. Próbki moczu odwirowano w celu usunięcia osadu moczu i dodano koktajl inhibitora proteazy (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Izolacja kwasu rybonukleinowego i odwrotna transkrypcja

Całkowity RNA wyizolowano z zamrożonej tkanki przy użyciu systemu izolacji PromegaTotal RNA (Promega, Madison, WI, USA). Synteza ForcDNA, 4-8 mg całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji za pomocą odwrotnej transkryptazy Superscript III przy użyciu startera oligo-(dT)12-18 zgodnie z protokołem dostawcy (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Klonowanie plazmidów specyficznych dla genu dla krzywych standardowych

cDNA kodujący DEFA5 i GAPDH wklonowano do wektora plazmidowego 4-Topo (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmidy zsekwencjonowano, aby potwierdzić, że prawidłowa

otrzymano konstrukty. Seryjne rozcieńczenia plazmidów specyficznych dla genu oszacowano ilościowo (przez spektrofotometryczną absorbancję przy 260 i elektroforezę na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny) i zastosowano w PCR w czasie rzeczywistym do wygenerowania krzywych standardowych dla każdej reakcji.

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

Przeprowadzono ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu jednoniciowego cDNA od człowiekanerka, moczowód i tkanka pęcherza moczowego ze specyficznymi parami starterów oligonukleotydowych przy użyciu systemu 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Zaprojektowano startery do łączenia egzonów PCR i potwierdzono sekwencje przy użyciu DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (starter przedni DEFA5 : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 i DEFA5 starter wsteczny 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

W skrócie, cDNA odpowiadające 10 ng RNA służyło jako matryca w 25 ml reakcji zawierającej 2 0 mM każdego startera i 16 mieszanek Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. Warunki PCR były następujące: początkowa denaturacja w 95uC przez 10 minut, a następnie 40 cykli, z każdym cyklem składającym się z denaturacji w 94uC przez 30 sekund, hybrydyzacji w 64uC przez 30 sekund i wydłużania w 72uC przez 30 sekund. Emisję fluorescencji cykl do cyklu monitorowano przy 530 nm i analizowano przy użyciu 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Do każdego zestawu reakcji dołączono wzorce plazmidu specyficzne dla genu. Jako kontrolę pozytywną do każdego zestawu reakcji dołączono końcowe RNA jelita krętego, a wyniki porównano z wcześniej opublikowanymi standardami [27].

Aby potwierdzić amplifikację PCR zamierzonego produktu, reprezentatywną próbkę analizowano przez elektroforezę na 1,5 procentowym żelu agarozowym. Produkty uwidoczniono przez barwienie bromkiem etydyny i porównano ze standardami wielkości DNA w celu potwierdzenia przewidywanej wielkości produktu (nie pokazano). Dodatkowo, na końcu każdej reakcji wyznaczono krzywą profilu temperatury topnienia każdej reakcji PCR.

Przeciwciała HD5

Propeptyd HD5 (AA20-94) i formy częściowo przetworzone (AA36-94 i 56-94) zidentyfikowano przy użyciu dostępnego w handlu mysiego przeciwciała monoklonalnego (8C8) anty-HD5 (Abcam). dojrzały peptyd (AA63-94) zidentyfikowano przy użyciu opisanej wcześniej króliczej poliklonalnej surowicy odpornościowej [13,40].

Immunoblot

Sekcje tego samegonerkapróbki użyte do ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym (3–6 mg mokrej masy) sproszkowano przy użyciu moździerza i tłuczka w ciekłym azocie i rozpuszczono w buforze RIPA z inhibitorami proteazy. Białka moczu wyekstrahowano z próbek moczu przy użyciu zestawu Proteospin™ Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada). Stężenia białka w nerkach i moczu oznaczono ilościowo za pomocą zmodyfikowanego testu Bradforda i potwierdzono za pomocą odczytu OD280 nm. Tkankę nerki lub białko w moczu w równych stężeniach załadowano na 18% gradientowe żele dodecylosiarczanu sodu i poddano elektroforezie. Aby zapewnić równe obciążenie białka, przeprowadzono barwienie srebrem.

Po rozdzieleniu elektroforetycznym białka przeniesiono na membranę nitrocelulozową. Po utrwaleniu za pomocą 00,05% aldehydu glutarowego w TBS, błony blokowano w 5% odtłuszczonym mleku przez 30 do 60 minut i inkubowano przez noc w rozcieńczeniu 1:1 000 króliczej poliklonalnej surowicy odpornościowej HD5 . Po przemyciu, drugorzędowe przeciwciało, antykrólicze IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową, rozcieńczone 1:10 000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), stosowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Immunobloty znerkatkanki sondowano również przeciwciałem anty-GAPDH (Sigma Aldrich) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano z opisanym powyżej przeciwciałem drugorzędowym. Białka wizualizowano stosując system detekcji ECL i błonę chemiluminescencyjną zgodnie z instrukcjami producenta (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

HD5 oznaczono ilościowo przez porównanie uzyskanych intensywności prążków z seryjnym rozcieńczeniem rekombinowanego standardowego białka proHD5 (Peptides International, Louisville, KY, USA).NerkaStężenia HD5 standaryzowano do masy mokrej tkanki. Stężenia HD w moczu 5 podzielono przez kreatyninę w moczu, aby ustalić standaryzowane stosunki HD5-do kreatyniny (mg/mg) w celu uwzględnienia rozcieńczenia moczu. Stężenia kreatyniny w moczu oznaczono za pomocą mikropłytkowego testu kreatyniny Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, USA).

Immunohistochemia

Po odparafinowaniu, nawodnieniu i odzyskaniu antygenu wykonano blok biotynowy i blok białkowy bez surowicy (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Szkiełka inkubowano przez noc w 4uC z monoklonalnym mysim przeciwciałem HD5(8C8) (1:2{{10}}0; Abcam) lub króliczą poliklonalną surowicą odpornościową (1:500), a następnie z zafałszowanymi anty-poliwalentnymi biotynylowanymi przeciwciałami Streptawidyna/HRP (ScyTek Laboratories). Skrawki opracowano przy użyciu 0,1% tetrachlorku diaminobenzydyny z 0,02% nadtlenkiem wodoru i wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Skrawki kontroli negatywnej inkubowano z surowicą nieodporną zamiast przeciwciała HD5.

Immunofluorescencja

Przeprowadzono podwójnie znakowaną immunofluorescencję, aby pomóc zlokalizować ekspresję HD5 wnerka. Kanał zbiorczy był podwójnie znakowany dla głównych komórek kozim przeciwciałem poliklonalnym przeciwko ludzkiej akwaporynie -2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Pętla Henle'a była podwójnie znakowana mysim poliklonalnym przeciwciałem przeciw ludzkiej uromodulinie (Sigma-Aldrich), a kanalik proksymalny był podwójnie znakowany kozim poliklonalną antyludzką akwaporyną -1 (Santa Cruz) [41,42]. Jako przeciwciała drugorzędowe posłużyły rodaminy poliklonalne anty-kozie (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), rodaminy kozie anty-mysie (JacksonImmunoResearch Laboratories) i ośle poliklonalne antykrólicze FITC (Santa Cruz).

Wszystkie sekcje zostały przygotowane w sposób opisany powyżej. Inkubowano je z mieszaniną mysich antysurowic przeciwko HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulinie (1:500), AQP-1 (1:400) w pomieszczeniu temperatura przez 90 minut. Przeciwciało drugorzędowe nakładano przez 90 minut w temperaturze pokojowej i skrawki montowano stosując pożywkę do mocowania z DAPI. Surowicę nieodporną zastosowano jako kontrolę negatywną. Szkiełka zbadano za pomocą mikroskopu aLeica DM4000B i sfotografowano cyfrowo przy użyciu aparatu/oprogramowania Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) mysie przeciwciało monoklonalne przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dodawano streptawidynę-peroksydazę chrzanową (Biolegend, San Diego CA, USA) na 30 minut. Po inkubacji z roztworem substratu TMB przez 15 minut (Kem-En-Tec Diagnostics), reakcję zakończono roztworem STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) i odczytano przy długości fali 450 nm. Stężenia HD5 z testu ELISA podzielono przez kreatyninę w moczu w celu ustalenia standaryzowanych stosunków HD5-do kreatyniny w moczu (mg/mg), aby uwzględnić rozcieńczenie moczu, jak opisano powyżej.

Bibliografia

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Aktualne koncepcje molekularnych mechanizmów obronnych działających podczas infekcji dróg moczowych. Europejskie czasopismo badań klinicznych 38 Suppl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Peptydy przeciwdrobnoustrojowe, odporność wrodzona i normalnie sterylny układ moczowy. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensins: przeciwdrobnoustrojowe i cytotoksyczne peptydy komórek ssaków. Annu Rev Immunol 11: 105-128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Potranslacyjne przetwarzanie defensyn w niedojrzałych ludzkich komórkach szpikowych. Krew 79: 1538-1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Ludzka beta-defensyna-1 i alfa-defensyny są kodowane przez sąsiednie geny: dwie rodziny peptydów o różnej topologii dwusiarczkowej mają wspólnego przodka. Genomika 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr. i in. (1998) Ludzka beta-defensyna-1: peptyd przeciwdrobnoustrojowy tkanek układu moczowo-płciowego. J Clin Invest 101: 1633-1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Redukcja wiązań dwusiarczkowych demaskuje silne działanie przeciwdrobnoustrojowe ludzkiej beta-defensyny 1. Nature 469: 419-423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Ekspresja ludzkich beta-defensyn 1 i 2 w nerkach z przewlekłą infekcją bakteryjną. BMC Infect Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Defensyny komórek Panetha: kluczowe cząsteczki efektorowe odporności wrodzonej. Transakcje Towarzystwa Biochemicznego 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C i in. (1998) Ekspresja genów, immunolokalizacja i wydzielanie ludzkiej defensyny-5 w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym. Am J Pathol 152: 1247-1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Wyraźne profile defensyn w Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis urethritis ujawniają nowe interakcje między komórkami nabłonka i neutrofilami. Infect Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Ekspresja defensyn przeciwdrobnoustrojowych w męskim układzie rozrodczym szczurów, myszy i ludzi. Biologia reprodukcji 68: 95–104.

13. Porter EM, Polacy MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Izolacja ludzkich defensyn jelitowych z moczu z jelita krętego. FEBS Listy 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Tolerancja bakteriomoczu po odprowadzeniu moczu jest powiązana z aktywnością peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Urologia 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Aktywność przeciwbakteryjna i mechanizm rekombinacji ludzkiej alfa defensyny 5 wobec klinicznych szczepów opornych na antybiotyki. Afr J Microbiol Res 4: 626-633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Defensyny nabłonkowe upośledzają infekcję adenowirusową: implikacja dla terapii genowej za pośrednictwem adenowirusa. Terapia genowa człowieka 10: 957-964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mechanizm neutralizacji adenowirusa przez ludzkie alfa-defensyny. Gospodarz komórkowy i drobnoustrój 3: 11-19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K i in. (2008) Ludzkie alfa-defensyny hamują infekcję wirusem BK poprzez agregację wirionów i blokowanie wiązania z komórkami gospodarza. Dziennik chemii biologicznej 283: 31125-31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF i in. (2009) Badanie odporności miejscowej infekcji dolnych dróg rodnych. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Wrodzona i wczesna odpowiedź immunologiczna na prowokację patogenem w żeńskich narządach płciowych oraz kluczowa rola komórek nabłonkowych. Journal of reprodukcyjnej immunologii 57: 61-79.