Cistanche Herba ma działanie przeciwdepresyjne w przewlekłym, nieprzewidywalnym stresie
Mar 20, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Yang Li i inni
ABSTRAKCYJNY
Niedawno potwierdzono, że Cistanche tubulosa, jeden z gatunków Cistanches Herba, ma działanie przeciwdepresyjne u szczurów z przewlekłym, nieprzewidywalnym stresem (CUS) poprzez przywrócenie homeostazy mikroflory jelitowej. W tym artykule zamierzamy zbadać profil metaboliczny C. tubulosa u szczurów modelowych z depresją normalną i indukowaną przez CUS in vitro i in vivo. Za pomocą UPLC-Q-TOF-MS, metabolizm przewodu pokarmowego in vitroEkstrakt z Cistanche tubulosa(CTE) oceniano zarówno na szczurach normalnych, jak i CUS. Jednocześnie metabolizm in vivo CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)u zdrowych szczurów iz depresją badano również mocz i kał szczurów. W sumie 20 i 26 metabolitów scharakteryzowano na podstawie metabolizmu in vitro i in vivo odpowiednio u szczurów zdrowych i CUS. CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)był metabolizowany do aglikonów i produktów degradacji glikozydów fenyloetanoidowych (PhG) i glikozydów irydowych, zarówno przez normalną, jak i obniżoną mikroflorę jelitową szczura in vitro. Metabolity fazy II aglikonów i produkty degradacji PhG oraz glikozydy irydoidalne były głównymi metabolitami w moczu i kale szczurów. Dodatkowo, zdolność metaboliczna do generowania wtórnych glikozydów i aglikonów w depresyjnej mikroflorze jelitowej szczura była znacznie słabsza niż w normalnej mikroflorze jelitowej szczura, co przypisano nieuporządkowanym hydrolazom glikozydowym wytwarzanym przez mikroflorę jelitową szczurów z depresją CUS. Wyniki tego badania położyły podwaliny pod zrozumienie procesu metabolicznego i mechanizmu terapeutycznego właściwości przeciwdepresyjnych CTE.
Słowa kluczowe: Cistanche tubulosa, DepresjaMetabolizm, In vitro, In vivo, Mikrobiota jelitowa
1. Wstęp
Cistanches Herba jest oficjalnie uznawana za suszone, soczyste pędy Cistanche deserticola (YC Ma) i C. tubulosa (Schrenk), które stosuje się w leczeniu niewydolności nerek, impotencji, bezpłodności u kobiet, pomoru, obfitego krwotoku macicznego i zaparć starczych [1]. Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że Cistanches Herba wykazuje różne działania biologiczne, takie jak przeciwdziałanie neurodegeneracji, immunoregulacja i działanie przeciwzapalne [2,3]. Nasze poprzednie dochodzenia to potwierdziłyEkstrakt z Cistanche tubulosa(CTE), który składa się z 48,6% glikozydów fenyletanowych (PhG), 6,9% glikozydów irydowych i 200,0% całkowitych sacharydów, może znacząco złagodzić objawy depresyjne wywołanych przez przewlekły, nieprzewidywalny stres (CUS) szczurów depresyjnych poprzez przywrócenie homeostazy mikroflory jelitowej [4]. Ostatnie badania wskazują, że zmiany w składzie mikroflory jelitowej były związane z rozwojem i progresją depresji [5,6]. Względna liczebność rodzajów drobnoustrojów była znacznie zaburzona u szczurów z modelem CUS z depresją w porównaniu z normalną kontrolą [7]. U pacjentów z depresją różnorodność i bogactwo mikroflory jelitowej również uległy istotnej zmianie [8]. Ponadto za główne składniki Cistanches Herba uznano różne związki, w tym glikozydy fenyloetanoidowe (PhG) i glikozydy irydowe [2,3], które były łatwo metabolizowane do drugorzędowych glikozydów i aglikonów, w tym hydroksytyrozolu (HT), 3,4-dihydroksyfenetylu glikozydy, deglikozylowany kwas genipozydowy itp. przez ludzką mikrobiotę jelitową. Metabolity te są łatwiej wchłaniane przez jelita i wykazują aktywność biologiczną zgodną ze składnikiem prototypowym [9–11]. Uważamy zatem, że w trakcie występowania i rozwoju depresji zaburzenia struktury mikroflory jelitowej nieuchronnie wpływają na metabolizm doustnych tradycyjnych leków chińskich (TCM) w przewodzie pokarmowym, a także wpływają na stan fizjologiczny żywiciela. Większość istniejących danych dotyczących metabolizmu Cistanches Herba pochodzi z badań metabolicznych na zdrowych zwierzętach[12–15]. W związku z tym bardziej istotne byłoby zbadanie profilu metabolicznego CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w stanie patologicznym w wyjaśnieniu jego bioaktywnych składników i zrozumieniu mechanizmu działania na jego skuteczność przeciwdepresyjną.
W obecnym badaniu dążymy do scharakteryzowania profili metabolicznych CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)zarówno u zdrowych, jak i wywołanych przez CUS szczurów z depresją za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej kwadrupolowej spektrometrii masowej czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS). Sok żołądkowy, płyn jelitowy i mikroflora normalnych i depresyjnych szczurów patologicznych zostały wykorzystane do symulacji procesu metabolicznego CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w przewodzie pokarmowym in vitro,niezależnie i sekwencyjnie. Metabolity in vivo są również wyjaśniane po doustnym podaniu CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)u szczurów normalnych i CUS. Badanie to dostarcza nowych informacji na temat metabolizmu i aktywnych metabolitów CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)na depresję.
2. Materiał i metody
2.1. Materiał
Suszone łodygi C. tubulosa zebrano w powiecie Hetian (Xinjiang, Chiny). Próbki kuponów zostały uwierzytelnione przez prof. Xiaobo Li i zdeponowane w zielniku Szkoły Farmacji na Uniwersytecie Jiao Tong w Szanghaju (Szanghaj, Chiny). Zastosowano metodę ekstrakcji zgodnie z naszą poprzednią publikacją [4]. TheEkstrakt z Cistanche tubulosaPróbki (CTE) przechowywano w 4 stopniach i ponownie rozpuszczano w sterylnej wodzie przed użyciem. Sterylne roztwory wodne CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)próbki następnie przefiltrowano przez membranę 0.22 μm, a filtraty zebrano w sterylnych probówkach.
Echinakozyd został dostarczony przez laboratorium dr Pengfei Tu, PekingUniversity (Pekin, Chiny). Akteozyd, izoakteozyd, 2'-acetyloakteozyd i cistanozyd A zakupiono w Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Chiny). Hydroksytyrozol, kwas kawowy, kwas 3,4-dihydroksybenzenopropionowy, kwas 3-hydroksyfenylopropionowy i kwas 3-fenylopropionowy zakupiono od Aladdin Industrial Inc. (Szanghai Chiny). Czystość każdego składnika określono na >95 procent metodą HPLC-UV. Acetonitryl o czystości do HPLC zakupiono w firmie Merck (Darmstadt, Niemcy). Wodę dejonizowaną przygotowano z wody destylowanej przy użyciu systemu oczyszczania wody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Wszystkie inne użyte odczynniki i chemikalia były klasy analitycznej.
2.2. Eksperymenty na zwierzętach
Samce szczurów Sprague-Dawley (200 ± 20 g) pozyskano z Pekinu Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pekin, Chiny) i umieszczono w Laboratory Animal Center na Shanghai JiaoTong University (Szanghaj, Chiny). Zwierzęta trzymano grupowo w kontrolowanej temperaturze pokojowej (25 ± 2 stopnie, 55 ± 10% wilgotności względnej) z 12:12 godzinnym cyklem światło-ciemność. Szczury miały swobodny dostęp do zwykłej karmy dla szczurów laboratoryjnych i wody przez 1 tydzień. Obiekty dla zwierząt i protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju (Szanghaj, Chiny).
Po tygodniowej aklimatyzacji dwanaście naiwnych szczurów zostało losowo podzielonych na dwie grupy (n=6), grupę kontrolną i grupę przewlekłego nieprzewidywalnego stresu (CUS). Szczury CUS zostały opracowane tak jak w naszym poprzednim raporcie [4], które były poddawane różnym stresorom: biały szum (100 dB) przez 1 h, nocne oświetlenie stroboskopowe o niskiej intensywności (120 błysków/min), pozbawienie wody przez 24 h, puste butelki na wodę na 1 h (po pozbawieniu wody), pozbawienie pokarmu na 24 h, fizyczne ograniczenie (1−2 h), wymuszone pływanie (5 min), zabrudzona klatka na 24 h (200 ml wody na 100 g ściółki z trocin), szczypanie ogona ( 1 min), wstrząs przez 30 min, przechylenie klatki 45 stopni przez 24 godziny i nocne naświetlanie (12 godzin). Stresory stosowano w sposób ciągły i losowy przez 4 tygodnie, szczegółowe rozmieszczenie opisano w Tabeli S1. Po 4 tygodniach stresu przeprowadzono test preferencji sacharozy, test otwartego pola i test żywienia z supresją nowości, jak opisano wcześniej [4]. Zarys CUS i test behawioralny pokazano na rys. S1. Po testach behawioralnych od każdego szczura pobrano co najmniej 4 peletki kałowe i umieszczono je w sterylnych probówkach stożkowych do analizy in vitro CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)metabolizm.
2.3. Metabolizm żołądkowo-jelitowy CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez szczura normalnego i szczura CUS in vitro
2.3.1. Metabolizm CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w symulowanych sokach żołądkowych i jelitowych
Pięćdziesiąt miligramów CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)dodano odpowiednio do 10 ml symulowanego soku żołądkowego i jelitowego. Następnie CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 godziny w soku żołądkowym i 6 godzin w soku jelitowym. Hodowaną mieszaninę (1 ml) zgaszono 3 ml nasyconego wodą n-butanolu natychmiast po 0 i 4 godz. w soku żołądkowym oraz po 0 i 6 godz. w soku jelitowym. Zastosowana metoda przetwarzania próbki była taka, jak opisano wcześniej [9].
2.3.2. Metabolizm CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez normalną i CUS mikrobiotę jelitową szczura
Świeże próbki kału szczurów normalnych i CUS najpierw zmieszano i homogenizowano z 25-krotną objętością bulionu GAM. Osady usunięto przez filtrację przez trzy kawałki gazy. Zawiesinę następnie inkubowano w temperaturze 37 stopni w inkubatorze beztlenowym, w którym powietrze zastąpiono mieszaniną gazów (H2 5 procent, CO2 10 procent, N2 85 procent). Pięćdziesiąt miligramów CTE dodano oddzielnie do 5 ml normalnej i szczurzej zawiesiny kałowej z CUS i zawiesinę inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 48 godzin. Hodowaną mieszaninę usunięto i wyekstrahowano n-butanolem nasyconym wodą w 0, 12, 24 i 48 godz. Sposób przetwarzania próbki został wcześniej opisany [9].
2.3.3. Sekwencyjny metabolizm CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez sok żołądkowy, sok jelitowy, normalną i CUS mikrobiotę jelitową szczura
Po pierwsze 100 mg CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)dodano do 1{{10}} ml symulowanego soku żołądkowego i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 4 godziny. Całą reakcję wygaszono 3 razy objętością n-butanolu nasyconego wodą i odwirowano przy 3000 obr./min przez 15 min, a następnie odparowano supernatant pod strumieniem azotu gaz w temperaturze 37 stopni . Następnie pozostałość ponownie rozpuszczono w 0,4 ml sterylnej wody, dodano do 8 ml symulowanego soku jelitowego i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 6 godzin. W ten sam sposób przygotowano próbkę z sokiem żołądkowym. Na koniec pozostałość ponownie rozpuszczono w 0,3 ml sterylnej wody, dodano odpowiednio do 6 ml zawiesiny kałowej szczurów normalnych i CUS i inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin w anaerobicynkubatorze. Jeden mililitr reakcji został wygaszony 3 ml nasyconego wodą n-butanolu natychmiast po 0 i 4 godzinach w soku żołądkowym, w 0 i 6 godzinach w soku jelitowym oraz po 0, 12, 24 i 48 godzinach w mikrobiocie jelit szczura . Próbka została przetworzona identycznie CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w symulowanym soku żołądkowym.
2.4. Metabolizm CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez szczura normalnego i CUS in vivo
Każdy szczur z dwóch grup był następnie trzymany w indywidualnej klatce metabolicznej. Po całonocnym poszczeniu, które umożliwiało jedynie swobodny dostęp do wody, wszystkim szczurom podawano doustnie 2 ml wody przez sondę żołądkową. Próbki ślepej próby moczu i kału pobrano od wszystkich szczurów od 0 godziny do 12 godziny. Dalej, CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) podano przez zgłębnik. Próbki moczu i kału pobierano od 0 do 24 godzin. Wszystkie próbki moczu i kału natychmiast przechowywano w temperaturze -80 stopni.
Próbki moczu i kału od szczurów zdrowych i CUS poddano wstępnej obróbce zgodnie z wcześniejszym opisem [12]. Wszystkie otrzymane próbki analizowano za pomocą UPLC-Q-TOF-MS.
2.5. Metoda analityczna
UPLC przeprowadzono na systemie Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) z kolumną ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) przez elucję gradientową przy użyciu {{10},1% kwasu mrówkowego acetonitrylu (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (B) przy szybkości przepływu 0,4 ml/min . Profil gradientu wynosił: 0–5 min (A: 5–20 proc.), 5–7,5 min (A: 20–30 proc.), 7,5–10 min (A: 30–70 proc.), 10–11 min (A : 70–100 procent) i odbyło się przez 1,5 min. Gradient przywrócono do 5 procent w 0,5 min i utrzymywano przez 2,5 min do następnego przebiegu. Objętość wstrzyknięcia wynosiła 3 µl. Temperaturę pieca kolumnowego ustawiono na 35 stopni .
Spektrometrię mas przeprowadzono przy użyciu spektrometru masowego Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Jonizację przeprowadzono w trybie ujemnego elektrorozpylania (ESI−). Parametry MS były następujące: napięcie kapilarne, -2.0 kV; napięcie stożka, 20 V; temperatura źródła, 120 stopni ; temperatura desolwatacji, 500 stopni; przepływy gazu stożka i desolwatacji, odpowiednio, 50 i 1000 l/h. Do dokładnego pomiaru masy zastosowano leucynę-enkefalinę jako masę blokującą do wygenerowania jonu [M–H]− (m/z 554,2615). Eksperyment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) w dwóch funkcjach skanowania przeprowadzono w następujący sposób: funkcja 1 (niska energia): m/z 50–1000, czas skanowania 0,25 s, opóźnienie między skanami 0,02 s, energia zderzeń 6 eV; funkcja 2 (wysoka energia): m/z50–1000, czas skanowania 0,25 s, opóźnienie między skanami 0,02 s, rampa energii kolizji 20–45 eV.
2.6. Przetwarzanie danych
Dane zostały przetworzone przy użyciu oprogramowania UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) w celu identyfikacji metabolitów w ramach dokładnych danych surowych pełnego skanowania zebranych przez MSE. Związki zidentyfikowano na podstawie dokładnej masy, fragmentów w wysokoenergetycznej spektrometrii masowej. Próg intensywności ustawiono na 100,0 zliczeń. Identyfikacja celu, tolerancja dopasowania fragmentów i inne parametry zostały ustawione automatycznie.
3. Wyniki
3.1. Zmiany behawioralne u szczura z depresją wywołaną CUS
Szczury z objawami depresji wywołanymi przez CUS oceniano za pomocą testów behawioralnych, w tym testu preferencji sacharozy, testu otwartego pola i testu tłumienia pokarmu. Test t-Studenta wykazał, że preferencje sacharozy w teście preferencji sacharozy (p < 0,001),="" całkowity="" dystans="" pokonany="" w="" teście="" otwartego="" pola="" (p="">< 0,001)="" oraz="" opóźnienie="" jedzenia="" w="" teście="" z="" tłumieniem="" karmienia="" (p="">< 0,01)="" były="" istotnie="" inne="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" kontrolną="" po="" 4-tygodniowym="" leczeniu="" cus="" (ryc.="" 1).="" odkrycia="" te="" wskazują,="" że="" udało="" się="" opracować="" model="" przewlekłego,="" nieprzewidywalnego="">
3.2. Charakterystyka składników chemicznych CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)
Kompleksowa analiza prototypowych składników CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)został przeprowadzony przez UPLC-Q-TOF-MS. Łącznie 27 składników z CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)zostały wykryte i wstępnie scharakteryzowane, w tym 20 PhG, 5 irydoidów i glikozydów irydoidowych oraz 2 oligosacharydy. Szczegółowe informacje, w tym czas retencji, dokładne jony fragmentów MS i MS/MS, są wymienione w informacjach pomocniczych (tabela S2), aby zapewnić wgląd w strukturę tych składników chemicznych. UPLC-Q-TOF-MS całkowity chromatogram jonowy (TIC) CTE pokazano na ryc. S2.
3.3. Metabolizm żołądkowo-jelitowy CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez szczura normalnego i szczura CUS in vitro
W tym badaniu potencjalne metabolity CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez normalne i CUSszczury in vitro zostały wykryte z TIC i zidentyfikowane za pomocą kombinacji składu pierwiastkowego i widm masowych fragmentów MS/MS po porównaniu ich z próbkami kontrolnymi. Wszystkie metabolity z CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w symulowanym soku żołądkowym i jelitowym mikroflorę jelitową szczura normalnego i CUS wymieniono w tabeli 1.
3.3.1. Metabolizm CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w symulowanych sokach żołądkowych i jelitowych
Siedem metabolitów CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w symulowanym soku żołądkowym wstępnie zidentyfikowano na podstawie dokładnej masy i informacji o fragmencie MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12,2,36 min), M5 (m/z 445.1715, C20H30O11, 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20,4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 min) i M18 (m/z623 .1968, C29H36O15, 5,81 min). Za główne szlaki metaboliczne CTE w soku żołądkowym uznano deglikozylację, dehydroksylację, odwodornienie i izomeryzację. Stwierdzono, że M4 i M5 mają masę cząsteczkową o 2 Da i 16 Da mniejszą niż ich prototypowy składnik, dekafeoilakteozyd, a zatem zidentyfikowano je odpowiednio jako produkty odwodornione i odhydroksylowane. M12 zidentyfikowano jako izomer echinakozydu, wytwarzający te same jony co echinakozyd przy m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.
Te same metabolity wykryto po CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)inkubacja w soku jelitowym. Warto zauważyć, że grupa kofeoilowa w pozycji C-6′ w PhG była łatwo metabolizowana przez enzymy trawienne w soku jelitowym w celu wytworzenia metabolitów bezkofeilowych i kwasu kawowego.
3.3.2. Metabolizm CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez normalną i CUS mikrobiotę jelitową szczura
W sumie 20 metabolitów biotransformowanych z CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w prawidłowej mikroflorze jelit szczura zostały wykryte i zidentyfikowane (ryc. 2). Na podstawie wyników zaobserwowano, że PhG uległy degradacji do hydroksytyrozolu aglikonu (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) i kwasu kawowego (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), a następnie zostały następnie zmetabolizowane do M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4,4,35 min) i M11 (m/z 165,0552 , C9H10O3, 4,36 min) poprzez dehydroksylację, redukcję i metylację. Ponadto centralne szlaki metaboliczne, które wytwarzają bezpośrednie metabolity prototypowych związków PhG z CTE w normalnej mikroflorze jelitowej szczurów, to redukcja, metoksylacja, deglikozylacja, dekafeoil, dehydrogenacja i izomeryzacja.
Po inkubacji w depresji indukowanej CUS mikrobiota jelitowa szczura, CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)został przekształcony w 20 metabolitów przez te same szlaki metaboliczne, co normalne szczury.
3.3.3. Sekwencyjny metabolizm CTE przez sok żołądkowy, sok jelitowy, normalną i CUS mikrobiotę jelitową szczura
Po sekwencyjnej inkubacji w soku żołądkowym, soku jelitowym, mikroflorze jelitowej szczura normalnej i CUS, CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)był metabolizowany do 14 metabolitów (w tym 8 z sokiem żołądkowym, 7 z sokiem jelitowym, 11 z normalnym i 10 z mikrobiotą jelitową szczura CUS). Wśród nich M2(HT) i M11 (kwas 3-hydroksyfenylopropionowy, 3-HPP) były końcowymi metabolitami PhG po sekwencyjnej inkubacji CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w soku żołądkowym, soku jelitowym i mikrobiocie jelitowej. Nie było znaczącej różnicy w metabolitach między szczurami normalnymi i CUS.
M8, M9, M14, M17, M19 i M20 były wykrywane tylko w niezależnym metabolizmie CTE przez normalną i CUS mikrobiotę jelitową szczura. Te metabolity były głównie produktami pośrednimi metabolizmu, które zostały całkowicie zmetabolizowane do końcowych metabolitów w badaniu sekwencyjnego metabolizmu CTE i dlatego są trudne do wykrycia.
3.3.4. Różnice między tempem metabolizmu CTE przez prawidłową i CUS mikroflorę jelitową
Wyjaśnienie różnic między tempem metabolizmu CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez normalną i CUS mikroflorę jelitową szczura, względną zawartość 27 związków prototypowych i 20 metabolitów po inkubacji z sokiem żołądkowym, sokiem jelitowym, normalną i CUS mikroflorą jelitową szczura określano oddzielnie i sekwencyjnie (tabele S3 i S4). Wyniki wskazały, że chociaż nie było istotnych różnic między CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)metabolitów szczurów normalnych i depresyjnych, zaobserwowano istotną różnicę w ich szybkościach metabolizmu. Na przykład C2 i C5 zostały zidentyfikowane jako kwas 8-epiloganowy lub jego izomer. Zostały one całkowicie zmetabolizowane w normalnych próbkach w ciągu 12 godzin inkubacji. Jednak w patologicznie obniżonej mikroflorze jelitowej szczura były one całkowicie metabolizowane po 48 godzinach inkubacji. Było oczywiste, że tempo metabolizmu u normalnego szczura było szybsze niż u szczura CUS. Podobne wyniki odkryto dla C18 (izoakteozyd). Ponadto warto zauważyć, że powierzchnia piku M12 (izomeryzacja echinakozydu) i M16 (izomeryzacja tubulozydu A) w próbkach normalnych była znacznie większa niż w próbkach CUS, co wskazuje, że reakcja izomeryzacji CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)był bardziej rozpowszechniony w normalnej mikrobiocie jelitowej szczura w depresji mikrobiota jelitowa szczura.
3.4. Metabolizm CTE przez szczury normalne i CUS in vivo
Porównując próbki biologiczne z grupy traktowanej CTE ze ślepą próbą biologiczną, łącznie 26 metabolitów (związek 1–26) CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)wykryto szczury nienormalne i CUS (Tabela 2). Typowe chromatogramy UPLC próbek moczu szczurów normalnych i CUS przedstawiono na ryc. 3.
3.4.1. Charakterystyka metabolitów CTE u szczurów zdrowych i CUS
Łącznie 18 metabolitów in vivo CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w próbkach moczu normalnych szczurów zostały wstępnie zidentyfikowane. Metabolity degradacji PhG, w tym HT i CA, oraz ich dalsze siarczanowanie (związek 1, 2, 3, 5, 8 i 16), metabolity metylacji (6, 21, 22 i 24) i metoksylacji (13 i 14) były metabolitami główne metabolity w normalnym moczu szczurów. Glikozydy irydoidowe były łatwo metabolizowane do aglikonów (23, 25 i 26) poprzez deglikozylację. Warto zauważyć, że w próbce moczu normalnego szczura nie wykryto żadnego prototypowego składnika.
W depresyjnej próbce moczu szczura 22 metabolity CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)zostały wykryte i scharakteryzowane. W patologicznym moczu szczura wykryto jeden prototypowy związek, kwas 8-epiloganowy. Inne metabolity były zgodne z tymi występującymi w normalnym moczu szczurów, w tym metabolity siarczanowane (1, 2, 3, 8, 10 i 16), metabolity metylowane (6, 11, 19 i 22), metabolity metoksylowane (13 i 14). HT i CA oraz teaglikony glikozydów irydowych (25 i 26).
3.4.2. Charakterystyka metabolitów CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)w kale szczurów normalnych i CUS
W tym badaniu tylko jeden metabolit (związek 20, 3-HPP) CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)został zidentyfikowany w normalnym kale szczurów. Większość PhG została najpierw zdegradowana do CA, a następnie przeszła dalszy metabolizm do głównego metabolitu mikrobiologicznego, 3-HPP. W próbce kału od szczura CUS wstępnie scharakteryzowano 3 metabolity, w tym siarczanowany 3-HPP (związek 16) i siarczanowany HT (związki 2 i 3).
3.4.3. Różnice między metabolitami in vivo CTE u normalnych i CUSszczurów
Po podaniu doustnym CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)metabolity in vivo wykazały wyraźne różnice u zdrowych i depresyjnych szczurów modelowych. 21 metabolitów (związki 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 i 19–26) wykryto zarówno w próbkach zdrowych szczurów, jak i CUS. Związek 23 (kwas deglikozylowany genipozydowy) został zidentyfikowany tylko w próbkach zdrowych szczurów, natomiast związki 4 (HT), 7 (kwas 8-epiloganowy), 15 (3, 4-kwas dihydroksybenzenopropionowy) i 18 ({{ 19}}Sprzęganie glukuronidowe HPP) wykryto tylko w próbkach szczurzych z modelu CUS. Podsumowując, składniki prototypu wykryto tylko u szczurów CUS, podczas gdy więcej metabolitów fazy II wykryto u zdrowych szczurów.
4. Dyskusja
W tym badaniu, niezależnie i sekwencyjnie, zastosowano trzy modele inkubacji in vitro, w tym sok żołądkowy, sok jelitowy, normalną i CUS mikrobiotę jelitową szczura, aby zbadać profil metaboliczny przewodu pokarmowego CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)in vitro. Stwierdzono, że PhGs i glikozydy irydoidalne w CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)były łatwo metabolizowane do drugorzędowych glikozydów i aglikonów przez indukowaną przez CUS depresyjną mikrobiotę jelitową szczura. Następnie metabolizm in vivo CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)u normalnych i CUS szczurów również sprawdzono. Proponowane szlaki metaboliczne dla CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)u zdrowych i wywołanych przez CUS depresyjnych szczurów pokazano na ryc. 4. PhG, takie jak echinakozyd i akteozyd, były metabolizowane do HT i CA, a CA podlegał dalszemu metabolizmowi do swojego głównego metabolitu mikrobiologicznego, 3-HPP. HT, CA i 3-HPP zostały następnie zmetabolizowane do ich siarczanowanych, metylowanych i metoksylowanych metabolitów. Glikozydy irydoidalne, w tym kwas genipozydowy, kankanoside A i kankanoside N, zostały zmetabolizowane do ich aglikonów poprzez deglikozylację. To dodatkowo pokazało, że PhG i glikozydy irydoidalne w CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)były łatwo metabolizowane do drugorzędowych glikozydów i aglikonów u szczurów CUS. Te metabolity zwykle wykazują lepsze wchłanianie jelitowe i biodostępność, aby dalej wchłaniać się do krwi, aby wykazywać aktywność biologiczną [16–18]. Warto zauważyć, że izomeryzacja była powszechna w przypadku PhG w przewodzie pokarmowym, odpowiednie metabolity zidentyfikowano po porównaniu z czasem retencji UPLC ich związków prototypowych w oparciu o zoptymalizowany profil idealnego gradientu UPLC.
Kwas kawowy był głównym produktem degradacji CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)przez depresyjną patologiczną mikrobiotę jelitową szczura. Wcześniejsze publikacje donosiły, że kwas kawowy wywołuje działanie przeciwdepresyjne w teście wymuszonego pływania u myszy. Zarówno poziom mRNA neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) w korze czołowej, jak i poziom mRNA TrkB w jądrze migdałowatym uległ znacznemu obniżeniu po teście wymuszonego pływania, a ten pierwszy spadek został znacząco zahamowany przez kwas kawowy [19]. Hydroksytyrozol był aglikonem PhG, który chroni neurogenezę i funkcje poznawcze poprzez zapobieganie indukowanej stresem regulacji w dół białka BDNF [20]. Dlatego należy zwrócić większą uwagę na niektóre bioaktywne metabolity (tj. HT i CA) przekształcane przez mikrobiotę jelitową po podaniu doustnym.
Ponadto, niniejsze odkrycia dostarczają dowodów na to, że w przypadku depresyjnej mikroflory jelitowej szczurów zdolność metaboliczna do wytwarzania wtórnych glikozydów i aglikonów była znacznie słabsza niż w przypadku nieprawidłowej mikroflory jelitowej szczurów. Przyczyną jest prawdopodobnie wywołane depresją zmiany strukturalne mikroflory jelitowej, które prowadzą do zmniejszenia aktywności enzymów metabolicznych wytwarzanych przez mikrobiotę jelitową [21]. Co ciekawe, wcześniejsze badania wykazały, że gromada Bacteroidetes koduje najobficiej występujące geny hydrolazy glikozydowej i liazy polisacharydowej odpowiedzialne za hydrolizę glikozydów i rozkład węglowodanów złożonych z mechanizmem eliminacji [22]. W szczególności Bacteroides spp. w tym B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis i B. ksylanisolwy wykazały dominującą całkowitą liczbę genów kodujących GHs i PLs. Te same cechy posiada również Parabacteroides distasonis [22]. Nasze wcześniejsze badania potwierdziły, że 28-dzienna, nieprzewidywalna stymulacja stresowa zmniejszyła względną obfitość rodzajów Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas i Weissella, podczas gdy zwiększyła Ruminococcus i Deinococcus u szczurów [4]. Warto zauważyć, że Bacteroides i Parabacteroides były dwoma najliczniejszymi taksonami drobnoustrojów, które stanowiły około 20 procent względnej obfitości u normalnych szczurów. Po leczeniu CUS względna liczebność Bacteroides i Parabacteroides gwałtownie spadła do około 5% u szczurów z depresją. W związku z tym nieuchronnie prowadzi to do zmniejszenia całkowitej liczby enzymów GH i PL u szczurów CUS i dalej zaburza reakcję deglikozylowaną przez depresyjną mikroflorę jelitową CUS po doustnym podaniu CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)u modelowych szczurów.
5. Wniosek
W niniejszym badaniu opracowano i zastosowano technikę UPLC-Q-TOF-MS do badań przesiewowych i identyfikacji metabolitówWyciąg z kanalików Cistancheu normalnych szczurów i szczurów z depresją CUS in vitro i in vivo. Wyniki wykazały, że CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)był metabolizowany do aglikonów i produktów degradacji PhG i glikozydów irydoidowych zarówno przez zdrową, jak i przygnębioną mikrobiotę jelitową szczura. Po podaniu doustnym CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)metabolity fazy II aglikonów i produkty degradacji PhG i glikozydów irydoidowych wykryto głównie w moczu szczurów. Zdolność metaboliczna do wytwarzania wtórnych glikozydów i aglikonów w depresyjnej mikroflorze jelitowej szczura była znacznie słabsza niż w mikroflorze jelitowej normalnego szczura, co przypisywano zaburzonym glikozydomhydrolazom wytwarzanym przez mikroflorę jelitową szczurów z depresją CUS. rozwój CTE(ekstrakt z Cistanche tubulosa)jako potencjalny lek przeciwdepresyjny.
Podziękowanie
Praca ta została wsparta grantami z Krajowego Programu Badawczo-Rozwojowego (National Key Research and Development Program of China) (2017YFC1702400).
Załącznik A. Dane uzupełniające
Dodatkowe dane do tego artykułu można znaleźć w Internecie pod adresem HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728
Od: „Metabolizm in vitro i in vivo”Ekstrakt z Cistanche tubulosau normalnych i przewlekłych, nieprzewidywalnych szczurów z depresją wywołaną stresemYang Li i inni
---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728
Bibliografia
[1] Komisja Farmakopei Chińskiej, Farmakopea Chińskiej Republiki Ludowej, wyd. 2015, China Medical Science Press, Pekin, Chiny, 2015, s. 135 Część I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analiza składników chemicznych gatunków Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970-1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: przegląd właściwości chemii, farmakologii i farmakokinetyki, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Przeciwdepresyjne działanieEkstrakt z Cistanche tubulosana szczurach z przewlekłym, nieprzewidywalnym stresem poprzez przywrócenie homeostazy mikrobioty jelitowej, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Oś jelita-mózg: jak mikrobiom wpływa na lęk i depresję, Trends Neurosci. 36 (2013) 305-312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Najnowsze osiągnięcia w zrozumieniu roli mikrobioty jelitowej w zdrowiu i chorobie mózgu, Ann. Akademia Nowego Jorku. Nauka. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Zmienność mikroflory jelitowej i fenotyp metaboliczny kału związany z depresją przez sekwencjonowanie genów 16S rRNA i LC/ Metabolomika oparta na MS, J. Pharm. Biomed. Analny. 138 (2017) 231-239.
[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: indukuje mikrobiota jelitowa związana z depresją zmiany neurobehawioralne u szczura, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Metabolizm żołądkowo-jelitowy ekstraktu wodnego z Cistanches Herba in vitro: określenie profilu metabolicznego na podstawie kompleksowej identyfikacji metabolitów w soku żołądkowym, jelitach sok, ludzkie bakterie jelitowe i mikrosomy jelitowe, J. Agric. Chemia Spożywcza 65 (2017) 7447-7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identyfikacja metabolitów echinakozydu wytwarzanych przez ludzkie bakterie jelitowe przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej/kwadrupolowej spektrometrii masowej czasu przelotu, J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Badania przesiewowe i identyfikacja trzech typowych metabolitów glikozydów fenyloetanoidowych z Cistanches Herba przez ludzkie bakterie jelitowe przy użyciu UPLC/Q-TOF-MS, J. Farmacja Biomed. Analny. 118 (2016) 167-176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Szybkie badanie przesiewowe i identyfikacja różnic między metabolitami Cistanche deserticola i ekstraktu wodnego z C. tubulosa u szczurów za pomocą UPLC- Połączona analiza rozpoznawania wzorców Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Analny. 131 (2016) 364-372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Systematycznie charakteryzuj metabolity echinakozydu i akteozydu z Cistanche tubulosa w osoczu, żółci, moczu i kale szczura UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromat. 30 (2016) 1406-1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Podejście do identyfikacji sekwencyjnych metabolitów typowy glikozyd fenyloetanoidowy, echinakozyd, oparty na chromatografii cieczowej-czas pułapki jonowej
analiza spektrometrii mas w locie, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolizm echinakozydu, dobrego przeciwutleniacza u szczurów: izolacja i identyfikacja jego metabolitów żółciowych, Metab. Dys. 37 (2009) 431-438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Zrozumienie molekularnych mechanizmów wzajemnego oddziaływania leków ziołowych i mikroflory jelitowej, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140-1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Wchłanianie i rozmieszczenie ginsenozydów po podaniu doustnym podawanie ekstraktu Panax notoginseng szczurom, Drug Metab. Dys. 37 (2009) 2290-2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interakcje mikroflory jelitowej z funkcjonalnymi składnikami żywności i nutraceutykami, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219-225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kwas kawowy łagodzi spadek ekspresji mRNA BDNF w korze wywołany ekspozycją na wymuszony stres pływania u myszy, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115-121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Podawanie hydroksytyrozolu u matki poprawia neurogenezę i funkcje poznawcze u osób ze stresem prenatalnym potomstwo, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190-199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Wpływ mikroflory jelitowej na metabolizm i toksyczność leków, Expert Opin. Metab. Toksykol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Obfitość i różnorodność enzymów węglowodanowych w ludzkiej mikroflorze jelitowej, Nat. Ks. Microbiol. 11 (2013) 497-504.
