Echinakozyd odwraca przebudowę mięśnia sercowego i poprawia pracę serca

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstrakcyjny

Przebudowa mięśnia sercowego jest ważną podstawą patologiczną HF, mitochondrialny stres oksydacyjny jest promotorem przerostu, zwłóknienia i apoptozy mięśnia sercowego. ECH jest głównym aktywnym składnikiem tradycyjnej medycyny chińskiej Cistanches Herba, wiele badań wskazuje, że ma silne zdolności antyoksydacyjne w komórkach nerwowych i nowotworach, hamuje mitochondrialny stres oksydacyjny, chroni funkcje mitochondriów, ale specyficzny mechanizm jest niejasny. SIRT1/FOXO3a/MnSOD to ważna oś antyoksydacyjna, badanie wykazało, że ECH wiąże się kowalencyjnie z SIRT1 jako ligandem i zwiększa ekspresję SIRT1 w komórkach mózgowych. Stawiamy hipotezę, że ECH może odwrócić przebudowę mięśnia sercowego i poprawić czynność serca w HF poprzez regulację osi sygnalizacji SIRT1/FOXO3a/MnSOD i hamowanie mitochondrialnego stresu oksydacyjnego w kardiomiocytach. Tutaj najpierw indukujemy komórkowy model stresu oksydacyjnego przez ISO z komórkami AC-16 i wstępnie traktujemy ECH, poziom mitochondrialnych ROS, uszkodzenie oksydacyjne mtDNA, MMP, karbonylowane białko, peroksydację lipidów, wewnątrzkomórkowe ROS i wykrycie apoptozy, potwierdzenie wpływu ECH na mitochondrialny stres oksydacyjny i funkcjonowanie in vitro. Następnie ustalamy model szczura HF indukowanego przez ISO i wstępnie leczymy ECH. Mierzone są wskaźniki funkcji serca, przebudowy mięśnia sercowego, mitochondrialnego stresu oksydacyjnego i funkcji, ekspresji osi sygnalizacyjnej SIRT1/FOXO3a/MnSOD, dane wskazują, że ECH poprawia czynność serca, hamuje przerost mięśnia sercowego, zwłóknienie i apoptozę zwiększa ekspresję SIRT1/FOXO3a/ Oś sygnalizacji MnSOD, zmniejsza uszkodzenia oksydacyjne mitochondriów, chroni funkcje mitochondriów. Wnioskujemy, że ECH odwraca przebudowę mięśnia sercowego i poprawia czynność serca poprzez regulację w górę osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD i hamowanie mitochondrialnego stresu oksydacyjnego u szczurów z HF.

SŁOWA KLUCZOWESechinakozyd, niewydolność serca, mitochondrialny stres oksydacyjny, przebudowa mięśnia sercowego

świeże zioła cistanchedomitochondrialny stres oksydacyjny

1|WPROWADZANIE

Niewydolność serca (HF) jest ostatecznym wynikiem większości chorób sercowo-naczyniowych o wysokiej częstości występowania i złym rokowaniu, a wraz z pogarszającym się trendem starzenia się populacji, hospitalizacja i śmiertelność z powodu przewlekłej niewydolności serca (CHF) gwałtownie wzrosły na całym świecie.1 W ciągu ostatnich 20 lat terapie lekowe HF poczyniły ogromne postępy, ale efekt jest bardzo ograniczony, dlatego pilnie potrzebne są nowe leki. Przebudowa mięśnia sercowego jest ważnym patologicznym podłożem HF i charakteryzuje się przerostem mięśnia sercowego, apoptozą, włóknieniem śródmiąższowym, dezorganizacją komórek mięśnia sercowego i redukcją frakcji wyrzutowej (LVEF), wzrostem wymiarów końcoworozkurczowych i skurczowych lewej komory (LVIDd i LVID) oraz zmniejszenie frakcji skracania lewej komory (LVFS).2 Jednak mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska nadal nie zostały w pełni poznane. W ostatnich latach liczne badania potwierdziły, że stres oksydacyjny jest ważnym promotorem przebudowy mięśnia sercowego.3-7

Stres oksydacyjny to stan, w którym powstają nadmiernie reaktywne formy tlenu (ROS) lub wolne rodniki, co prowadzi do oksydacyjnego uszkodzenia składników komórki, a to z kolei powoduje dysfunkcję komórki8. wyciek z oddechowego łańcucha transportu elektronów i mitochondria są najbardziej wrażliwą pozycją na działanie ROS.9 Badania nad HF wykazały zwiększone wytwarzanie ROS z kompleksu I łańcucha oddechowego.8 Zwiększona produkcja ROS atakuje najpierw komponenty mitochondrialne i powoduje nadmierny stres oksydacyjny , objawiająca się karbonylacją białek, peroksydacją lipidów i uszkodzeniem DNA10 oraz dysfunkcją mitochondriów, co w konsekwencji prowadzi do nadmiernego tworzenia ROS8, tworzy błędne koło. Wykazano, że długotrwały stres oksydacyjny może powodować przerost mięśnia sercowego i zwłóknienie mięśnia sercowego,11-13 oraz powodować apoptozę komórek mięśnia sercowego poprzez aktywację apoptozy zależnej od mitochondriów w wyniku karbonylacji białek błony mitochondrialnej i utraty potencjału błony mitochondrialnej.14 uważa się, że hamowanie mitochondrialnego stresu oksydacyjnego może być nową strategią zapobiegania przebudowie mięśnia sercowego, a nawet HF.15-17

Echinakozyd (ECH), naturalny glikozyd fenyloetanoidowy, jest głównym aktywnym składnikiem Cistanches Herba, tradycyjnej medycyny chińskiej. W ostatnich latach ECH była intensywnie badana w układzie nerwowym i nowotworach, i stwierdzono, że ma różnorodne działanie farmakologiczne, takie jak właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwapoptotyczne i przeciwnowotworowe. komórek nerwowych, ECH znacząco zwiększa zdolność antyoksydacyjną, zmniejsza produkcję ROS, poprawia potencjał błony mitochondrialnej (MMP) i zwiększa żywotność komórek,20 wykazuje działanie ochronne na funkcje mitochondriów i hamuje mitochondrialny stres oksydacyjny, chroni przed uszkodzeniami oksydacyjnymi i poprawia pamięć, ostatecznie zapobiega neurodegeneracja.21,22 ECH zwiększa również aktywność SOD i odgrywa ochronną rolę w tkance mózgowej i tkance siatkówki,19,23, ale specyficzny mechanizm jego działania przeciwutleniającego nie jest jasny.

SIRT1 jest ściśle związany ze stresem oksydacyjnym, a oś sygnalizacji SIRT1/FOXO3a/MnSOD jest najważniejszą osią antyoksydacyjną i odpowiada za tłumienie mitochondrialnego stresu oksydacyjnego, MnSOD jest szeroko dystrybuowany w mitochondriach i jest przede wszystkim odpowiedzialny za usuwanie mitochondrialnych ROS, a zatem hamując stres oksydacyjny, związki aktywujące tę oś antyoksydacyjną mogą hamować stres oksydacyjny.24,25 Ostatnie badania wykazały, że ECH wywiera swoje działanie farmakologiczne poprzez regulację wielu szlaków sygnałowych, takich jak p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads , oraz szlaku sygnałowego SIRT1.26-29 Nowe badanie wykazało, że ECH wiąże się kowalencyjnie z SIRT1 jako ligandem i zwiększa ekspresję SIRT1 w komórkach mózgowych.26 Sugeruje to, że ECH może hamować mitochondrialny stres oksydacyjny w kardiomiocytach i odwrócony mięsień sercowy przebudowa. Jednak badania nad wpływem ECH koncentrowały się na układzie nerwowym lub nowotworze, skutki i mechanizmy ECH na mitochondrialny stres oksydacyjny w kardiomiocytach i przebudowę mięśnia sercowego pozostają nieznane. Tutaj najpierw indukujemy komórkowy model stresu oksydacyjnego przez ISO i potwierdzamy wpływ ECH na mitochondrialny stres oksydacyjny i funkcję in vitro. Następnie ustalamy szczurzy model HF indukowany przez ISO i pokazujemy, że ECH odwraca przebudowę mięśnia sercowego i poprawia czynność serca poprzez regulację w górę osi sygnalizacji SIRT1/FOXO3a/MnSOD i hamowanie mitochondrialnego stresu oksydacyjnego u szczurów HF. Wyniki mają dostarczyć eksperymentalnych dowodów na rozwój nowych leków zapobiegających niewydolności serca.

2|MATERIAŁY I METODY

2.1|Hodowla komórkowa i leczenie

Komórki AC16 zakupiono z Bena Culture Collection. Komórki utrzymywano w wysokoglukozowej pożywce Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (10% FBS; Gibco) w kolbach T-75 (Corning Glassworks, Corning, Nowy Jork, USA). Warunki są utrzymywane w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Gdy komórki osiągną 70 procent -80 procent konfluencji, komórki z grupy ISO (Sigma, USA) inkubuje się z pożywką zawierającą 10 uM ISO (Sigma, USA) przez 24 godziny, komórki z grupy ECH są wstępnie traktowane 50uM ECH (MCE , USA) przez 30 min przed ekspozycją ISO. Komórki kontrolne (Ctrl) nie są traktowane niczym.

cistanche na sprzedażwyciąg

2.2|Wykrywanie mitochondrialnego poziomu ROS za pomocą chemiluminescencji luminolu

Mitochondria izoluje się i oczyszcza z komórek AC-16 przy użyciu zestawu Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenia białka określa się za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Biotech). Mitochondrialny poziom ROS jest wykrywany przez luminal (3-hydrazyd aminoftalowy 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynedion) przy użyciu zestawu Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), reaguje z ROS i powoduje emisję fotonów, czyli widma pasmowego o piku przy około 460 nm, a Relative Light Unit (RLU) jest wykrywana przez przyrząd do pomiaru chemiluminescencji i zamieniana na RLU/ug białko mitochondrialne.

2.3|8-OHdG służy do oceny uszkodzeń oksydacyjnych mitochondrialnego DNA

Uszkodzenie oksydacyjne mitochondrialnego DNA ocenia się, wykrywając zawartość 8-hydroksy-2-deoksyguanozyny (8-OHG). Oczyszczone mitochondria w komórkach izoluje się za pomocą zestawu do izolacji mitochondriów jak powyżej (Sigma). Stężenia białka określa się za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Biotech). Następnie poddaje się je dysocjacji w celu określenia poziomu 8-OHdG przy użyciu zestawu Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Absorbancję zmiany koloru mierzy się w spektrofotometrze przy długości fali 450 nm. Stężenie 8-OHdG w próbkach jest następnie określane przez porównanie OD próbek z krzywą standardową i przeliczane na ng/ml.

2.4|Pomiar MMP przez JC-1

Mitochondria izoluje się i oczyszcza z AC-16, a stężenie białka określa się, jak wspomniano powyżej. Następnie mitochondria ponownie zawiesza się w stężeniu 1 mg/ml, MMP mierzy się przy użyciu zestawu testowego JC-1 zgodnie z instrukcjami producenta. Intensywność fluorescencji mierzy się przy długości fali wzbudzenia: 490 nm, szczelinie 5 nm, długości fali emisji: 590 nm, szczelinie 5 nm za pomocą spektrofotometru30, wyniki przedstawiono jako FLU/ugP.

2.5|Wykrywanie komórek apoptotycznych metodą cytometrii przepływowej w komórkach AC-16

Cytometria przepływowa służy do oceny apoptozy komórek. Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC/PI (CWBIO, Chiny) służy do wykrywania komórek apoptotycznych i martwiczych zgodnie z instrukcjami dostawcy. Apoptoza wczesna, późna apoptoza lub martwica, szczątki komórkowe i żywe komórki są identyfikowane jako aneksyna V (plus)/PI (-), aneksyna V (plus)/PI (plus), aneksyna V (-)/PI ( plus ) i aneksyna V (-)/PI (-). Intensywności fluorescencji analizuje się przy użyciu cytometru przepływowego (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Każdy eksperyment powtarza się 3 razy.

2.6|Oceniono wewnątrzkomórkowe ROS za pomocą cytometru przepływowego

Po traktowaniu komórki trypsynizuje się, przemywa dwukrotnie PBS. Komórki są następnie ponownie zawieszane w PBS, barwione DCFH-DA (Beyotime, Chiny) w końcowym stężeniu 1 μM i inkubowane przez 1 h w temperaturze 37 stopni w inkubatorze z CO2, a następnie testowane w cytometrze przepływowym przy wzbudzeniu 488 nm . Intensywność fluorescencji reprezentuje poziom wewnątrzkomórkowych ROS.

2.7|Badanie zawartości białka karbonylowego w mitochondriach komórek AC-16

Po obróbce oczyszczone mitochondria izoluje się i poddaje sonikacji na lodzie i traktuje 1% siarczanem streptomycyny w celu wytrącenia mitochondrialnych kwasów nukleinowych, określa się stężenie białka. Zawartość białka karbonylowego bada się za pomocą zestawu Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) opartego na derywatyzacji grupy karbonylowej za pomocą dinitrofenylohydrazyny (DNPH), zgodnie z instrukcją zestawu, OD mierzy się czytnikiem mikropłytek i przelicza na nmol/ mg białka porównując z krzywą standardową.

2,8|Oznaczanie poziomu peroksydacji lipidów w mitochondriach komórek AC-16

Po zabiegu komórki są zbierane i poddawane lizie, mitochondria są izolowane i oczyszczane, a następnie rozbijane ultradźwiękami, stężenie białka określane za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Biotech), peroksydacja lipidów określana jest na podstawie poziomu dialdehydu malonowego (MDA) za pomocą testu TBARS , przy użyciu zestawu (Nan jing Jian cheng, Chiny) i poziom MDA mierzy się zgodnie z protokołem producenta. OD wykrywa się przy 586 nm za pomocą czytnika mikropłytek i przekształca w μmol/g białka przez porównanie z krzywą standardową.

2.9|Zwierzęta i leczenie

Młode samce szczurów Sprague-Dawley ważące 120-140g pozyskiwano z Xi'an Jiao tong University Laboratorial Animal Center (Shaanxi, Chiny). Badanie jest zgodne z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, opublikowanym przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (publikacja NIH nr 85-23, zaktualizowana w 1996 r.), a protokoły doświadczalne zostały zatwierdzone przez władze lokalne ( Biomedycznej Komisji Etyki Wydziału Medycznego Uniwersytetu Xi 'a Jiao Tong). Szczurzy model HF ustala się w sposób opisany wcześniej przez nas.31 W skrócie, Izoproterenol (10 mg/kg) podaje się raz dziennie przez wstrzyknięcie dootrzewnowe przez 2 tygodnie (zdefiniowane jako grupa HF), ECH podaje się z 20 ug/g raz dziennie przez wstrzyknięcie dootrzewnowe na 30 min przed leczeniem ISO (zdefiniowane jako grupa ECH) i podawanie trwa przez 2 tygodnie. Zwierzętom kontrolnym podaje się 0,9% NaCl (definiowany jako grupa Ctrl). Pomiary echokardiograficzne są wykonywane w celu oceny czynności serca.

2.10|Pomiary echokardiograficzne

Zwierzęta znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 300 mg/kg wodzianu chloralu. Aparat USG SONOS-2500 z głowicą ultradźwiękową 7,5 MHz (HP, USA) służy do wykonywania badań echokardiograficznych. frakcja wyrzutowa lewej komory (LVEF), skrócenie frakcji lewej komory (LVFS), wymiary końcoworozkurczowe lewej komory (LVIDd), wymiary końcowoskurczowe lewej komory (LVID), częstość akcji serca (HR), grubość przegrody międzykomorowej w rozkurczu (IVSTd ), grubość tylnej ściany lewej komory w rozkurczu (LVPWTd) mierzy się jak opisano wcześniej.32

RYSUNEK 1 50μmol ECH skutecznie hamuje mitochondrialny stres oksydacyjny komórek AC-16 indukowany przez 10μmol/l ISO oraz chroni funkcje mitochondriów i zmniejsza apoptozę.

2.11|Mierzy się stosunek masy serca do masy ciała (HW/BW)

Szczur waży się przed znieczuleniem, izoluje świeże serce i wypłukuje krew 0.1mol/L PBS, odcina naczynia i inne zbędne tkanki i waży serce, następnie HW/BW (mg/100g) obliczony.

2.12|Barwienie histologiczne

Serca szczurów wycina się i utrwala w 4% paraformaldehydzie, zatapia w parafinie i kroi na plastry o grubości 5 μm. Do obserwacji zmian patologicznych stosuje się barwienie hematoksyliną-eozyną (HE), a do oceny włókien kolagenowych tkanki mięśnia sercowego szczurów stosuje się trichromię Massona. Frakcja objętościowa kolagenu sercowego (CVF) i powierzchnia przekroju kardiomiocytów mierzy się za pomocą Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2.13|Barwienie TUNEL

Pobiera się tkankę mięśnia sercowego z lewej komory i przeprowadza się test TUNEL w sposób opisany wcześniej przez nas32

2.14|Elektronowy mikroskop transmisyjny

Świeża tkanka serca jest utrwalana w 2,5 procentowym aldehydzie glutarowym w 4 stopniach, następnie tkanka jest cięta na 1 mm3 objętości i ponownie utrwalana w 2,5 procentowym aldehydzie glutarowym w 4 stopniach przez 2 godziny, a następnie przemywana 0,1 mol/l PBS, utrwalona w 1% kwasie osmowym, odwodnionym acetonem, zatopionym w żywicy epoksydowej, wykonuje się ultracienkie plastry o grubości około 800nm, barwione octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, a następnie obserwuje się pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japonia). W celu ilościowego określenia ochronnego działania ECH w morfologii mitochondriów, średni obwód mitochondriów, średni obszar przekroju mitochondriów, procent degeneracji i procent wakuolizacji w mitochondriach są analizowane statystycznie za pomocą Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).

2.15|Ilościowy PCR

Całkowity RNA jest przygotowywany z tkanki lewej komory za pomocą odczynnika Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). cDNA jest syntetyzowany przy użyciu zestawu TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonia). Specyficzne sekwencje starterów kolagenu I użyte do PCR w czasie rzeczywistym są następujące: forward: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, reverse: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH naprzód 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', odwrotne 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Taq (idealny czas rzeczywisty) (Takara, Japonia). Względny poziom mRNA oblicza się przez normalizację do GAPDH, zgodnie z metodą 2-ΔΔCT.

2.16|Analiza Western blot ekspresji białek SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Całkowite białko tkanki lewej komory jest ekstrahowane na lodzie przy użyciu zimnego buforu RIPA (BioRad, USA) z koktajlem inhibitora proteazy (Sigma-Aldrich). Stężenie określa się metodą BCA. Procedury Western blot opisano wcześniej.33 W skrócie, próbkę białka frakcjonuje się na 15% żelach poliakryloamidowych siarczanu dodecylu sodu, przenosi na membrany PVDF (BioRad, USA), blokuje 5% odtłuszczonym mlekiem i inkubuje z przeciwciałem MYH od myszy (rozcieńczony 1:200, Santa Cruz, USA). Następnie inkubowano z kozim przeciwciałem mysim sprzężonym z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:2, 000, Santa Cruz, USA). Względny poziom białka oblicza się normalizując średnią wartość promienia do -aktyny. Pasma białka są wykrywane za pomocą systemu chemiluminescencji (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Pomiar mitochondrialnego stresu oksydacyjnego w mięśniu sercowym szczura

Oczyszczone mitochondria szczurzego mięśnia sercowego izoluje się za pomocą zestawu Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) zgodnie z instrukcjami producenta, mitochondrialne ROS, MMP, uszkodzenia oksydacyjne mtDNA, zawartość karbonylowanego białka i poziom peroksydacji lipidów w mitochondriach wykrywa się tymi samymi metodami, co eksperymenty komórkowe opisane powyżej. Warto zauważyć, że ROS w tkance mięśnia sercowego wykrywa się za pomocą sond fluorescencyjnych DCFH-DA, intensywność fluorescencji wykrywa się za pomocą przyrządu pomiarowego do znakowania enzymatycznego, wyniki są przedstawiane jako RLU/ug białka mitochondrialnego.

2.18|Analiza statystyczna

Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± SEM. Do porównania różnic między wieloma grupami stosuje się jednokierunkową analizę ANOVA, a następnie test istotności post hoc Tukeya. Wszystkie statystyki są określane przy użyciu oprogramowania SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, USA). Za istotną uznaje się wartość prawdopodobieństwa P <>

3|WYNIKI

3.1|50 μM ECH skutecznie hamuje mitochondrialne uszkodzenia oksydacyjne i apoptozę w komórkach AC-16

Nieleczone komórki są ustawione jako grupa Ctrl. Po pierwsze, jak pokazuje Rysunek 1A, ECH hamuje mitochondrialne ROS indukowane przez ISO. Komórki traktowane ISO wykazują znaczny wzrost mitochondrialnego ROS w porównaniu z Ctrl i ten wzrost jest znacznie osłabiony przez wstępne traktowanie 50 μM ECH. Po drugie, ECH może hamować uszkodzenia oksydacyjne mtDNA indukowane przez ISO. Uważa się, że 8-OHdG jest jedną z najczęstszych zmian DNA wynikających ze stresu oksydacyjnego i jest biomarkerem oksydacyjnego uszkodzenia i naprawy DNA. Jak pokazuje Rysunek 1B, zawartość 8-OHdG w oczyszczonych mitochondriach z komórek AC-16 jest wykrywana, wyniki pokazują, że poziom 8-OHdG w mitochondriach z komórek traktowanych ISO dramatycznie wzrósł, ale zmiana została odwrócona przez 50 μM ECH. Po trzecie, ECH skutecznie chroni MMP, który jest zaburzony przez ISO. Intensywność fluorescencji jest znacznie zmniejszona w komórkach traktowanych ISO w porównaniu z komórkami Ctrl, podczas gdy wstępne traktowanie 50 μM ECH znacząco osłabia redukcję MMP, jak pokazuje Figura 1C. Po czwarte, ECH chroni przed uszkodzeniem oksydacyjnym białka mitochondrialnego w komórkach AC-16. Jak pokazuje Figura 1D, zawartość białka karbonylowego w mitochondriach komórek traktowanych ISO jest znacznie zwiększona, a ECH osłabia ten efekt. Po piąte, ECH hamuje również indukowaną przez ISO peroksydację lipidów mitochondrialnych w komórkach AC-16. Jak pokazuje Rysunek 1E, poziom nadtlenków lipidów w mitochondriach komórek ISO jest oczywiście wyższy niż w komórkach Ctrl, podczas gdy wzrost ten jest znacznie zmniejszony przez wstępne traktowanie 50 μM ECH. Ostatecznie ECH hamuje akumulację wewnątrzkomórkowych ROS. Jak pokazuje Figura 1F, poziom wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach ISO jest znacznie zwiększony i znacznie obniżony w komórkach wstępnie traktowanych ECH. Figura 1G pokazuje, że szybkość apoptozy komórek AC-16 jest znacząco zwiększona po 24h inkubacji z 10 μM ISO, w porównaniu z komórkami Ctrl, podczas gdy komórki wstępnie potraktowane 50 μM ECH znacznie zmniejszają apoptozę indukowaną przez ISO.

FIGURA 2 Przerost serca szczurów z HF wywołany przez ISO jest złagodzony, a czynność serca znacznie poprawiona przez leczenie ECH.

3.2|ECH odwraca przebudowę mięśnia sercowego i poprawia czynność serca u szczurów z HF indukowanych ISO

Jak pokazano na Figurze 2A, serca u szczurów z HF są oczywistym przerostem i są odwracane przez traktowanie ECH. Jak pokazują Figury 2B-D i L, ECH zmniejsza HW/BW. Wyniki echokardiografii wskazują, że LVEF i LVFS są istotnie zmniejszone w grupie HF, LVIDd, LVID i IVSTd są istotnie zwiększone w grupie HF. Jednak ECH znacząco zmniejsza LVIDd, LVIDs, IVSTd i poprawia LVEF i LVFS, nie ma istotnej różnicy w HR między trzema grupami, LVPWTd jest zwiększone w HF, ale nie ma różnicy między ECH a Ctrl lub między ECH i HF, Rysunek 2E-K pokazuje. Wyniki barwienia HE wskazują, że przerost mięśnia sercowego, zaawansowana choroba lub martwica zwyrodnieniowa, naciek komórek zapalnych oraz przekrwienie i obrzęk śródmiąższowy u szczurów z HF, a ECH znacząco łagodzi te uszkodzenia, przerost mięśnia sercowego i zaburzenia zaaranżowane są łagodzone, martwica zwyrodnieniowa i naciek zapalny są zmniejszone, jak pokazano na Figurze 3A. Mierzy się pole przekroju poprzecznego kardiomiocytu, które jest znacznie zwiększone po ISO i zmniejsza się w grupie traktowanej ECH, jak pokazuje Figura 3E. Oceny odkładania kolagenu za pomocą barwienia Massona wykazują, że zawartość kolagenu w lewej komorze u szczurów z HF jest wyraźnie zwiększona i najwyraźniej zmniejszona po leczeniu ECH, co oczywiście zmniejsza CVF. Analiza PCR w czasie rzeczywistym ujawnia, że ​​transkrypty prokolagenu typu Ⅰ są podwyższone u szczurów ISO i obniżone u szczurów ECH, wyniki te są ze sobą zgodne, jak pokazują Rysunki 3B i FG, dane wskazują, że ECH skutecznie zmniejsza odkładanie kolagenu . Liczba komórek TUNEL-dodatnich w kardiomiocytach jest znacznie zwiększona u szczurów HF w porównaniu z Ctrl, ECH znacznie zmniejsza apoptozę komórek mięśnia sercowego, a Rycina 3C-D przedstawia reprezentatywny obraz komórek TUNEL-dodatnich odpowiednio w polach małej i dużej mocy, a Ryc. 3H pokazuje szybkość apoptozy komórek mięśnia sercowego. Wyniki te wskazują, że ECH skutecznie odwraca przerost mięśnia sercowego, włóknienie śródmiąższowe mięśnia sercowego i apoptozę oraz poprawia czynność serca u szczurów z HF wywołaną przez ISO.

FIGURA 3 Wyniki barwienia histologicznego pokazują, że ECH odwraca przebudowę lewej komory u szczurów z HF indukowaną przez ISO.

3.3|ECH chroni ultrastrukturę mięśnia sercowego u szczurów HF

Wyniki transmisyjnych mikrografów elektronowych pokazują, że uszkodzenie ultrastruktury mięśnia sercowego może być osłabione przez ECH, jak pokazano na rycinie 4A-B. Miofibryle są ułożone pionowo, struktura sarkomeru jest oczywista, miofilamenty są uporządkowane, a linia Z wyraźna. Mitochondria są starannie ułożone, a struktura u szczurów Ctrl jest wyraźna. Jednak miofibryle są zdezorganizowane, pęknięte i rozpuszczone, struktura sarkomeru jest rozmyta, brak linii Z, widoczna jest strefa skurczu mięśnia sercowego, zwiększa się liczba i objętość mitochondriów, mitochondria mają różne kształty i rozmiary, ułożone są w nieuporządkowanie, struktura jest niejasna, pęcznieje i fragmentuje kryształy, zapada się lub zbija się i rozpuszcza w wakuoli u szczurów HF. ECH oczywiście osłabia te zmiany, większość włókien mięśnia sercowego jest zgrabnie ułożona, a włókna mięśnia sercowego są wyraźne, linia Z istnieje, chociaż widoczne jest rozpuszczenie włókien, struktura sarkomeru jest wyraźna, gęstość mitochondriów jest zmniejszona, kształty i rozmiary są złagodzone, uporządkowane, obrzęk mitochondriów i fragmentacja grzebienia, zapadanie się lub zlepianie, a wakuolizacja jest wyraźnie zmniejszona przez ECH w porównaniu z HF. Obrzęk mitochondriów i fragmentacja grzebienia, zapadanie się lub zlepianie oraz częściowa wakuolizacja są określane jako zwyrodnienie mitochondrialne. Wyniki pokazują, że ECH skutecznie chroni ultrastrukturę mięśnia sercowego, a zwłaszcza chroni morfologię mitochondriów u szczurów z HF, jak pokazuje Rysunek 4C-F.

RYCINA 4 ECH chroni ultrastrukturę kardiomiocytów i morfologię mitochondrialną szczurów HF indukowanych przez ISO.

3.4|ECH zwiększa ekspresję białek SIRT1, FOXO3a i MnSOD

Analiza Western Blot pokazuje, że poziom ekspresji białka SIRT1, FOXO3a i MnSOD jest znacząco obniżony u szczurów HF, jednak ECH oczywiście zwiększa zmniejszoną ekspresję białka. Reprezentatywne prążki białkowe wyników immunoblottingu i analizy statystycznej przedstawiono na Figurze 5. Część danych wskazuje, że ECH zwiększa ekspresję białka SIRT1, FOXO3a i MnSOD.

3.5|ECH hamuje mitochondrialny stres oksydacyjny w tkance mięśnia sercowego lewej komory

W tej części mierzone są mitochondrialne ROS, MMP, uszkodzenia oksydacyjne mitochondrialnego DNA, zawartość białka karbonylowego i poziom peroksydacji lipidów w mitochondriach w tkance mięśnia sercowego lewej komory szczurów, a wyniki są zgodne z eksperymentami komórkowymi, to znaczy: ECH zmniejsza mitochondrialne ROS, chroni MMP, zmniejsza stopień uszkodzenia mtDNA, zmniejsza zawartość białka karbonylowego i peroksydację lipidów w mitochondriach, jak pokazuje Rysunek 6.

FIGURA 5 ECH reguluje w górę poziom ekspresji białka SIRT1, FOXO3a i MnSOD, który jest regulowany w dół u szczurów HF.

4|DYSKUSJA

Badanie to pokazuje, że ECH odgrywa skuteczną rolę w zapobieganiu przebudowie mięśnia sercowego i poprawie funkcji serca poprzez regulację w górę osi sygnalizacji SIRT1/FOXO3a/MnSOD i hamowanie mitochondrialnego stresu oksydacyjnego.

Mitochondria są głównym miejscem wytwarzania ROS jako produktu ubocznego fosforylacji oksydacyjnej, ze względu na bliskość ROS, białek mitochondrialnych, lipidów i mtDNA uważa się, że są głównymi celami uszkodzeń oksydacyjnych po nadmiernej emisji mitochondrialnych ROS,34,35 to uszkodzenie stymuluje dalszą produkcję ROS, błędne koło trwa dalej, ROS i stres oksydacyjny mogą prowadzić do przerostu mięśnia sercowego, apoptozy, zwłóknienia śródmiąższowego i HF poprzez aktywację wielu szlaków sygnałowych. 35 Tak więc wydaje się, że leki ukierunkowane na hamowanie mitochondriów oksydacyjnych stres są skuteczne w zapobieganiu przebudowie mięśnia sercowego. ECH to naturalny glikozyd fenyloetanoidowy, składnik tradycyjnego chińskiego zioła Cistanche tubulosa. jest szeroko badany i w ostatnich latach udowodniono, że posiada rodzaje działań farmakologicznych, takich jak działanie przeciwnowotworowe, przeciwapoptotyczne, przeciwstarzeniowe, neuroprotekcyjne i tak dalej. Badania wykazały, że działanie farmakologiczne ECH zależy głównie od jej właściwości przeciwutleniających i przeciwzapalnych,18,21, a ECH zmniejsza mitochondrialne ROS i chroni funkcję mitochondriów przed uszkodzeniem oksydacyjnym w komórkach nerwowych.20,22 Tutaj po raz pierwszy wykazaliśmy, że ECH zmniejsza mitochondrialne ROS kardiomiocytów, a tym samym poprawia MMP, zmniejsza uszkodzenia oksydacyjne mtDNA, białka i lipidów, skutecznie hamuje mitochondrialne uszkodzenia oksydacyjne i zmniejsza apoptozę in vitro i in vivo, dzięki czemu odwraca przebudowę mięśnia sercowego i poprawia pracę serca. Oznacza to, że ECH jest potencjalnym nowym lekiem w profilaktyce przebudowy mięśnia sercowego i HF.

W normalnych warunkach mitochondrialne ROS są usuwane głównie przez MnSOD, który rozprowadza się w mitochondriach i chroni przed uszkodzeniami oksydacyjnymi mitochondriów. Ang II znacząco zmniejsza ekspresję MnSOD kardiomiocytów i indukuje przerost mięśnia sercowego, jednak resweratrol może zwiększać ekspresję MnSOD i hamować przerost mięśnia sercowego indukowany przez Ang II.36 W HF aktywność MnSOD jest znacznie zmniejszona, a wytwarzanie mitochondrialnych ROS jest podwyższone .37,38 U myszy pozbawionych genu MnSOD swoistych dla serca, mitochondrialne ROS nie mogły zostać usunięte, a ROS jest podwyższony w kardiomiocytach, co prowadziło do dysfunkcji mitochondriów i postępującego powiększenia serca, ostatecznie prowadząc do niewydolności serca.39 W niniejszym badaniu potwierdzamy że ekspresja MnSOD jest znacznie zmniejszona, co jest osłabione przez leczenie ECH, a tym samym mitochondrialne ROS jest zmniejszone, a mitochondrialny stres oksydacyjny jest zahamowany. Oznacza to, że ECH chroni kardiomiocyty przed uszkodzeniem oksydacyjnym poprzez zwiększenie ekspresji MnSOD, dalej badamy mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych efektów.

Ekspresja MnSOD jest regulowana przez FOXO3a, który jest czynnikiem transkrypcyjnym i wiąże się w regionie promotora genu MnSOD i prowadzi do promocji transkrypcji genu.40 SIRT1 jest cząsteczką poprzedzającą FOXO3a i może aktywować FOXO3a poprzez deacetylację. Oś sygnalizacyjna SIRT1/FOXO3a/MnSOD odgrywa kluczową rolę w ochronie przed stresem oksydacyjnym w różnych typach komórek, aktywacja osi sygnalizacyjnej przez estradiol hamuje stres oksydacyjny i wywiera ochronę serca24; Aktywacja osi sygnalizacyjnej przez resweratrol hamuje śmierć komórek wywołaną stresem oksydacyjnym40; W przeciwnym razie angiotensyna II hamuje szlak SIRT1/FoxO3a/MnSOD i indukuje mitochondrialny stres oksydacyjny, uszkodzenie mtDNA w osteoblastach,41 cyklaza adenylylowa typu 5 zwiększa stres oksydacyjny poprzez hamowanie ekspresji MnSOD poprzez szlak Sirt1/FoxO3a.42 W niniejszym badaniu stwierdzono, że ekspresja SIRT1, FoxO3a i MnSOD jest znacznie zmniejszona u szczurów z HF, a mitochondrialne ROS jest podwyższone, a stres oksydacyjny jest wzmocniony, jednak zmiany są odwracane przez ECH. Nowe badania wskazują, że ECH bezpośrednio wiąże SIRT1 jako ligand i tworzy kompleks z 9 wiązaniami kowalencyjnymi i zwiększa ekspresję SIRT1 w komórkach nerwowych.26 Zgodnie z tym badaniem, niniejsze badanie pokazuje, że ECH zwiększa również ekspresję SIRT1 w kardiomiocytach zwiększa ekspresję genów MnSOD poprzez FoxO3a i hamuje mitochondrialne ROS i stres oksydacyjny.

Długotrwałe przewlekłe niedokrwienie może powodować hibernację mięśnia sercowego, te hibernujące komórki mięśnia sercowego zazwyczaj wykazują utratę włókien kurczliwych, w cytozolu występuje nadmiar ziarnistości glikogenu, retikulum sarkoplazmatyczne i zanikają kanaliki poprzeczne,43 ponadto występują nieprawidłowości w wielkości i kształcie mitochondriów , reaktywny przerost mięśnia sercowego i zwłóknienie śródmiąższowe, które jest wtórne do utraty miocytów.44 W naszym badaniu zaobserwowaliśmy również powyższe zmiany u szczurów z HF, podczas gdy ECH znacznie je łagodzi, ponieważ ostatnie badanie wykazało, że powrót funkcji serca po stresie niedokrwiennym może być cechą hibernacji mięśnia sercowego,45 mierzy się również poziom glikogenu w mięśniu sercowym, wyniki wskazują, że nie ma istotnej różnicy między trzema grupami, jak pokazano na rycinie 7J.

W poprzednim badaniu wykryto również hibernację mięśnia sercowego w świńskim modelu bez niedokrwiennej niewydolności serca poprzez stymulację wolnej ściany LV z wysoką częstotliwością,46 ponieważ niedrożność naczyń mikrokrążenia odgrywa ważną rolę w hibernacji mięśnia sercowego i wynikającej z niego dysfunkcji kurczliwości, i ulega ona znacznej poprawie, gdy niedrożność naczyń mikrokrążenia jest odwracana przez lek.47 Obecnie niektóre badania wskazują, że terapia rewaskularyzacyjna jest skuteczna w hibernacji mięśnia sercowego,43 przy użyciu barwienia HE i Massona obserwujemy, że naczynia włosowate mięśnia sercowego i gęstość tętniczek są oczywiście zmniejszone u szczurów z HF i są znacznie łagodzone. przez ECH, jak pokazano na rysunku 7A-H. Wcześniejsze badania wykazały, że inne naturalne związki, takie jak beta-glukan jęczmienia, wywierają działanie kardioprotekcyjne poprzez zwiększenie ekspresji MnSOD,48,49, a wzrost MnSOD jest związany ze zwiększoną gęstością naczyń włosowatych mięśnia sercowego i ekspresją VEGF. Przeprowadziliśmy RT-PCR w celu wykrycia ekspresji VEGF, dane są zgodne z odkryciem barwienia histologicznego, co oznacza, że ​​ECH może promować angiogenezę i zwiększać gęstość naczyń włosowatych mięśnia sercowego poprzez regulację ekspresji VEGF, jak pokazano na Figurze 7I. Niniejsze badanie wykazało, że ECH może chronić i wzmacniać naczynia włosowate i tętniczki mięśnia sercowego poprzez regulację w górę szlaku SIRTI/FOXO3a/MnSOD i ekspresję VEGF, tym samym hamując hibernację mięśnia sercowego i przyczyniając się do poprawy funkcji serca.

Cistanche wnosi wkładdopoprawa pracy serca.

Aby uzyskać więcej informacji, kliknij tutaj.

Warto zauważyć, że apoptoza kardiomiocytów jest dobrze znana jako ważna patologiczna zmiana w niewydolności serca, a niniejsze badanie rzeczywiście potwierdza, że ​​duża ilość komórek apoptotycznych u szczurów HF i ECH znacząco zmniejsza apoptozę poprzez regulację szlaku SIRTI/FOXO3a/MnSOD i hamowanie mitochondrialny stres oksydacyjny, jak wspomniano powyżej.

Przede wszystkim ECH odwraca przebudowę mięśnia sercowego i poprawia czynność serca poprzez regulację w górę osi sygnalizacji SIRT1/FoxO3a/MnSOD, hamując w ten sposób mitochondrialny stres oksydacyjny i zmniejszając hibernację mięśnia sercowego. Sugeruje się zatem, że ECH jest potencjalnym lekiem do zapobiegania lub leczenia przebudowy mięśnia sercowego i HF.