Hamowanie agregacji beta amyloidu i osadzanie się ekstraktu wodnego Cistanche Tubulosa

1. Wstęp

Demencja jest jedną z najczęstszych chorób przewlekłych związanych ze starzeniem się. W 2015 r. w Światowym Raporcie Alzheimera oszacowano, że na demencję cierpiało około 46,8 mln osób, a szacuje się, że w 2030 r. liczba ta wyniesie 74,7 mln, a w 2050 r. 131,5 mln. Światowa populacja chorych na demencję będzie z roku na rok zwiększać się i w przyszłości wymknie się spod kontroli . Globalne wydatki na opiekę zdrowotną związane z leczeniem demencji wyniosły w 2010 r. prawie 604 miliardy dolarów amerykańskich, a oczekuje się, że w 2030 r. wyniosą 1000 miliardów. Pacjenci z demencją są obarczeni większym ryzykiem przypadkowej śmierci i dlatego wymagają większej opieki medycznej. Stanowi to duże obciążenie dla opiekunów rodzinnych pacjentów z demencją. Wpływ demencji na opiekunów, rodzinę i społeczeństwo może powodować ogromny stres fizyczny, psychiczny, życiowy i ekonomiczny. Istnieją dwie główne formy demencji: choroba Alzheimera (AD) i otępienie naczyniowe. AD jest najczęstszą demencją i jest nieodwracalną i postępującą chorobą neurodegeneracyjną. AD była szóstą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych w 2015 roku.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO ZAPOBIEGANIA AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ostatnie badania potwierdzają, że toksyczność neuronów wywołana przez agregację peptydu amyloidu (A) (płytki) i białka tau (splątki) jest ściśle powiązana z patogenezą AD. Nagromadzenie A i białka tau w mózgu może prowadzić do uszkodzenia neuronów i utraty pamięci. Nierozpuszczalne oligomery A gromadzą się w płytkach pozakomórkowych i donoszono, że prowadzą do dysfunkcji synaptycznej, toksyczności neuronów i śmierci komórki. Niestety, jak dotąd nie jest dostępna skuteczna metoda leczenia A i białka tau, hamowania tworzenia lub oligomeryzacji A oraz zawieszenia lub wyleczenia nieodwracalnego uszkodzenia neuronów. Obecne środki lecznicze, takie jak galantamina idonepezil, które są inhibitorami acetylocholinoesterazy, mogą jedynie tymczasowo złagodzić utratę pamięci poprzez podniesienie poziomu neuroprzekaźników. W 2012 r. żaden z kandydatów na leki nie był w stanie zmniejszyć efektu A w dużych badaniach klinicznych pacjentów z chorobą Alzheimera. Dlatego pilnie potrzebne są badania nad nową metodą leczenia, która pozwoliłaby ograniczyć częstość występowania choroby Alzheimera. Jony metali uznano ostatnio za kluczowy czynnik ściśle powiązany z agregacją A. Chelatory metali uważane za potencjalne związki ołowiu zapewniają zupełnie nową strategię przeciwdziałania AD.

Suszona łodyga Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, jest szeroko zbierany na pustyni Xhinjang w Chinach. Jest to ważna tradycyjna medycyna chińska, należąca do tonizującej medycyny chińskiej, indeksowanej w Farmakopei Chińskiej i stosowanej od tysięcy lat w leczeniu osłabienia fizycznego, niewydolności nerek, niepłodności, zapominania, impotencji i zaparć starczych.Ekstrakt wodny C. tubulosa (CTE)kapsułki zostały zatwierdzone w Chinach jako lek botaniczny na otępienie naczyniowe. Według badania klinicznego przeprowadzonego na 18 pacjentach, u których zdiagnozowano łagodną do umiarkowanej AD, kapsułki CTE zapewniły pacjentom stabilniejszy stan pamięci w porównaniu z inhibitorami acetylocholinoesterazy. W naszym poprzednim badaniu CTE zmniejszało odkładanie się peptydu amyloidowego (A) i poprawiało utratę pamięci u szczurów cierpiących na chorobę Alzheimera. Glikozydy fenyloetanoidowe, echinakozyd (1), akteozyd (2) i izoakteozyd (3) są uważane za główne składniki CTE. Związek 1 ma działanie neuroprotekcyjne przeciwko toksyczności 1-metylu-4-fenylu-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP), 1-metylu{{13 }}jon fenylopirydyniowy (MPP+) i 6-hydroksydopamina (6-OHDA). Nasz poprzedni raport wykazał, że 1 hamuje oligomeryzację i toksyczność A w badaniu in vitro oraz hamuje odkładanie się A, poprawia upośledzoną pamięć i dysfunkcję poznawczą u szczurów wywołanych A. Związki 2 i 3 zwiększały degradację A i zmniejszały oligomeryzację A in vitro. Związek 3 zmniejszał odkładanie się A u szczurów indukowanych A. Na podstawie tych badań udowodniono już, że C. tubulosa ma potencjał w leczeniu choroby Alzheimera. CTE jest ściśle powiązany z agregacją i osadzaniem anty-A. Aby lepiej zrozumieć mechanizm CTE, musimy dysponować wygodną i skuteczną metodą identyfikacji aktywnego składnika, a także jego zawartości w próbkach tkanki mózgowej. Większość badań miała na celu ilościowe oznaczenieechinakozyd, akteozyd i izoakteozyd w ziołachlub żywności metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), ale tylko dwa badania dotyczyły oznaczeń w surowicy lub tkankach. Nie ma jednak doniesień na temat jednoczesnej analizy 1–3 w tkankach mózgu po doustnym podaniu CTE. Ponadto z ostatnich badań nadal nie jest jasne, czy aktywne składniki CTE lub ich metabolity skutecznie przenikają przez barierę krew-mózg i oddziałują na neurony mózgu. Dlatego też badanie to zapewnia zaawansowaną i czułą metodę z przekonującymi dowodami, które wyraźnie ilustrują podstawowy mechanizm CTE przeciwko agregacji i osadzaniu się A.

2. Wyniki

2.1. Izolacja i identyfikacja trzech głównych związków (1–3)

Wysuszone łodygi C. tubulosa ekstrahowano 75% EtOH w temperaturze pokojowej. Skondensowany 75% ekstrakt EtOH poddano chromatografii kolumnowej na żywicy i C18, w wyniku czego otrzymano trzy główne związki, echinakozyd (1),akteozyd (2) i izoakteozyd(3). Ich strukturę wyjaśniono za pomocą analizy spektroskopii NMR (magnetycznego rezonansu jądrowego) i ESI-MS (masy jonizacyjnej przez elektrorozpylanie) oraz poprzez porównanie z danymi literaturowymi (rysunek 1, rysunki materiałów dodatkowych S3 – S11).

2.2. Test zawartości glikozydów fenylotanoidowych (1–3) z CTE

Metodę testową poddano walidacji pod kątem analizy glikozydów fenyloetanoidowych. Związki 1–3 (5,0 mg) dokładnie odważono i zmieszano z 50% metanolem (40 ml). Mieszaniny sonifikowano przez 5 minut. Roztwór wzorcowy trzech glikozydów fenyloetanoidowych (1–3) zmieszano jako standardowy roztwór podstawowy (100 µg/ml). Standardowy roztwór podstawowy wykorzystano do przygotowania pięciu różnych stężeń (odpowiednio 5, 10, 25, 50 i 100 µg/ml) wskazanych roztworów poprzez rozcieńczenie seryjnymi objętościami 50% metanolu. Krzywe glikozydów fenyloetanoidowych (1–3) wyznaczono za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) w zakresie 5–100 ug/ml i były one odpowiednio liniowe (1, r2= 0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2= 0.9998). Precyzja śróddniowa i międzydniowa [% RSD (względne odchylenie standardowe) wynosiła od 0,1 do 1,8%] i dokładność (95,6–104,2%) były akceptowalne przez UPLC dla 1–3. W badaniu UPLC określono ilościowo zawartość 1, 2 i 3 CTE na odpowiednio 254, 38 i 41 mg/g (rysunek S2).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO LECZENIA PACJENTÓW Z REKLAMĄ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. Walidacja UPLC/MS/MS

Glikozydy fenyloetanoidowe (1–3) zmieszano i wzbogacono homogenatem tkanki mózgu szczura i analizowano przy użyciu tandemowego spektrometru mas z ultrawydajną chromatografią cieczową (UPLC/MS/MS) z ekstrakcją w fazie stałej. Dolna granica wykrywalności (LLOQ) wynosząca 1–3 wynosiła 0,2 ng/ml. Odzysk glikozydów fenyloetanoidowych wzrósł w przypadku homogenatu tkanki mózgowej (10 ng/ml) odpowiednio na poziomie 91,39% dla 1, 89,54% dla 2 i 96,81% dla 3 (Rysunek 2).

2.4. Analiza tkanek mózgowych szczurów podobnych do AD

Po 14 dniach doustnego podawania CTE (200 mg/kg/dzień) zebrano tkanki mózgu szczura podobnego do AD, podzielono na dwie części, hipokamp i prążkowie, i obie homogenizowano. Ponieważ homogenaty hipokampa i prążkowia od każdego szczura były zbyt skąpe, aby można je było załadować do ekstrakcji w fazie stałej, oraz aby uniknąć nadmiernych błędów eksperymentalnych, homogenaty hipokampa i prążkowia od czterech pojedynczych szczurów zmieszano z analizowaną próbką do UPLC/MS/MS przy użyciu substancji stałej metoda ekstrakcji fazowej (Rysunek 3A, B). Glikozydy fenyloetanoidowe (1–3) obserwowano w hipokampie (ryc. 3A) i prążkowiu (ryc. 3B). Nie było znaczącego piku w pustych tkankach mózgu (ryc. 3C). W hipokampie zawartość echinakozydu wynosiła 11,97 ± 0,34 ng/ml, zawartość akteozydu 1,25 ± 0,16 ng/ml, a zawartość izoakteozydu 1,38 ± 0,08 ng /ml. W prążkowiu zawartość echinakozydu wynosiła 22,60 ± 1,69 ng/ml, zawartość akteozydu 2,03 ± 0,61 ng/ml, a zawartość izoakteozydu 4,90 ± 0,64 ng/ml. Jak pokazano na ryc. 4, CTE przejdzie przez barierę krew-mózg zgodnie ze znaczącymi wykrywalnymi ilościami 1–3 w hipokampie i prążkowiu. Zawartość 1 jest znacznie wyższa niż 2 i 3 we CTE według analizy UPLC (rysunek S2). Dlatego rozsądne jest zaobserwowanie, że 1 jest najwyższe w tkance mózgowej po doustnym podaniu CTE.

2.5. Glikozydy fenylotanoidowe (1–3) Aktywność chelatująca metale

W literaturze oznaczenie wolnych związków i ich kompleksów z metalami przeprowadzono metodą HPLC. W tym badaniu miarę aktywności chelatującej analizowano metodą UPLC. Roztwory 50 µg/ml każdego z glikozydów fenyloetanoidowych (1–3) dodano do 10 µg/ml roztworu miedzi (Cu), wapnia (Ca), magnezu (Mg), cynku (Zn), żelaza (Fe ) lub odpowiednio surowicę szczurzą. Każdy związek z każdym roztworem metalu lub surowicą analizowano metodą UPLC. Glikozydy fenyloetanoidowe (1–3) wykazywały działanie chelatujące metale z żelazem i surowicą (rysunek 5, materiały dodatkowe, rysunek S1).

2.6. Analiza echinakozydu (1) w surowicy szczurów in vivo

Aby zrozumieć rozkład echinakozydu w surowicy szczura, surowicę zbierano od początkowego czasu do 720 minut po doustnym podaniu echinakozydu (1) (100 mg/kg) i analizowano metodą UPLC. Figura 6 przedstawia profile stężenia echinakozydu w funkcji czasu w surowicy szczura.

3. Dyskusja

Demencja, zwłaszcza AD, jest nieodwracalną chorobą związaną ze starzeniem się i przewlekłą, która rodzi węzeł gordyjski pytań. Ta niemożliwa do pokonania choroba prowadzi do poważnych problemów ekonomicznych, wiążąc się z ogromnym i rosnącym obciążeniem finansowym. Na całym świecie badacze AD włożyli wiele wysiłku w zbadanie tej chorobynowe leki przeciw ADale nie udało się to w kilku dużych badaniach klinicznych ukierunkowanych na A w 2012 r. Z wyjątkiem bezpośredniego ukierunkowania na A, homeostazę jonów metali w mózgu uważa się za kluczową przyczynę związaną z agregacją i odkładaniem się A, co prowadzi do powstania AD. Dlatego też jony metali odgrywają zasadniczą rolę w patogenezie choroby Alzheimera, a hipoteza chelatacji metali stała się ważnym kierunkiem badań.

Według naszych wcześniejszych badań,CTE wykazało potencjalne działanie przeciw demencji. Nawet w badaniach klinicznych na ludziach, po 1 roku leczenia kapsułkami CTE u pacjentów z umiarkowaną chorobą Alzheimera, wynik podskali poznawczej w skali oceny choroby Alzheimera (ADAS-cog) nie wykazywał znaczącego pogorszenia w porównaniu do stanu przed leczeniem. CTE utrzymywało stabilny wynik ADAS-cog u pacjentów z AD, podczas gdy inne leki na receptę nie. Jedyny wybór licencjonowanych leków na receptęLeczenie ADto inhibitory acetylocholinoesterazy (AChEI), takie jakdonepezil i galantamina, które łagodzą objawy AD w krótkim okresie, ale pogorszenie następuje po 1 roku leczenia. Na podstawie badań klinicznych CTE ma szansę stać się potencjalną metodą leczenia opracowania leku przeciw AD. W oparciu o nasze poprzednie raporty, echinakozyd (1), akteozyd (2) i izoakteozyd (3) chronią neurony przed uszkodzeniem przez A, zmniejszają oligomeryzację A in vitro i znacząco łagodzą dysfunkcje poznawcze wywołane przez A in vivo. Badanie in vitro wykazało, że aktywne dawki 1–3 wynosiły do ​​5{{10}} µg/ml. Jednakże w poprzednich badaniach uznano, że biodostępność 1 i 2 po podaniu doustnym była bardzo niska (0,83% dla 1 i 0,12% dla 2) u szczurów. Związku 1 nie można było nawet zidentyfikować w ludzkiej surowicy po doustnym podaniu tabletki echinacei. Aktualne badania pokazują, że 1–3 miało słabą przepuszczalność błony i wchłanianie w komórkach jelitowych, a większość z 1 byłaby metabolizowana w przewodach żołądkowo-jelitowych. Zawartość związku 2 w surowicy szczura wynosiła jedynie około 4,5 µg/ml po 15 minutach dożylnego wstrzyknięcia dawki 10 mg/kg akteozydu. Jednakże badanie to pokazuje, że 1–3 można wykryć w hipokampie i prążkowiu tkanek mózgu szczura po doustnym podaniu CTE (ryc. 3 i 4). Dodatkowo, Figura 6 pokazała, że ​​zawartość związku 1 w surowicy szczura wzrosła około 5 razy od 15 minut do 720 minut po doustnym podaniu związku 1 (100 mg/kg). Uznaliśmy, że glikozydy fenyloetanoidowe CTE przejdą przez barierę krew-mózg i nastąpi działanie chelatujące pomiędzy CTE a metalem. Chelatacja jest odwracalną reakcją chemiczną. Żelazo jest niezbędnym pierwiastkiem w surowicy i mózgu [10,40]. Figura 5 pokazuje, że trzy glikozydy fenyloetanoidowe mają działanie chelatujące metale z żelazem i surowicą. Żelazo i surowica zmieniają obszar czasu retencji szczytowej trzech glikozydów fenyloetanoidowych. Chelatacja żelaza może być kluczowym powodem prowadzącym do błędnej identyfikacji bardzo niskiej biodostępności glikozydów fenyloetanoidowych. Dlatego też w analizie surowicy krwi i mózgu trzech glikozydów fenyloetanoidowych CTE należy uwzględnić aktywność chelatującą metale, aby ustalić rzeczywistą biodostępność i farmakokinetykę. Ponadto wyniki wykazały, że trzy glikozydy fenyloetanoidowe (1–3) przechodzą przez barierę krew-mózg i docierają do tkanek mózgowych poprzez krążenie w organizmie. W tym badaniu opracowano najszybszą i najczulszą metodę analizy 1–3 przy użyciu UPLC/MS/MS i dostarczono mocnych dowodów potwierdzających, że glikozydy fenyloetanoidowe (1–3) są głównymi bioaktywnymi składnikami CTE.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO ZAPOBIEGANIA CHOROBIE ALZHEIMERA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materiały i metody

4.1. Materiał roślinny

Łodygi C. tubulosa zebrano w maju 2016 r. w Hangzhou w Chinach. Roślinę zidentyfikowano na podstawie próbek dr Lin HC Voucher (nr 20016CT), które zdeponowano w firmie Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Chiny.

4.2. Izolacja i oczyszczanie

Wysuszoną łodygę C. tubulosa zmielono na proszek, a następnie ekstrahowano pięciokrotnie 75% EtOH. Po odparowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, surowy ekstrakt poddano chromatografii kolumnowej na żywicy Macroporous AB-8 z układami rozpuszczalników z gradientem H2O/EtOH od 20% EtOH do 100% EtOH. Zgodnie z chromatografią cienkowarstwową zebrano cztery frakcje (Fr.1~Fr.4) w celu dalszego rozdzielenia. ks. 2 poddano preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na kolumnie COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm x 20 mm średnicy wewnętrznej, 5 µm), stosując 18% acetonitryl jako układ fazy ruchomej. Szybkość przepływu wynosiła 15 ml/min. Zebrano selektywnie trzy główne interesujące piki. Frakcje zawierające docelowe związki dalej zatężono do sucha i otrzymano odpowiednio 1, 2 i 3.

4.3. Analiza eksperymentalna

Widma 1H i 13C NMR otrzymano stosując spektrometry Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, USA) z tetrametylosilanem (TMS) jako wzorcem wewnętrznym. Preparatywną HPLC przeprowadzono przy użyciu kolumny z odwróconymi fazami (kolumna Cosmosil C18-AR-II, średnica wewnętrzna 250 mm x 20 mm; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonia) na serii Shimadzu LC-6AD aparatura z detektorami Prominence HPLC UV-Vis (Kyoto, Japonia).

Echinakozyd (1): biały proszek; ESI−MS m/z: 785 [M − H]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1,07 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30 ), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{ {80}}}}.9 Hz, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J.=9.6 Hz, H-40 ), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800 ), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H-500 ), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600 ), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H-200 ), δ 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700 ); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}} ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50 ), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10 ), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200 ), 115,3 (C{{ 189}} ), 116,3 (C-500 ), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}} ), 127,6 (C-100 ), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300 ), 168,5 (C-900 ) (rysunek S3 – S5).

Akteozyd (2): biały proszek; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0,94 (3H, d, J =5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H-100 ), 4,70 (1H, t , J.=9.{{160}} Hz, H.-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}} ), 6,18 (1H, d, J.=15,9 Hz, H-80 ), 6,48 (1H, dd, J.=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J.=7.1 Hz, H.-5), 6,73 (1H, d, J.=2.0 Hz, H.{{57} }), 6,75 (1H, d, J.=7,9 Hz, H.-50 ), 6,97 (1H, d, J.=8,1 Hz, H-60 ) , 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H, d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{95} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{{110} } ), 71,7 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{170} } ) (Rysunki S6–S8). Izoakteozyd (3): biały proszek; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 1,07 (3H, d, J=6,1 Hz, H-6000 ), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J.=10.0 Hz, H.-100 ), 5,10 (1H, s, H.-1000 ), 6,27 (1H, d, J.=15 0,9 Hz, H-80 ), 6,45 (1H, dd, J=8.0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 0,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50 ), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60 ), 7,04 (1H, s, H-20 ), 7,46 ( 1H, d, J.=15,8 Hz, H.-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400 ), 70,6 (C-3000 ), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000 ), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9 (C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,6 (C-90 ) (Rysunki S9 – S11).

4.4. Przygotowanie wodnego ekstraktu C. Tubulosa (CTE)

Proszek z łodygi C. tubulosa ekstrahowano dwukrotnie, ogrzewając pod chłodnicą zwrotną z wodą przez 1,5 godziny, a roztwór ekstraktu przesączono. Przefiltrowany ekstrakt wodny (CTE) przechowywano przed użyciem w temperaturze 4°C.

4,5. Model zwierzęcy i harmonogram eksperymentów

Model szczurów typu AD i harmonogram eksperymentów zastosowane w tym badaniu były takie, jak opisano w naszym poprzednim badaniu [19]. Po wlewie A 1–42 (300 pmol/dzień) do komory mózgowej przez co najmniej dwa tygodnie lub dłużej, szczurom podobnym do AD podano doustnie CTE (200 mg/ml) następnego dnia. Po 14 dniach podawania szczury uśmiercano w celu pobrania tkanek mózgowych. Aby uniknąć nadmiernych błędów eksperymentalnych, próbki od czterech pojedynczych szczurów połączono w jedną próbkę. Dla każdej grupy były trzy próbki.

4.6. Chemikalia i odczynniki

Metanol (stopień HPLC) zakupiono od firmy Merck (Darmstadt, Niemcy). Kwas mrówkowy (98% do analizy, ACS) zakupiono od Panreac (Barcelona, ​​Hiszpania). Acetonitryl (klasa HPLC) zakupiono od JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Czystą wodę przygotowano w systemie ELGA (Woodridge, UK). Hesperydynę zakupiono od Chromadex i zastosowano jako wewnętrzny standard (IS) do analizy UPLC.

4.7. Aparatura UPLC/MS/MS

Do analizy UPLC/MS/MS zastosowano ultrasprawną chromatografię cieczową Waters Acquity TQD (UPLC)/MS/MS (Milford, MA, USA). Doświadczenia chromatograficzne przeprowadzono na kolumnie Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm, Waters) z elucją gradientową przy szybkości przepływu 0,4 ml/min. Faza ruchoma składała się z kwasu mrówkowego-wody (1:1000, v/v) (A) i kwasu mrówkowego-acetonitrylu (1:1000, v/v) (B). Program czasowy był następujący: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) zmienione na A–B (62:38, v/v); 5–7 min, AB (62:38, v/v); 7-7,1 min, AB (62:38, v/v) zmieniono na A–B (92: 8, v/v); 7,1–9 min, (92:8, v/v). Objętość wstrzyknięcia wynosiła 5 µl do układu UPLC/MS/MS ze źródłem jonów z ujemną jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI). Całkowite chromatogramy jonowe (TIC) dla 1–3 przeprowadzono przy użyciu trybu monitorowania wielu reakcji (MRM). Parametry masowe zoptymalizowano w celu uzyskania najczystszych sygnałów o dużej intensywności. Najlepszy dobór parametrów opisano jako napięcie kapilarne 3000 V, napięcie stożka 20 V, temperatura źródła 125 ◦C, temperatura desolwentacji 400 ◦C, przepływ gazu w stożku 50 L/h, przepływ gazu desolwentacyjnego 900 L/h i zderzenie 38 eV energia. Dane przetwarzano za pomocą oprogramowania MassLynx 4.1 (Milford, MA, USA).

4.8. Przygotowanie próbki

Do homogenizacji w tkance mózgowej szczura użyto 50% metanolu (1 g tkanki na 5 ml metanolu). Homogenat wirowano przy 10000 obr/min w temperaturze 4°C przez 10 minut. Do supernatantu (50 µl) z 10 µl IS (100 µg/ml) dodano czystą wodę do 1 ml. Mieszaninę ostrożnie załadowano na wkład Oasis HLB (zrównoważony hydrofilowo-lipofilowy) (Waters, Milford, MA, USA), który został już eluowany 1 ml metanolu, a następnie zrównoważony 1 ml wody w warunkach próżniowych. Po użyciu 1 ml 10% metanolu do przemycia wkładu, 1 ml metanolu użyto do elucji, aby otrzymać analizowaną próbkę, którą przeniesiono do innej 1,5 ml probówki Eppendorfa zawierającej 10 µl 1% roztworu kwasu askorbinowego i wysuszono przez odparowanie. Na koniec pozostałość z analizowanej próbki rozpuszczono w 200 µl 50% metanolu do analizy.

4.9. Przygotowanie krzywej standardowej kalibracji

Związki 1–3 wykorzystano do przygotowania standardów kalibracyjnych, odpowiednio dodanych do homogenatu tkanki mózgowej i hesperydyny jako standardu wewnętrznego w celu uzyskania końcowych stężeń wzorców kalibracji, które wynosiły 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50.0 i 100,0 ng/ml.

4.10. Walidacja

Krzywą wzorcową kalibracji uzyskano za pomocą testu liniowości przy użyciu pięciu różnych stężeń 1–3, w zakresach 1.0, 5.0, 10.0 , odpowiednio 50.0 i 100,0 ng/ml i uznano je za liniowe ze współczynnikiem determinacji powyżej 0,99 (R-kwadrat). Dolna granica wykrywalności (LLOQ), zdefiniowana jako ± 20% stężenia badanej próbki, powodowała powstanie szczytu sygnału, a nie szumu. Wiarygodność i dokładność metody analizy oceniano za pomocą testu odzysku przy 10 ng/ml w zakresie 1–3.

4.11. Test aktywności chelatującej metal

Do analizy efektu chelatującego metal zastosowano UPLC przy użyciu 50 µg/ml roztworu glikozydów fenyloetanoidowych CTE 1–3 zawierającego 10 µg/ml roztworu metalu miedzi, wapnia, magnezu, cynku, żelaza lub surowicy szczurzej. Każdy związek z każdym roztworem metalu lub surowicą analizowano metodą UPLC. Efekt chelatujący metal zmieniłby czas retencji o 1–3 w chromatografii cieczowej. Procent efektu chelatującego metal obliczono jak poniżej, a dane przedstawiały średnią ± SD (n=3).

5. Wnioski

Badanie to wykazało, że 1–3 to aktywne składniki CTE o działaniu przeciw AD. Chelatacja żelaza stała się nową koncepcją projektowania nowej generacji leków do leczenia AD.CTE jest potencjalnym botanicznym lekiem chińskim przeciwdziałającym ADukierunkowanie na agregację i osadzanie A wywołaną chelatacją żelaza. Ponadto udowodniliśmy dalej, że 1–3 dotrze do mózgu poprzez krew – barierę krew-mózg (BBB). Aktywne składniki i potwierdzenie mechanizmu leżącego u podstaw CTE znacznie ułatwią kontrolę jakości i biodostępność badań produktów w przyszłości. Jednocześnie przedstawiona zaawansowana i wydajna metoda analizy będzie przydatna do oznaczania 1–3 w roślinach, żywności, krwi i tkankach mózgowych na potrzeby badań chemicznych i farmakokinetycznych.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO LECZENIA CHOROBY ALZHEIMERA PHGS75% ECH 30% ACT 12%