Czy związek rzadkiego polimorfizmu genu Rs35667974 IFIH1 z chorobami autoimmunologicznymi jest przypadkiem epigenetyki RNA?

wizualizacja — AA, AP i EEE, nadzór — EEE i pozyskiwanie funduszy — EEE. Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu. Abstrakcyjny

Interferon indukowany genem białka 1 zawierającego domenę C helikazy (IFIH1) koduje cytoplazmatyczną helikazę RNA, znaną również jako 5 związana z różnicowaniem czerniaka (MDA5), helikazę RNA podobną do RIG-1-, która rozpoznaje wirusowe RNA i bierze udział w wrodzonym odporność poprzez rozpoznawanie wirusowego RNA. Po związaniu z dwuniciowym (ds) RNA, MDA5 tworzy włóknisty zespół wzdłuż długości dsRNA i wykorzystuje sygnatury molekularne do rozróżnienia siebie i obcego na podstawie długości dsRNA i metylacji. Jego wariant missense rs35667974 chroni przed cukrzycą typu 1, łuszczycą i łuszczycowym zapaleniem stawów, ale stwierdzono również, że wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, choroby Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego. Aby uzyskać wgląd w złożoną rolę tego wariantu, przeprowadziliśmy analizę strukturalną MDA5 w kompleksie z dsRNA przy użyciu symulacji dynamiki molekularnej.

Nasze dane sugerują, że chociaż mutacja Ile923Val wariantu rs35667974 nie wpływa znacząco na wiązanie z natywnym dsRNA, wykazuje efekt destabilizujący w obecności metylacji 2′-O urydyny. Zatem obecność 2′-O-metylacji w dsRNA wprowadza sygnaturę wyczuwającą, która prowadzi do selektywnej redukcji ogólnej aktywności katalitycznej MDA. Badanie to przedstawia ocenę roli wspólnego wariantu rs35667974 autoimmunologicznego locus IFIH1, o którym doniesiono, że prowadzi do selektywnej zmniejszonej aktywności katalitycznej zmodyfikowanego fenotypu MDA5, aw konsekwencji do zmniejszenia negatywnego sprzężenia zwrotnego na sygnalizację cytokin i chemokin oraz selektywną ochronę przed autoimmunizacją .

Domena C helikazy jest ważnym białkiem enzymatycznym, które może rozwinąć strukturę podwójnej helisy DNA. Może pomóc DNA w zakończeniu prawidłowej replikacji, edycji i dostarczania w procesie replikacji, naprawy i transkrypcji komórek i jest jednym z kluczy do normalnego funkcjonowania komórek. Jednocześnie odporność jest bardzo ważnym mechanizmem obronnym w organizmie człowieka, który może skutecznie chronić nas przed patogenami takimi jak bakterie i wirusy.

Badania wykazały, że domena helikazy C odgrywa ważną rolę w odporności. Po pierwsze, domena C helikazy może zapewnić stabilność i wydajność kodowania genów, pomagając w normalnej replikacji, naprawie i transkrypcji komórkowego DNA, poprawiając w ten sposób odporność organizmu ludzkiego. Po drugie, domena C helikazy może promować rozpoznawanie cząsteczek heterogeniczności białek przez komórki i regulować transdukcję sygnału układu odpornościowego, wspierając w ten sposób funkcje obronne organizmu. Obie powyższe metody odegrały pozytywną rolę w promowaniu utrzymania i wzmacniania odporności.

Ponadto dogłębne badanie związku między domeną helikazy C a odpornością stanowi dla nas ważną inspirację do odkrywania nowych leków do leczenia raka i chorób o podłożu immunologicznym. Opracowanie leków i terapia genowa ukierunkowana na domenę C helikazy może poprawić odporność organizmu na raka i inne choroby o podłożu immunologicznym oraz pomóc pacjentom lepiej radzić sobie z leczeniem i powrotem do zdrowia pokrewnych chorób.

Podsumowując, związek między domeną C helikazy C a odpornością jest bardzo ścisły i odgrywa istotną rolę w zapewnieniu stabilności genów, promowaniu odporności komórkowej i wspieraniu obrony organizmu. Mamy nadzieję, że dzięki odpowiednim badaniom i metodom leczenia będziemy w stanie lepiej utrzymać i wzmocnić ludzką odporność oraz stworzyć dla nas zdrowsze i lepsze życie. Z tego punktu widzenia musimy wzmocnić odporność osobistą. Cistanche ma znaczący wpływ na poprawę odporności, ponieważ pasta mięsna jest bogata w różnorodne substancje przeciwutleniające, takie jak witamina C, witamina C, karotenoidy itp. Składniki te mogą wychwytywać wolne rodniki i zmniejszać stres oksydacyjny. Stymulują i poprawiają odporność układu odpornościowego.

Kliknij zalety Cistanche Tubulosa

Słowa kluczowe

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) · Model molekularny · Interferon indukowany helikazą C domeną 1 (IFIH1) · Czerniak 5 związany z różnicowaniem (MDA5) · Metylacja RNA.

Wstęp

Geny i mechanizmy związane z chorobami autoimmunologicznymi, które dotykają około 5 procent populacji, wciąż pozostają nieuchwytne, ale gromadzące się dane zdecydowanie sugerują, że różne choroby autoimmunologiczne mogą mieć wspólne podłoże genetyczne, wskazując w ten sposób na istnienie wariantów, które są wspólne dla różnych chorób autoimmunologicznych (Żernakowa i in. 2009). Próba rozwikłania tej informacji genetycznej w biologicznie znaczące mechanizmy prowadzące do chorób odnosi się do identyfikacji genów przyczynowych. Identyfikacja wariantów chorobotwórczych jest trudnym, ale koniecznym zadaniem w próbie ustalenia skutecznych metod przewidywania choroby, zapobiegania jej i interwencji (Biros et al. 2005).

Różne typy cząsteczek RNA biorą udział w regulacji kilku procesów biologicznych, w tym informacyjnego RNA (mRNA), transferowego RNA (tRNA), rybosomalnego RNA (rRNA), mikroRNA (miRNA) i długiego niekodującego RNA (lncRNA). Cząsteczki RNA zawierają liczne (ponad 150) modyfikacje chemiczne (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Modyfikacje te są funkcjonalnie powiązane ze wszystkimi etapami metabolizmu RNA, takimi jak struktura, stabilność i interakcje, i odgrywają kluczową rolę w kilku procesach biologicznych, takich jak modulowanie replikacji wirusów i przeciwwirusowych odpowiedzi immunologicznych (Machnicka i in. 2013). Wśród nich metylacja rybozy jest jedną z najbardziej wszechobecnych modyfikacji występujących w RNA. 2′-O-metylurydyna znajduje się w rRNA, snRNA, snoRNA i tRNA Archaea, Bacteria i Eukaryota (Aučynaitė et al. 2018). Rybozo-2'-Ometylacja zwiększa hydrofobowość nukleotydów i chroni je przed działaniem nukleaz (Yildirim et al. 2014).
Coraz więcej dowodów wskazuje, że 2′-O-metylacja wirusowego RNA (2′OMe-RNA) odgrywa ważną rolę w unikaniu komórkowych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w komórkach gospodarza (Dimitrova i in. 2019). Züst i współpracownicy wykazali, że 2′ OMe wirusowego RNA przyczyniło się do unikania odpowiedzi przeciwwirusowej, w której pośredniczy interferon (IFN), promując w ten sposób replikację wirusa (Züst i in. 2011). Również Vitali i Scadden zaproponowali, że IU-dsDNA hamuje szlak stymulujący IFN MDA5 (Vitali i Scadden 2010).

Interferon indukowany genem helikazy C domeny 1 (IFIH1) koduje cytoplazmatyczną helikazę RNA znaną również jako MDA5 (białko 5 związane z różnicowaniem czerniaka) i jest to receptor podobny do RIG-I (RLR), który pełni funkcję przeciwwirusową we wrodzonej odporności poprzez wykrywanie wirusowych RNA. MDA5 rozpoznaje strukturę pnia dupleksu RNA 0,5–1 kb, która zwykle powstaje podczas replikacji pikornawirusa i pośredniczy w odpowiedzi immunologicznej na infekcję wirusową (Nejentsev i in. 2009; Crow 2011). MDA5, po wykryciu długich wirusowych dwuniciowych RNA (dsRNA), generowanych podczas replikacji pikornawirusów, aktywuje szlak sygnałowy interferonu typu I. Badania wykazały, że MDA5 tworzy włókno wzdłuż długości dsRNA i wykorzystuje dynamikę włókna zależną od ATP do rozróżnienia między własnym i obcym w oparciu o długość dsRNA (Toro i in. 2015). Wykazano, że MDA5 bierze udział w modulowaniu przesłuchu między komórkami a wrodzonym/adaptacyjnym układem odpornościowym poprzez lokalną produkcję cytokin i chemokin.

Zmiany w ekspresji i/lub aktywności MDA5 mogą wyzwalać odpowiedzi komórek beta na dsRNA, produkt uboczny replikacji wirusa (Colli et al. 2010). Wykazano również, że mutacja reszt związanych z tworzeniem płomienia prowadzi do utraty tworzenia włókien i sygnalizacji zależnej od MDA{5}, z wyjątkiem pary mutacji, które umiarkowanie wzmacniają sygnalizację. Wyniki te sugerują, że mechanizmy niezależne od ATP, tj. mocniejsze wiązanie RNA i/lub bardziej stabilne oddziaływanie białko-białko, prawdopodobnie będą odpowiedzialne za obserwowaną stabilność tworzenia się włókien MDA5 in vitro i za wyższą aktywność sygnalizacyjną w komórkach (Sohn i Hur 2016).

Smyth i in. (2006) oraz Nejentsev i in. (2009) opisali rzadki allel genu IFIH1, który zapewnia ochronę przed cukrzycą typu 1 (T1D). Ten polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) rs35667974 IFIH1, w którym konserwowana izoleucyna (kodon [ATT]) w pozycji # 923 zmienia się w walinę (kodon [GTT]), jest rzadkim wariantem, ponieważ częstotliwość mniejszego allelu (MAF) wynosi C {{ 9}}.010031 (2655 osobników w łącznej próbie 264690) na podstawie TOPMED (Taliun et al. 2021) i C = 0.016267 (3343 osobników w łącznej próbie 205514) na podstawie ALFA (Phan et al. wsp. 2020; Sherry i wsp. 2001). W Tabeli 1 przedstawiono ludzką biogeografię częstości polimorfizmu w różnych regionach kontynentalnych na podstawie danych projektu ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Kolejne badania potwierdziły, że ten rzadki allel miał taki sam wpływ na T1D, łuszczycę (PS) (Li i wsp. 2010) oraz łuszczycowe zapalenie stawów (ŁZS) (Budu-Aggrey i wsp. 2017). Wręcz przeciwnie, ten SNP został powiązany jako czynnik ryzyka podatności na rozwój zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (ZZSK) (Ellinghaus i wsp. 2016), choroby Leśniowskiego-Crohna (CD) (Ellinghaus i wsp. 2016; Budu-Aggrey i wsp. 2017) ) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) (Ellinghaus i wsp. 2016; Budu-Aggrey i wsp. 2017).

Chistiakow i in. (2010) wykazali, że mutacje powodujące utratę funkcji E627X i I923V MDA5 są związane z wytwarzaniem interferonu indukowanego niższym poli(I: C) w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej pacjentów z cukrzycą typu 1, a zatem chronią przed T1D. Stwierdzono również, że w cząsteczce MDA5 substytucja aminokwasu I923V znajduje się w pobliżu reszty H927, co przyczynia się do wiązania dsRNA (Yoneyama i Fujita 2008). Wykazano jednak, że wariant MDA I923V ma normalną zdolność wiązania dsRNA, ale 2, 5-}krotnie zmniejszoną aktywność katalityczną (Shigemoto i in. 2009). Dlatego wydaje się, że ten polimorfizm nie wpływa w istotny sposób na właściwości wiązania kwasu nukleotydowego tej cytoplazmatycznej helikazy wykrywającej RNA, ale zmienia jej funkcję za pomocą wciąż nieznanego mechanizmu.

Stwierdzono związek między polimorfizmem IFHI1 a częstością zakażenia enterowirusem w T1D oraz związek między wariantem MDA5 I923V a częstością enterowirusowego RNA u pacjentów z T1D (Looney et al. 2015). Ponadto ostatnie badania na myszach MDA{6}} i MAVSknockout wykazały kluczową rolę tych białek w pośredniczeniu w odpowiedziach interferonu typu 1 przeciwko wirusowi Coxsackie B (Wang i wsp. 2010). Wykazano, że liderowe białko mengowirusa zapobiega ekspresji IFN- poprzez blokowanie dimeryzacji IRF3 potrzebnej do aktywacji tego czynnika (Hato i wsp. 2007). Ta obserwacja sugeruje, że warianty, które zakłócają funkcję IFIH1 w odpowiedzi przeciwwirusowej gospodarza, zostały wyselekcjonowane negatywnie, a nie pozytywnie, ponieważ nadają ochronę przed T1D (Crow 2011).

Chow i in. (2018) obszernie przeanalizowali między innymi receptory podobne do RIG-I, podczas gdy Brisse i Ly (2019) dokonali obszernego przeglądu ewolucji i specjacji MDA5 i powiązanego z nim RIG-I. Lokalizacja zmienionych reszt w lub w pobliżu miejsc wiązania RNA i ATP lub interfejsu włókna doprowadziła nas do postawienia hipotezy, że obserwowane mutacje mogą zwiększyć stabilność włókna IFIH1 poprzez zwiększenie wewnętrznego powinowactwa między IFIH1 i dsRNA lub między IFIH1 molekuł we włóknie lub poprzez zmniejszenie wydajności hydrolizy ATP, a co za tym idzie, szybkości rozpadu włókna (Rice et al. 2014).

Ta praca przedstawia badanie strukturalne potencjalnej roli wspólnego wariantu rs35667974 autoimmunologicznego locus IFIH1, o którym doniesiono, że prowadzi do zahamowanego fenotypu funkcji kodującego podstawienie aminokwasu Ile923Val w produkcie białkowym genu IFIH1 MDA5. Ten ostatni jest biologicznie prawdopodobnym genem kandydującym na przyczynę, wspólnym dla kilku chorób, wpływającym na kontrolę lokalnej ekspresji cytokin i chemokin, które chronią przed autoimmunizacją (Colli i wsp. 2010). Ta praca ma na celu zbadanie nieznanego wciąż mechanizmu, dzięki któremu podstawienie Ile923Val zmniejsza aktywność katalityczną ludzkiego MDA5. W tym badaniu zbadaliśmy różnice w interakcji MDA5 z dsRNA między natywnym i rzadkim wariantem Ile923Val w inicjacji mechanizmu zapalenia. W związku z tym naszym celem było zbadanie dynamicznego zachowania ludzkiego kompleksu MDA5 / dsRNA w środowisku wodnym w obecności Ile923 lub Val923, gdy uracyl 2′-O jest metylowany lub nie. Ta analiza strukturalna rzadkich wspólnych loci podatności genetycznej lub ochrony może dostarczyć wglądu w nasze zrozumienie patofizjologii chorób autoimmunologicznych, a wyniki badań mogą wpłynąć na lepsze zarządzanie badanymi chorobami.

Materiały i metody

Odzyskiwanie sekwencji, konstrukcja drzewa filogenetycznego i analiza selekcji pozytywnej

Sekwencja białkowa Homo sapiens (identyfikator sekwencji: NP_071451.2) została pobrana z bazy danych UniProt (Konsorcjum UniProt 2021). Aby znaleźć homologi między gatunkami, przeprowadzono wyszukiwania BLAST za pomocą Mega BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) w bazie danych białek RefSeq i NR (oraz PDB i UniProt) przy użyciu Blastp (białko-białko BLAST) z parametry domyślne (Altschul i in. 1997). Wstępnie wybrano 1000 homologów ludzkich białek MDA5 i zastosowano selekcję międzygatunkową skupiającą się na domenie C-końcowej zawierającej sekwencję wokół podstawienia ludzkiego I923V w celu zidentyfikowania tej zmienności u innych gatunków. Clustal Omega, program dopasowywania wielu sekwencji (Clustal-O) (Sievers i in. 2011) oraz serwer dopasowywania wielu sekwencji T-Cofee (Notredame i in. 2000; Di Tommaso i in. 2011) zostały użyte do wykonania dopasowania sekwencji białek oraz oprogramowanie bioinformatyczne platformy Unipro UGENE (Okonechnikov i in. 2012) do selektywnej wizualizacji wielu dopasowań.

Analiza ewolucyjna służy do identyfikacji pozycji w sekwencjach białek, które są silnie konserwowane u różnych gatunków, co wskazuje na znaczenie strukturalne (Andreou i in. 2018). Drzewo filogenetyczne zostało skonstruowane przy użyciu metody największej wiarygodności (Nei i Kumar 2000) oraz modelu Tamura-Nei (Tamura i Nei 1993) z 500 powtórzeniami bootstrap (Felsenstein 1985). Początkowe drzewa do wyszukiwania heurystycznego uzyskano automatycznie, stosując algorytmy Neighbor-Join i BioNJ do macierzy odległości parami oszacowanych za pomocą modelu Tamura-Nei, a następnie wybierając topologię o najwyższej wartości logarytmu wiarygodności. Analiza filogenetyczna obejmowała 52 homologiczne sekwencje nukleotydowe (39 ortologów i 13 paralogów) ludzkiego genu IFIH1. Uwzględnione pozycje kodonów to 1. plus 2. plus 3. plus niekodowanie. W ostatecznym zbiorze danych było łącznie 3729 pozycji. Analizy ewolucyjne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania MEGA11 (Tamura i in. 2021).

Aby wykryć, czy gen IFIH1 ewoluował adaptacyjnie, użyliśmy programu codeml w pakiecie oprogramowania PAML v4.9j (Yang 2007). Sekwencję nukleotydową i odpowiedni plik dopasowywania sekwencji białek przesłano do PAL2NAL (Suyama i in. 2006) w celu utworzenia odpowiednich wejściowych plików dopasowywania nukleotydów CODEML. Analizy pozytywnej selekcji genów ortologów MDA5 przeprowadzono przy użyciu modeli miejsc i rozgałęzień (Yang i in. 2005; Yang i Bielawski 2000). Stosunek szybkości podstawień niesynonimicznych/synonimicznych (ω=dN/dS) stanowi miarę presji selekcyjnej na poziomie aminokwasów. Wielkość wartości dN/dS (ω) reprezentuje typy selekcji: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 dla pozytywnej selekcji (Yang i in. 2005). W CODEML wybrano modele miejsc (M0, M1, M2, M3, M7 i M8) oraz modele rozgałęzień (klady A i C) do przeprowadzenia analizy selekcji pozytywnej (Bielawski i Yang 2004; Yang i Nielsen 2002). W modelach miejscowych zastosowano test ilorazu wiarygodności (LRT) do przetestowania selekcji pozytywnej poprzez porównanie trzech par modeli (M0/M3, M2/M1 i M7/M8). Analizę przeprowadzono zarówno dla sekwencji pełnej długości, jak i sekwencji domeny C-końcowej (CTD).

Analiza strukturalna i symulacje dynamiki molekularnej

Struktura mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) włókna hMDA5-dsRNA w obecności ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) została wykorzystana jako system modelowy dla dynamiki molekularnej ( MD) symulacje. Rozdzielono wszystkie reszty białkowe (307–1020), 14 par zasad dwuniciowego RNA (dsRNA) i skoordynowany cynk zostały zachowane, podczas gdy brakujące reszty modelowano za pomocą serwera SWISS-MODEL (Waterhouse i in. 2018). Parametry pola siłowego i atomy wodoru zostały dodane przy użyciu modułu XLEaP AMBER 18 (Case et al. 2005). Pola sił AMBER f14SB (Maier et al. 2015) i f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) zostały użyte odpowiednio dla białka i RNA, z parametrami modrna08 (Aduri et al. 2007) dla zmodyfikowanych nukleozydów. Mutację I923V wprowadzono do MDA5 przez ręczne usunięcie grupy metylowej Cδ I923, podczas gdy zmodyfikowaną rybozę U12 metylowano w 2'-O przy użyciu reszty MRU biblioteki modrna08. Jon cynku związał się z 4 resztami cysteiny 907, 910, 962 i 964, stosując odpowiednie parametry pola siłowego, aby zachować tetraedryczną sferę koordynacyjną (długości wiązań Zn – S 2,35 Å przy 50 kcal·mol–1·Å–2 stałe siły i kąty S–Zn–S 109,5 stopnia przy 25 kcal·mol–1·rad–2).

W ten sposób przygotowaliśmy 4 systemy do symulacji MD: (i) natywny MDA5–dsRNA, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA(2′OMe) oraz (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Wszystkie układy solwatowano w skróconych oktaedrycznych pudełkach rozpuszczalników ze wstępnie zrównoważonymi cząsteczkami wody TIP3P, z minimalnym buforem 10 Å wokół kompleksu, a następnie dodano wymaganą liczbę przeciwjonów w celu uzyskania neutralizacji ładunku układów. Symulacje MD przeprowadzono z akcelerowaną przez GPU wersją modułu PMEMD (Salomon-Ferrer i in. 2{21}} 13) w AMBER 18 i krokiem czasowym 2 fs. Temperaturę regulowano za pomocą termostatu Langevina o częstotliwości kolizji 1,0 ps–1, natomiast ciśnienie regulowano za pomocą barostatu Berendsena o czasie relaksacji ciśnienia 1,0 ps. SHAKE zastosowano do ograniczenia wiązań obejmujących atomy wodoru z tolerancją 10–6 Å, podczas gdy interakcje niezwiązane obliczono z bezpośrednią granicą przestrzenną 10 Å.

Minimalizację energii przeprowadzono początkowo dla 1{{20}},{1}} kroków z ograniczeniami pozycyjnymi 100 kcal·mol–1·Å–2 stałej siły na atomach innych niż wodór MDA5-dsRNA. Rozpuszczalnik następnie zrównoważono w 300 K i 1 atm poprzez krótkie rundy symulacji w zespołach NVT i NPT, odpowiednio 100 ps i 400 ps, ​​zachowując ograniczenia dotyczące atomów innych niż wodór substancji rozpuszczonej. Następnie przeprowadzono minimalizację energii dla 10, 000 kroków, ale z ograniczeniami pozycyjnymi 10 kcal·mol–1·Å–2 tylko na atomach C MDA5 i fosforanowym szkielecie dsRNA. W 3 sub były stopniowo rozluźniane (10,0, 1,0, 0,1 kcal·mol–1·Å–2) przez 1 ns, po czym następowało 9 ns swobodnego równoważenia pod stałym ciśnieniem. Po tych początkowych 10 ns równoważenia (niewykorzystywanych w analizie) przeprowadzono 100 ns symulacji produkcji w zespole NPT dla każdego systemu przy 300 K i 1 atm, jednocześnie przechowując migawki systemu co 5, 0 ps do analizy przy użyciu CPPTRAJ moduł AMBER 18 (Roe i Cheatham 2013). Wszystkie rysunki przedstawiające modele 3D zostały wygenerowane przy użyciu systemu grafiki molekularnej PyMOL (wersja 2.3 open source).

Wyniki

Analiza filogenetyczna podstawienia Ile923Val MDA5

Ewolucja i specjacja MDA5 i powiązanego z nią RIG-I zostały obszernie omówione przez (Brisse i Ly 2019). Tutaj ewolucja IFIH1 została wykorzystana do zdefiniowania elementów konserwujących w sekwencji MDA5 o konkretnym polimorfizmie. Analiza ewolucyjna ujawniła konserwację ciężkich sekwencji wśród MDA5 różnych gatunków (984 z 1000 badanych sekwencji ma izoleucynę w pozycji równoważnej hMDA #923) w domenie RD/CTD, co wskazuje na strukturalne/funkcjonalne znaczenie. Polimorfizm rs35667974 w eksonie 14 ludzkiego genu powoduje konserwatywną mutację aminokwasową w pozycji 923 z Ile do Val w hMDA5. Istnieje jednak jeszcze szesnaście odległych gatunków, które mają tę samą pozycję zajmowaną przez walinę (ryc. 1), co wskazuje na żywotność tej zmiany między gatunkami w domenie RD / CTD MDA5 i ściśle homologicznej domenie RS / GY izoform X1, Helikazy X3 i DHX58 (ryc. 2). Ponadto dopasowanie sekwencji regionu wokół pozycji hMDA #923 (pętla interakcji MDA CTD) ujawnia umiarkowaną do wysoce konserwatywną sekwencję wśród odległych gatunków, co wskazuje na funkcjonalne znaczenie regionu między gatunkami.

Wykrywanie selekcji pozytywnej

Aby wykryć, czy gen IFIH1 wyewoluował adaptacyjnie, zastosowano modele miejsc i modele rozgałęzień, aby przeprowadzić pozytywną analizę selekcyjną ortologów całego genu i domeny CTD. W modelach miejsc nie zidentyfikowano żadnych miejsc pozytywnej selekcji dla domeny CTD (Tabela 2). M0 implikuje stałe tempo ewolucji (ω=dN/dS=0,2) (Tabela 2). Niektóre miejsca, które przeszły pozytywną selekcję, zostały zidentyfikowane przy użyciu metody modeli miejsc M2- i M8- dla całego genu (Suppl. Tabela 1), chociaż nie w regionach oddziałujących z RNA i domenie CTD. W modelach terenowych ω (dN/dS) wynosi<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

W szczególności dla modelu C oddziału oddziału dla domeny CTD (Suppl. Table 3), 33 procent witryn ewoluuje w kategorii ω 0=0. 036. Ponieważ strony rozwijające się w ramach tej kategorii nie rozróżniają rodzajów gałęzi, oba typy gałęzi mają taką samą wartość ω dla witryn należących do tej kategorii. Co więcej, 55 procent witryn ewoluuje w kategorii ω2. Jednak mają one wartości ω, które są uzależnione od typu gałęzi (ω20=0,25 i ω21=0). Również dla modelu C miejsca rozgałęzienia dla 39 genów ortologów MDA5 (tabela suplementu 4), 33 procent miejsc ewoluuje w kategorii ω 0=0. 027. Z drugiej strony 41 procent witryn ewoluuje w kategorii ω2. Jednak mają one wartości ω, które są uzależnione od typu gałęzi (ω20=0,25 i ω21=15,32).

Analiza strukturalna

Przeprowadzona analiza ewolucyjna pokazuje, że podstawienie Ile923Val nie jest unikalnym wariantem w gatunku ludzkim, ponieważ Val występuje w pozycji sekwencji MDA5 również u innych gatunków. MDA5 to wirusowy receptor dwuniciowego RNA (dsRNA), który odgrywa kluczową rolę w odporności przeciwwirusowej dzięki swojej wyraźnej swoistości względem wirusowego RNA (Wu i wsp. 20}13). Wykazano, że 2′-O-metylacja wirusowego mRNA jest ważna dla wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, dlatego zasugerowano, że 2′-O-metylacja jest molekularną sygnaturą umożliwiającą rozróżnienie własnego i obcego mRNA. (Zust i in. 2011). Aby zbadać potencjalną rolę podstawienia Ile923Val w wariancie zmiany sensu IFIH1 rs35667974, przeanalizowaliśmy strukturę mikroskopii krioelektronowej (krio-EM) włókna MDA5-dsRNA w obecności ATP (identyfikator PDB: 6GKM) (Yu i wsp. 2018). Pozycja 923 znajduje się w pętli 921–927, która oddziałuje bezpośrednio z dsRNA (ryc. 3A). W szczególności Ile923 znajduje się 4,8 Å od 2′-ΟΗ urydyny U12, a ich oddziaływanie jest stabilizowane przez wiązanie wodorowe między sąsiednim His927 a zasadą uracylu. Oczekuje się, że zastąpienie Ile923 przez Val w wariancie rs35667974 raczej nie wprowadzi żadnych starć sterycznych niż zminimalizuje interakcje z 2′-ΟΗ urydyny U12 (ryc. 3B). W przypadku, gdy RNA jest metylowany na rybozie U12, wówczas naturalny wariant MDA5 z Ile923 wykazuje korzystny kontakt van der Waalsa z grupą 2′-OMe U12 przy 3, 6 Å (ryc. 3C), podczas gdy Val923 z wariantu rs35667974 jest znajduje się w odległości 5,0 Å (ryc. 3D). Różnice te nie mogą sugerować głównego efektu podstawienia Ile923Val per se; jednak subtelne zmiany strukturalne często prowadzą do znaczących zmian funkcjonalnych poprzez zakłócenie dynamiki strukturalnej systemu.

Obliczenia dynamiki molekularnej

Aby zbadać wpływ mutacji I923V MDA5 na jej interakcję z dsRNA, zarówno natywnym, jak i 2′-Ο-metylowanym, zastosowaliśmy symulacje dynamiki molekularnej 4 systemów w skali czasu 100- ns. Dynamikę systemów monitorowano za pomocą fluktuacji średniej kwadratowej (RMSF) każdej reszty białkowej i odległości wiązania wodorowego H927 z U12 (ryc. 4). Nasze obliczenia sugerują, że mutacja I923 do V923 w MDA5 spowodowała niewielkie zaburzenie dynamiki w regionie kontaktowym RNA (reszty 923–934) i pętlę interakcji międzybiałkowej (950–955) kompleksu z natywnym dsRNA (ryc. 4C) . Ta obserwacja była podobna w przypadku 2′-O-metylacji w U12, chociaż zaobserwowano bardziej wyraźny efekt w ogólnej dynamice regionu karboksylowego mutanta MDA5 V923 (ryc. 4D).

Biorąc pod uwagę kluczowe oddziaływanie wiązań wodorowych sąsiedniej reszty H927 z zasadą uracylu, nasze symulacje MD sugerują, że metylacja w 2′-O nie wpływa na nią w natywnym MDA5 (ryc. 4E). Jednak mutacja V923 nie wpływa na wiązanie wodorowe H927 w natywnym dsRNA, ale wykazuje efekt destabilizujący w obecności 2′-O-metylacji (ryc. 4F). Podsumowując, nasze symulacje MD sugerują, że chociaż wpływ mutacji I923V MDA5 w interakcji z natywnym dsRNA jest marginalny, jej wpływ na dynamikę i stabilność kompleksu MDA5/RNA jest bardziej znaczący, gdy uracyl jest 2′-O-metylowany .

Dyskusja

To badanie przedstawia ewolucyjne i strukturalne badanie roli wspólnego wariantu rs35667974 autoimmunologicznego locus IFIH1, o którym doniesiono, że prowadzi do zmodyfikowanego fenotypu funkcjonalności dla MDA5 (Downes i in. 2010). Zastosowanie modeli miejsca ewolucyjnego i miejsca rozgałęzienia do przeprowadzenia analizy selekcji pozytywnej wskazuje na brak miejsc selekcji pozytywnej w miejscach interakcji RNA, w których występuje polimorfizm rs35667974. Ani modele oddziałów nie wskazują, że żadne konkretne witryny nie przeszły pozytywnej selekcji w domenie CTD.

Jest to zgodne z bardzo niskimi częstotliwościami pojawiania się wariantu Ile923Val nawet wśród populacji ludzkiej (Tabela 1). Niemniej populacja europejska w porównaniu z innymi ma różnicę w częstości allelu C o jeden rząd wielkości. Nie zapominając o małej liczebności próby, geograficzne rozmieszczenie badanego polimorfizmu pokazuje, że jego pojawienie się w populacji europejskiej jako punkt wyjścia może wynikać z warunków życia i odżywiania, które zmieniły się w ostatnich latach. Badanie strukturalne roli badanego SNP przeprowadzono poprzez zbadanie struktury kompleksu dsRNA – MDA5 (natywnego i zmutowanego).

Na poziomie tworzenia kompleksu dsRNA–MDA5 wprowadzenie mutacji Ile923Val wpływa na interakcję domeny C-końcowej białka (CTD) z dsRNA poprzez wprowadzenie hydrofobowej wnęki obok cukru rybozy jednoniciowego dsRNA . Pokazaliśmy, że w przypadku metylowanego RNA na łańcuchu fosforybozylowym jednej nici dalsze efekty dynamiczne mogą wpływać na interakcję mutanta, nie wpływając na typ dziki. Jest to zgodne z badaniami eksperymentalnymi (Looney i in. 2015; Brisse i Ly 2019) pokazującymi, że wpływ polimorfizmu Ile923Val zidentyfikowanego w pobliżu punktu interakcji MDA5 – dsDNA może nie wpływać na natywne właściwości wiązania dsRNA, ale zmienione przez 2.5-krotna redukcja aktywności katalitycznej (Shigemoto et al. 2009). Ponadto badania dynamiki molekularnej wykazały krytyczną rolę metylacji w mutancie, jeśli chodzi o ruchliwość i stabilność pętli MDA5 941–959 i 970–977 zaangażowanych w interakcję dsRNA i interakcję międzybiałkową w tworzeniu włókna MDA. Takie efekty mogą utrudniać zespół włókien MDA5, asocjację MDA5 – MAVS i zespół włókien MAVS, które dodatkowo aktywują ekspresję genów interferonu typu I (IFN1: IFN i IFN). W przypadku T1D i PsA w konsekwencji obniżony poziom aktywności białka MDA5, a co za tym idzie mniejsza produkcja IFN chroni przed autoimmunizacją. Obserwacje te sugerują, że kilka wariantów IFIH1, o których przewiduje się, że będą wpływać na interakcję MDA5 z MAVS i zmniejszenie produkcji IFN, zmniejszy ryzyko chorób, podczas gdy normalna funkcja MDA5 jest z nimi związana (Shigemoto i in. 2009).

Prowadzi to do wniosku, że podobnie jak w przypadku wirusowego RNA, samo-dsRNA metylacja, mutacja zidentyfikowana w RNA, jest ważnym czynnikiem selekcyjnym/aktywacyjnym dla wprowadzenia efektów ochronnych w niektórych chorobach autoimmunologicznych. Wyniki niniejszego badania poszerzają wiedzę na temat biologicznego znaczenia SNP rs35667974 locus IFIH1 w rozwoju wyżej wymienionych chorób i podkreślają znaczenie badań wspólnych genów z wieloma chorobami autoimmunologicznymi. Jednak w badaniach populacyjnych dotyczących genetycznego powiązania SNP z chorobami autoimmunologicznymi, przy użyciu np. PCR-RFLP, sekwencjonowania lub genotypowania, przypadek metylacji RNA nie jest brany pod uwagę. Dlatego ważne jest poznanie stanu metylacji oddziałującego dsRNA i jego wpływu na allel MDA5. Podobnie jak w przypadku wirusowego rozpoznawania dsRNA (Wu et al. 2013) i rozróżnienia między własnym i obcym mRNA (Züst et al. 2011), utrata grupy metylowej z oddziałującego MDA5, jak w przypadku mutant Ile923Val MDA5, może wpływać na tworzenie włókien i indukcję interferonu typu I.

Warto zauważyć, że Plenge i in. (2013) wcześniej omawiali potencjał rzadkiego wariantu genu odpowiedzialnego za chorobę jako potencjalnego celu terapeutycznego dla interwencji farmaceutycznej. W tym celu funkcja biologiczna wariantu sprawczego musi być znana przy każdej próbie powiązania odkryć genetycznych z nowym celem terapeutycznym. Dlatego zlokalizowanie wariantu sprawczego w strukturze 3D odpowiedniego białka i zbadanie jego roli z punktu widzenia strukturalnego/funkcjonalnego w szlaku patogenetycznym prowadzącym do choroby autoimmunologicznej wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla dalszego postępowania i lepszego leczenia pacjenci. Pozostaje nadrzędna potrzeba wyjścia poza odkrycie powiązanych SNP do głębszego zrozumienia wariantów przyczynowych w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i ścieżek choroby. Konieczna jest dalsza analiza strukturalno-funkcjonalna w celu zbadania wiązania samodsRNA metylowanego rybozą -2 ′-Ο z MDA5 i wpływu tego na składanie fibryli MDA5. Nieuchwytna biologiczna rola 2′-Ο-metylowanego mRNA jako czujnika rozróżnienia między wirusowym i własnym mRNA w indukcji interferonu typu I mogła zostać rozszerzona na czujnik ochronny w niektórych autoimmunopatiach.

Wniosek

Rzadki polimorfizm genu rs35667974 IFIH1 chroni przed T1D, PS i ŁZS, podczas gdy allel IFIH1 noszony przez większość populacji predysponuje do zachorowań. Stwierdzenie, że mutant Ile923Val MDA5 działa inaczej w interakcji z samo-dsRNA, a w szczególności z 2′-O-metylowanym, sugeruje, że w niektórych przypadkach warianty oddziałujące z metylowanym dsRNA zakłócają tworzenie włókien MDA5, interakcje MAVS i tworzenie włókien oraz Sygnalizacja IFN, podobnie jak w odpowiedzi przeciwwirusowej gospodarza, mogła zostać wyselekcjonowana negatywnie, ponieważ zapewnia ochronę przed chorobami.

Autorskie Wkłady

Konceptualizacja — AA, AP, EEE i GNG, metodologia — AA, AP i EEE, walidacja — AA, AP, MIZ, GNG i EEE, dochodzenie — GNG, AA, AP i MIZ, zasoby — GNG, AA, AP i MIZ, gromadzenie danych — AA i AP, pisanie i przygotowywanie oryginalnej wersji roboczej — EEE, GNG, AA, AP i MZ, pisanie, recenzowanie i redagowanie manuskryptu — AA, AP, MZ, GNG i EEE, wizualizacja — AA, AP i EEE, nadzór — EEE i pozyskiwanie funduszy — EEE. Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowanie

Fundusze otwartego dostępu zapewnia HEAL-Link Greece. Praca ta była wspierana w ramach projektu „INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization” (Grant MIS 5002550), który jest realizowany w ramach Akcji „Wzmocnienie infrastruktury badawczej i innowacyjnej” finansowany z Programu Operacyjnego „Konkurencyjność, przedsiębiorczość i innowacyjność” (NSRO 2014-2020) oraz współfinansowany przez Grecję i Unię Europejską (Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego).

Dostępność danych

Zbiory danych wykorzystane i/lub przeanalizowane podczas bieżącego badania są dostępne na żądanie u odpowiedniego autora.

Deklaracje

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu manuskryptu lub w decyzji o opublikowaniu wyników.

Zatwierdzenie etyczne

Nie dotyczy.

Zgoda na udział

Nie dotyczy.

Zgoda na publikację

Nie dotyczy.

Otwarty dostęp

Ten artykuł jest objęty licencją Creative Commons Attribution 4.0 International License, która zezwala na używanie, udostępnianie, adaptację, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku lub w dowolnym formacie, pod warunkiem, że odpowiednio uznasz oryginalnego autora (autorów) ) i źródło, podaj link do licencji Creative Commons i wskaż, czy wprowadzono zmiany. Obrazy lub inne materiały osób trzecich w tym artykule są objęte licencją Creative Commons, chyba że wskazano inaczej w linii kredytowej do materiału. Załóżmy, że materiał nie jest objęty licencją Creative Commons, a zamierzone użycie jest niezgodne z przepisami prawa lub wykracza poza dozwolone użycie. W takim przypadku musisz uzyskać pozwolenie bezpośrednio od właściciela praw autorskich.

Bibliografia

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P i in. (2007) Parametry pola sił AMBER dla naturalnie występujących zmodyfikowanych nukleozydów w RNA. J Chem Theory Comput 3: 1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA i in. (1997) Gapped BLAST i PSI-BLAST: nowa generacja programów do przeszukiwania baz danych białek. Kwasy nukleinowe Res 25:3389–3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Strukturalne i ewolucyjne spostrzeżenia w obrębie rodziny genów deacetylazy polisacharydowej Bacillus anthracis i Bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Identification of a 2′-O-methyluridine nucleoside hydrolase using the metagenomic librarys. Cząsteczki.

5.Berman HM, Westbrook J, Feng Z i in. (2000) Bank danych białek. Kwasy nukleinowe Res 28:235–242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Metoda największej wiarygodności do wykrywania dywergencji funkcjonalnej w poszczególnych miejscach kodonów, z zastosowaniem do ewolucji rodziny genów.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Geny pośredniczące w interakcjach środowiskowych w cukrzycy typu 1.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: baza danych szlaków modyfikacji RNA. Aktualizacja 2017. Kwasy nukleinowe Res 46: D303 – D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Porównawcza analiza struktury i funkcji receptorów podobnych do RIG-I: RIG-I i MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE i in. (2017) Rzadki allel kodujący w IFIH1 chroni przed łuszczycowym zapaleniem stawów. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com