Inhibitor JAK blokuje indukowaną przez COVID-19-cytokiny sygnalizację JAK-STAT-APOL1 w komórkach kłębuszkowych i podocytopatię w organoidach ludzkich nerek Ⅱ

Nasze wyniki zmieniają obecny paradygmat indukcji interferonemNefropatia APOL1-. Kilka przykładów wktóre wysokie stany interferonu powodowały zapadnięcie się glomerulopatii u nosicieli wysokiego ryzykaAPOL1genotypdoprowadziło do paradygmatu, który uprzywilejowywał interferony jako główne wyzwalacze drugiego uderzenia APOL1-za pośrednictwemglomerulopatia (31, 36, 37). Paradygmat ten został dodatkowo wzmocniony faktem, że interferon alfa, beta,i indukowane promieniowaniem gammaAPOL1ekspresja w hodowanych liniach komórek podocytowych i śródbłonkowych (22). Jednakże,Ten archetyp jest kwestionowany przez obserwację, że interferony nie zawsze są podwyższone w surowicypacjenci zZakażenie COVID-19i COVAN, podczas gdy inne cytokiny, w tym IL-6, IL-1 i Illinois-18są zwiększone (4, 17, 18). W obecnym badaniu wykazaliśmy, że nawet w przypadku braku interferonów,te cytokiny niebędące interferonem indywidualnie i zbiorowo indukowane są silneAPOL1wyraz w człowiekupodocyty i GEC, podkreślając jednocześnie niedoceniany wcześniej synergizm. Demonstrującnasze wyniki dostarczają, że sygnalizacja JAK-STAT jest głównym mediatorem tych połączonych efektów cytokinwiarygodne wyjaśnienie, w jaki sposób napędza burzę cytokinową-19 COVIDAPOL1ekspresja i wysokośćczęstość występowania glomerulopatii zapadającej obserwowana u pacjentów z wariantem ryzykaAPOL1ICOVID-19infekcja. Odkrycia te mogą mieć konsekwencje dla innychNefropatie1-za pośrednictwem APOL.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z nami pod adresem:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Tel/Whatsapp: +86 15292862950

Chociaż nasze wyniki to pokazująCytokiny indukowane przez COVID-19-są wystarczające do wywołaniaAPOL1wyrażeniei spowodować utratępodocyty mikroorganoidów nereknie wykluczają możliwości, że SAR-Jak ostatnio donoszono, CoV-2 może również bezpośrednio infekować komórki nerek (38, 39). Jednak SARs-CoV-2w tkance nerek człowieka wykazano jedynie w próbkach z sekcji zwłok, w których wystąpiły czynniki zakłócającenie można wykluczyć udziału autolizy tkanek (3, 4, 15, 16). Większość raportów z biopsji nerekpacjentów z COVAN nie udało się wykryć wirusa SARs-CoV-2 pomimo zastosowania czułych metod (3, 4),w tym dwa z dziewięciu przypadków w bieżącym badaniu, które zostały przetestowane metodą immunohistochemiczną i inhybrydyzacja na miejscu.

Wykazując podocytopatię indukowaną przez cytokiny, nasz model mikroorganoidów nerkowych odbiegał od modeluniedawno opublikowanyorganoid nerkowymodel choroby nerek za pośrednictwem APOL1-opracowany przez Liu i wspwygenerowano organoidy nerkowe z iPSC edytowanych w CRISPR dawcy spoza Afryki, w których G0APOL1allele zmieniono na allele G1, ale na podłożu genetycznym G0. Podczas gdy indukowane interferonem gammaAPOL1ekspresji w ich organoidach, nie powodował cytotoksyczności (40). Brak cytotoksyczności w ichorganoid nerkowymodel mógłby wyjaśnić mniej toksyczne tło genetyczne, na którym mutacje G1nakładały się. Wiadomo, że cytotoksycznośćAPOL1na haplotyp ma wpływ jego genetykatło (41). Themikroorganoid nerkowyw niniejszym badaniu wygenerowano z nieedytowanych iPSCafroamerykańskiego nosiciela o genotypie G1G2. Zachowanie rodzimego haplotypu genetycznego możeprzyczyniły się do cytotoksyczności związanej z APOL1-obserwowaną w naszych badaniachmikroorganoidy nerek.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Ponadto, w przeciwieństwie do zwiększonej ekspresji białka APOL1, którą tu opisujemy, niedawne badanienie znalazł żadnej różnicy wAPOL1Poziom mRNA w biopsji nerki jednego pacjenta z COVAN w porównaniu zzdrowe kontrole (26). Tę rozbieżność w naszych wynikach można wytłumaczyć przejściowym charakteremAPOL1mRNA w stosunku do białka, zwłaszcza gdy biopsje wykonano kilka tygodni po biopsjidiagnoza zakażenia COVID-19 w przypadku ostrych skutków burzy cytokinowej wywołanej przez COVID-19-iodpowiedni profil ekspresji mRNA mógł się rozproszyć. Można sobie wyobrazić, że jest ten dalejz burzy cytokin wywołanej przez{{0}COVID, tym słabsze są reagenty ostrej fazy znajdujące się poniżejstają się receptory cytokin, w tym fosforylowane białka STAT iAPOL1mRNA. Nasze wynikisugerują, że indukowane białko APOL1 utrzymuje się poza nimAPOL1mRNA i fosforylowane STAT.

Badanie to ma trzy główne implikacje kliniczne. Po pierwsze, podkreślają potrzebę genotypowania Czarnego lubU Latynosów wykryto glomerulopatię zapadającą w związku z aktywnym lub niedawno przebytym zakażeniem wirusem COVID-19infekcja. Jeśli jednakbiopsja nerkinie jest wykonalne ani możliwe,APOL1genotypowanie Blacka lubOsoby zakażone wirusem COVID-19-latynoski, u których występuje nowy lub nasilający się białkomocz, a AKI prawdopodobnie równieżwysoki plon. Po drugie, ponieważ wiele cytokin-19-indukowanych przez COVID nadmiernie aktywuje JAK-STATdroga do wywołaniaAPOL1ekspresja, strategia terapeutyczna oparta na selektywnym usuwaniu lubJest mało prawdopodobne, aby hamowanie jakiejkolwiek cytokiny było skuteczne w zapobieganiu lub leczeniu COVAN. Obecnie,baricytynib jest dopuszczony do stosowania wyłącznie na podstawie zezwolenia na stosowanie w nagłych przypadkach w leczeniu COVID-19wymagające dodatkowego tlenu. Dlatego jego potencjał w leczeniu COVAN wymaga poważnych działańnależy wziąć pod uwagę, zwłaszcza w przypadku czarnych i latynoskich nosicieli wysokiego ryzykaAPOL1genotypy, które mająZakażenie COVID-19. Wreszcie, w oparciu o dowody wskazujące, że niedobór interferonu jest związany z ciężkimi objawamizakażeniem wirusem COVID-19, zaproponowano podawanie interferonu w leczeniu COVID-19. NaWedług ClinicalTrials.gov, w chwili pisania tego tekstu przeprowadzono trzydzieści sześć badań klinicznych nad interferonem w leczeniuCOVID-19 są w toku lub zostały zakończone. W przeciwieństwie do uzasadnienia tych badań klinicznych, naszWyniki ostrzegają przed podawaniem interferonów w leczeniu zakażenia COVID-19 u nosicieliwysokie ryzykoAPOL1genotyp, ponieważ interferony mogą zwiększać ekspresję patogenuAPOL1Wthenerki i osad COVAN.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Nasze badanie ma kilka ograniczeń. Seria naszych przypadków COVAN obejmująca dziewięć zapadnięć potwierdzonych biopsjąprzypadków glomerulopatii dotyczy stosunkowo małej próby i mogła spowodować niedoszacowanie związkumiędzy genotypem wysokiego ryzyka a COVAN lub podlegały stronniczości próbkowania. Wyzwanie logistyczneuzyskiwanie biopsji nerek od pacjentów z aktywnym zakażeniem COVID-19 na oddziałach intensywnej terapii ograniczaczęstotliwośćbiopsje nerekw tej populacji. Prawdopodobnie ten sam czynnik jest za to odpowiedzialnywiększość biopsji w tym badaniu przeprowadzono kilka tygodni do miesięcy po wstępnej diagnozieZakażenie COVID-19. Może dostarczyć analiza biopsji nerek uzyskanych bliżej czynnika wywołującego infekcjędodatkowe informacje na temat wczesnych fenotypów komórkowych. Ponadto obecne badanie nie wskazuje, ktoi kiedy leczyć COVAN inhibitorami JAK. Odpowiedzi na te pytania i ustalenieskuteczność hamowania JAK w leczeniu COVAN będzie przedmiotem przyszłych badań.Ta praca podkreśla związek wysokiego ryzykaAPOL1genotyp i rola JAK-STAT-APOL1sygnalizacja w rozwoju COVAN. W miarę ewolucji naszego rozumienia pandemii-19istnieje pilna potrzeba zwiększenia świadomości lekarzy i zdrowia publicznego na temat powikłań nerkowychCOVID-19. Istnieje również pilna potrzeba terapii COVAN. Nasze badanie dostarcza nowych danych na temat JAKinhibitory jako silnych kandydatów terapeutycznych dla COVAN1-związanego z APOL.

Metody

Przeciwciała i odczynniki.

Zastosowano przeciwciała pierwotne przeciwko następującym białkom: królik APOL1anty-ludzkie [Genentech, 3.1C1 i 3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (stężenie końcowe 0,05 ug/ml);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (końcowe stężenie 0,95 ug/ml) zgodnie z ostatnim raportem (42)];Mysi APOL1 anty-ludzki [Genentech, 4.17A5; Immunofluorescencja [IF] 1:2000 (stężenie końcowe2,13 µg/ml)]; mysie GAPDH anty-ludzkie (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); Winkulinamysie anty-ludzkie (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); Mysz NEPH1 anty-ludzka (Santa CruzBiotechnologia, sc373787; WB 1:300); Królicze przeciwciało anty-ludzkie WT1 (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1mysie anty-ludzkie (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); Króliczy STAT2 anty-ludzki(CST, 72604: WB 1:1000); mysie anty-ludzkie STAT3 (CST, 9139; WB 1:1000); FosforylowaneSTAT1 (Y701) królicze anty-ludzkie (CST, 9167; WB 1:1000); Fosforylowane-STAT2 (Y690) królicze antyczłowiek (CST, 88410; WB 1:1000); Fosforylowane-STAT3 (Y705) królicze anty-ludzkie (CST, 9145; WB1:2000); PODXL kozie anty-ludzkie (R&D, AF1658; IF 1:500), królicze E-kadheryny anty-ludzkie (komórkoweSygnalizacja, 3195S; IF 1:200), mysi NEPH1 anty-ludzki (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). Wtórnyprzeciwciała obejmowały kozie przeciwciało przeciwkrólicze IgG, przeciwciało połączone z HRP (CST, 7074s; WB 1:1000); antykońmysie IgG, przeciwciało połączone z HRP (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 sprzężony anty osłamysz (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 skoniugowane anty-oślekoza (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) i osioł sprzężony Alexa Fluor 405przeciwkrólicze (Thermo Scientific, A48258; 1:000). W przypadku qRT-PCR, testów ekspresji genów TaqManobejmował APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) i PECAM-1 (Hs00169777_m1).Barwienie immunohistochemiczne nerek pod kątem APOL1, synaptopodyny i CD31. Zaczynając od utrwalonej formalinypreparaty do biopsji nerek zatopione w parafinie, ekstrakcję antygenu przeprowadzono przy użyciu (roztwór EDTA o pH 8.0)przez 56 minut w temperaturze 100 stopni. Pierwotne przeciwciała przeciwko APOL1 (5.17D12, Genentech), synaptopodyna (ProgenBiotechnik, 61094) i CD31 (Cell Signaling, 3528s) zastosowano w proporcji 1:4000 (końcowe stężenie 0,95ug/mL), odpowiednio 1:100 i 1:1600 przez 60 minut w temperaturze 36 stopni. Gotowy do użycia koniugowany HQwtórne multimery przeciwkrólicze (760-4815) inkubowano przez 12 minut w temperaturze 36°C. To było przestrzeganeprzez dodanie anty-HQ HRP na 12 minut. DAB (760-159) inkubowano przez 5 minut w pomieszczeniutemperatura. Skrawek tkanki barwiono kontrastowo hematoksyliną (760-2021) przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.Dodano odczynnik niebieszczący (760-2037) na 4 minuty w temperaturze pokojowej.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Leczenie cytokinami hodowanych komórek.

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych, pierwotne podocytypobrano z nerki ludzkiego dawcy, a podocyty pochodzące z organoidów traktowano 50 ng/ml,Stężenie 20 ng/ml lub 10 ng/ml następujących cytokin: Rekombinowany ludzki CXCL9(Biolegend, 578102); Rekombinowany ludzki CXCL10 (Biolegend, 573502); Rekombinowany człowiekCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); Interferon (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbeta (Peprotech, 300-02BC); IFN gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alfa (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Standaryzowane stężenie cytokin wynoszące 50 ng/ml zostało wcześniej określone na podstawie precedensuterapie komórkami ludzkimi oceniające zespoły wstrząsu cytokinowego w zakażeniu COVID-19 (17). Podejmować właściwe krokiw eksperymentach stosowano stężenia 20 ng/ml i 10 ng/ml. Kolejne zabiegi, łącznie z organoidamii eksperymenty z podocytami pochodzącymi z organoidów przeprowadzono przy użyciu 10 ng/ml. inhibitor JAK 1/2,baricytynib (INCB028050) (Selleckchem, S2851) stosowano w końcowym stężeniu 10 uM we wszystkicheksperymenty.

Hodowla pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych. Zamrożonystado pierwotnego człowieka niskiego ryzyka (G0G0).komórki śródbłonka kłębuszków zakupiono od Celprogen (36066-05), rozmrożono i hodowano na ludziachKompletna pożywka do hodowli pierwotnych komórek śródbłonka kłębuszków z surowicą, niezawierająca antybiotyków (Celprogen,M36066-05SA) na płytkach pokrytych zastrzeżoną macierzą zewnątrzkomórkową (Celprogen, E36066-05-PD10 iE36066-05-12No cóż) w wilgotnym środowisku, w temperaturze 37 stopni i 5% CO2. Komórki pasażowano przy użyciu 1XTrypsyna EDTA (Celprogen, T1509-014). Komórki wykorzystano do eksperymentów pomiędzy pasażami 2 do 4.Komórki walidowano metodą qRT-PCR, wykazując wzbogacenie w ekspresję genu PECAM1 (komórki śródbłonkamarker, znany również jako CD31).

Izolacja kłębuszkowa z subkultury ludzkiej nerki i podocytów dawcy.Nerka ludzkiego dawcy byłauzyskano za pośrednictwem Krajowej Wymiany Badań nad Chorobami (NDRI). Genotyp dawcy APOL1 byłG0G1. Izolację kłębuszków przeprowadzono metodą sitową zaadaptowaną z wcześniejszej publikacji (43,44). W skrócie, pracując na lodzie w sterylnym kapturze, najpierw odkapsułowano nerkę i przecięto ją na pół w połowie strzałkowej. Wypreparowano rdzeń, pozostawiając korę. Następnie korę zmielonoi przepuszczano kolejno przez sita ze stali nierdzewnej (rozmiary 425 µm, 250 µm) i zbierano nana górze trzeciego sita (150 µm) podczas częstego przemywania wstępnie schłodzoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)z 1% BSA (bez wapnia i magnezu) (Endecotts, Sita 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Zebrano kłębuszki, odwirowano i ponownie zawieszono w 5 ml PBS. 10 µl próbkibarwiono odczynnikiem NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) i wizualizowano za pomocą mikroskopu świetlnego. Następnie kłębuszki inkubowano w buforze trawiącym[DMEM/F12, 1 mg/ml każdego z (kolagenazy I, IV i V), DNazy I (50 U/ml lub 50 µg/ml)] w 37 stopniach1 godz. w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 z 10% FBS (systemy badawczo-rozwojowe,S10350H) w celu zatrzymania trawienia i próbkę odwirowano przy 450 g minut w temperaturze 4°C.Wyizolowane podocyty hodowano w Advanced RPMI (Fischer Scientific, MT10040CV) z 10% FBSi 1% penicyliny-streptomycyny (Thermo Fisher Scientific, 15070063) na płytkach pokrytych witronektyną(StemCell Technologies, 07004) w temperaturze 37 stopni i 5% CO2. Subhodowle komórek były widoczne po ~5 dniach ileczono po 2 tygodniach hodowli.

Ekstrakcja białek i Western blot.Wszystkie płytki hodowlane i próbki utrzymywano w temperaturze 4 stopni. Monowarstwakomórek poddano lizie i zebrano przy użyciu buforu Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, 9803) przy całkowityminhibitor miniproteazy i inhibitor fosfatazy (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Próbki poddano sonifikacji na poziomie 4 przez 10 sekund każda, odwirowano przy 12000 obr./min x 5 min, supernatantzebrano do nowej probówki Eppendorfa i oznaczono stężenie białka za pomocą testu białkowego BCA(Pierce, 23225). Lizaty białkowe rozcieńczono 4x buforem do próbek LaemmLi 2-merkaptoetanolem(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) i ogrzewano w temperaturze 95-100 przez 5 minut. Lizaty białkowenastępnie rozdzielono przy użyciu bezplamiących żeli Criterion TGX (4-20%) i przeniesiono przy użyciu Bio-Rad TransSystem transferu Blot Turbo. Przeniesione membrany blokowano przez 1 godzinę w 3% odtłuszczonym mleku buforowanym Trissolą fizjologiczną i inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia postandardowe płukanie, membrany inkubowano z wtórnym sprzężonym peroksydazą chrzanowąprzeciwciała przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem za pomocą systemu obrazowania Bio-Rad ChemiDoc MPzgodnie z instrukcjami producenta.

Ekstrakcja RNA i qRT-PCR.RNA wyizolowano z monowarstwy komórek przy użyciu buforu do lizy RLT iZestaw Qiagen RNEasy Mini (74106) zgodnie z instrukcją producenta. RNA transkrybowano na cDNA przy użyciuOdczynniki i protokół odwrotnej transkryptazy Invitrogen SuperScript IV (Thermo Fisher, 18091050).Reakcje qRT-PCR przeprowadzono z użyciem Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) i testy ekspresji genów przy użyciu systemu QuantStudio 6 Flex(Thermo Fisher Scientific) przy ∆∆Ct metoda z GAPDH jako genem referencyjnym.

Genotypowanie.DNA ekstrahowano z bloków tkanki FFPE przy użyciu zestawu QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen, 56404) zgodnie z protokołem producenta. Genotypowanie przeprowadzono przy użyciu Applied BiosystemsTesty dyskryminacji allelicznej Taqmana dla polimorfizmu G1 SNP (p.Ser342Gly) i G2(p.Asn388_Tyr389del) przy użyciu systemu QuantStudio 6 Flex. Test ten ma 100% specyficzność analityczną iczułość analityczna (granica wykrywalności) wynosząca 1,0ng DNA do wykrywaniaAPOL1warianty ryzyka w DNAekstrahowany z monocytów krwi obwodowej. Testy zostały wcześniej zweryfikowane poprzez porównanie wyników zsekwencjonowanie bezpośrednie (sekwencjonowanie Sangera). Środki kontroli jakości genotypowania obejmowały użycierepliki techniczne, 100% dopasowanie kontroli pozytywnych każdego genotypu i kontroli negatywnych.

Wyprowadzenie mikroorganoidu nerkowego iPSC pacjenta G1G2.Mikroorganoidy nerek uzyskano wedługopublikowany protokół (27) z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, indukowane ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)dysocjowano na pojedyncze komórki przy użyciu TrypLE Select i wysiano na płytki pokryte witronektynąPożywka StemFlex (Thermo Fisher Scientific, A3349401) z 10uM inhibitorem kinazy Rho (TocrisBioscience, 1254) przy gęstości 11,000-14,000 komórek/cm2 i hodowano w wilgotnym środowisku o godz37 stopni i 5% CO2. Komórki następnie przenoszono na pożywkę TeSR-E6 (Stemcell Technologies, 05946) za pomocą8 µM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) przez 4 dni. Od dnia 5 do dnia 7 komórki traktowano200 ng/ml FGF9, 1 µg/ml heparyny i 1 µM CHIR99021. W dniu 7 komórki przemyto PBS ioddzielony od TrypLE. Zdysocjowane komórki następnie przemyto zwykłym DMEM i odwirowano w temp300xg przez 5 minut. Osad komórkowy ponownie zawieszono w pożywce Stage 1 [TeSR-E6 zawierający 200 ng/mlFGF9, 1 µg/ml heparyna, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA, 10 µM inhibitor kinazy Rho (Tocris Bioscience)]i przeniesiono do 24-studzienkowej płytki AggreWell 400 (Stemcell, 34411) w ilości około 1,2 milionakomórki/studzienka. Płytkę następnie wirowano przy 100xg przez 3 minuty i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni i5% CO2 w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 48 godzinach (dzień7+2) organoidy z AggreWell byłyprzeniesiono do płytki z 6-dołkami o niskim przyleganiu z pożywką Stage 2 [TeSR-E6 zawierającą 200 ng/ml FGF9, 1µg/ml heparyny, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA] na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze komórkowym przez kolejne 72godziny. Od dnia 7+5 wszystkie organoidy odświeżano pożywką Etap 3 [zawierającą TeSR-E60.1% PVA] w kolejne dni, aż do użycia w eksperymentach.

Izolacja podocytów z mikroorganoidu.Izolację kłębuszków z organoidów nerek przeprowadzono na podstawie aopisany wcześniej protokół (45). W skrócie, grupy organoidów nerkowych pochodzących z iPSC z inicjałempoczątkowy numer komórki 1,2x106 iPSC rozdzielono przez inkubację z TrypLE Select (ThermoFishera) przez 5 minut w temperaturze 37 stopni. W celu ułatwienia delikatne mieszanie za pomocą pipety o pojemności 1 ml co 2-3 mindysocjacja. Na grupę, pojedyncze sitko komórkowe 70 µm (PluriSelect) umieszczono w probówce o pojemności 50 mL (Falcon)i siatkę uwodniono PBS. Roztwór komórek dodano do pipety o pojemności 1 ml, umożliwiając przepływrozwiązania pod wpływem grawitacji. Za pomocą tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml pobrać pozostałą komórkęroztwór wychwycony na sitku delikatnie przepchnięto przez sito. Sitko przemytoPBS i odrzucono, utrzymując przepływ komórek. Następnie przesączony przez komórki pipetowano do wstępnie uwodnionego roztworuSitko do komórek 40 µm (Pluriselect) i umieszczono na świeżej probówce o pojemności 50 mL (Falcon), umożliwiając pojedynczym komórkomprzepłynąć grawitacyjnie i obficie przemyć sito PBS w celu usunięcia wszelkich pozostałościkomórki. Następnie zebrano największe kłębuszki z sitka komórkowego o średnicy oczek 40 µm, odwracając sito naświeżej probówki o pojemności 50 ml i przemyto PBS w celu wypłukania wychwyconych kłębuszków. Ten proces byłpowtórzyć, stosując przepływ z procesu 40 µm przy użyciu końcowego sitka komórkowego 30 µm (PluriSelect) dozebrać mniejsze kłębuszki. Hodowano wyizolowane kłębuszki z organoidów nerek pochodzących z IPSCpłytki pokryte witronektyną z zaawansowanym RPMI 1640 zawierającym 10% FBS w standardowej hodowli komórkowejinkubator w temperaturze 37 stopni plus 5% CO2. Pożywki odświeżano co drugi dzień aż do wykorzystania komórekeksperymenty.

Barwienie immunofluorescencyjne, mikroorganoid.Mikroorganoidy nerek przemyto PBS iutrwalony w 4% PFA w PBS przez 30-45 min na lodzie. Następnie utrwalone organoidy przemyto trzykrotnie PBS,i inkubowano w 30% sacharozie w PBS przez noc w temperaturze 4°C. Organoidy zatopiono w OCT ipoddano kriosekcji 10 µm za pomocą kriostatu Laica. Krioskrawki organoidów przemywano trzykrotnierazy PBS, a następnie blokowano buforem blokującym 1 (1% żelatyny rybiej, 2% surowicy osła, 0,3% TritonX-100 w PBS) przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie krioskrawki inkubowano z pierwotnymprzeciwciała w buforze blokującym 1 przez noc w temperaturze 4 stopni. Krioskrawki przemywano trzykrotnie PBS. Popo przemyciu, krioskrawki inkubowano z wtórnymi przeciwciałami w buforze blokującym 1 przez 2 godziny w pomieszczeniutemperatura. Po pięciu przemywaniach PBS, krioskrawki mocowano za pomocą środka zapobiegającego blaknięciu Prolong Glassrozwiązanie montażowe (Thermo Scientific, P36980). Obrazy fluorescencyjne wygenerowano przy użyciu ECHOmikroskop.

Barwienie immunofluorescencyjne, podocyt.Hodowle podocytów przemyto PBS i utrwalono w 4% roztworzePFA w PBS przez 10-15 min w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu komórki przemywano trzykrotnie PBSi blokowano w buforze blokującym 2 (1% żelatyny rybackiej, 2% surowicy oślej, 0,1% saponiny w PBS) przez 30-60min. Komórki inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi w buforze blokującym 2 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej(lub na noc w temperaturze 4 stopni). Komórki przemyto trzykrotnie buforem blokującym 2 i inkubowano z nimprzeciwciała wtórne w buforze blokującym 2 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech myciachbufor blokujący 2 i jedno końcowe płukanie PBS, komórki zawieszano za pomocą Drop-n-Stain EverBritemedium montażowe (Biotium, 23008). Obrazy fluorescencyjne rejestrowano przy użyciu mikroskopu ECHO.

Testowanie żywotności. W celu pomiaru żywotności komórek i ATP na płytkach umieszczono podocyty pochodzące z organoidówna płytkę z dołkami 96-pokrytymi witronektyną w 100 ul pożywki (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) i hodowano w Advanced RPMI+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) w wilgotnym środowisku w temperaturze 37 stopni i 5% CO2. Pochodzące z organoidówpodocyty jednocześnie wysiano na płytkę z 6-studzienkami, które miały być użyte do ekstrakcji RNA do qPCR ina płytkę z 24-studzienkami do wykorzystania w badaniach immunohistochemicznych (IHC). Komórki traktowano przy konfluencji ~80%.z sześcioma warunkami [kontrola, IFNG (10 ng/ml), IFNG (10 ng/ml) + baricytynib (końcowe stężenie 10uM),Wszystkie cytokiny (10 ng/ml) i wszystkie cytokiny (10 ng/ml) + baricytynib (końcowe stężenie 10 uM)]. Głoska bezdźwięcznazmieniono po 48 godzinach, a komórki oceniano po 96 godzinach. 96-płytkę dołkową poddano obróbce przy użyciu programu Promegatesty żywotności komórek i ATP, jak wspomniano poniżej; płytkę z 6-studzienkami poddano obróbce pod kątem RNAekstrakcja, synteza cDNA i qRT-PCR; i 24-płytkę dołkową utrwalono w 4% PFA dla IHC. CellTiterFluorTMTest żywotności komórek (Promega, G6080) i CellTiter-Glo® 2.0 Test (Promega, G9241) byłwykonywane przy użyciu standardowych instrukcji protokołu dostarczonych przez producenta. Testy były multipleksowanewedług protokołu. Fluorescencję (nielityczny test proteazy) i luminescencję (lityczny test ATP).mierzono za pomocą fluorometru SpectramaxM3. Różnica miar została określona przez Studentaniesparowany test t.

Statystyka.Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SD. Do danych wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism 8.3.1analysis. Cytokine conditions inducing >1,5 krotnieAPOL1transkrypt w porównaniu z kontrolą traktowaną pożywkąanalizowano pod kątem istotności za pomocą testu t dla niesparowanych grup z korektą Holma-Sidaka dla wielokrotnościporównania. Podane wartości p są skorygowanymi wartościami p. Znaczenie ustalono na p<0.05.

Zatwierdzenie badania. Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Duke,Karolina Północna. IRB nie wymagała świadomej zgody pacjenta ze względu na część dotyczącą tego przypadkubadanie było retrospektywnym przeglądem wyłącznie klinicznego i archiwalnego materiału patologicznego. Ludzka nerka dlaIzolację kłębuszków nerkowych i subkulturę podocytów uzyskano w ramach National Disease ResearchWęzeł przesiadkowy (NDRI); to badanie tkanki ludzkiej zostało również wstępnie zatwierdzone przez IRB Duke'a. NDRwymaga, aby wszystkie miejsca pobrania tkanek uzyskały świadomą zgodę od dawcy tkanki lub surogatki.

Autorskie WkładySEN, GL, SD, KS i DS przeprowadzali eksperymenty i redagowali manuskrypty. AW i DT wykonały izinterpretował histopatologię i IHC oraz zredagował manuskrypt. GH dostarczył niezbędne odczynniki i zredagowałrękopis. SEN i OAO zaprojektowały badanie, przeanalizowały i zinterpretowały dane, zaprojektowały liczby inapisał i zredagował rękopis.

PodziękowanieTa praca została wsparta przez 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 i nagrodę Whitehead Scholar Award(OAO); SEN otrzymał wsparcie w ramach grantu szkoleniowego Duke Nephrology T32 (5T32DK007731-24). DziękujemySuzie Scales (Genentech) za hojny prezent w postaci przeciwciał specyficznych dla APOL1-. Dziękujemy BadaniomLaboratorium histologiczne w Duke BRPC i Steven R. Colon w PhotoPath na Wydziale Patologii Duke'a.

Bibliografia

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S i in. AKI u hospitalizowanych pacjentów z COVID-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL i in. Ostre uszkodzenie nerek u pacjentówhospitalizowany z powodu Covid-19.Nerka Int.2020;98(1):209-18.

3. May RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS i in. Wieloośrodkowa kohorta retrospektywnabadanie określa spektrum patologii nerek w chorobie wywołanej koronawirusem 2019 (COVID-19).Nerka Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M i in. AKI i upadekGlomerulopatia związana z COVID-19 i genotypem wysokiego ryzyka APOL 1.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95.

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI i in. Stowarzyszenietrypanolityczne warianty ApoL1 z chorobą nerek u Afroamerykanów.Nauka.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ i Pollak MR. Nefropatia APOL1: od genetyki do zastosowań klinicznych.Clin J Am SocNefrol.2020.

7. Friedman DJ i Pollak MR. APOL1 i choroba nerek: od genetyki do biologii.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A i in. Mutacje zmiany sensu w APOL1genu są silnie powiązane z ryzykiem schyłkowej choroby nerek, przypisywanym wcześniej genowi MYH9.Hum Genet.2010;128(3):345-50.