Wielotorbielowatość nerek

ali.ma@wecistanche.com

Część Ⅱ: Organoidy nerek generowane z komórek progenitorowych erytroidów pacjentów z autosomalnie dominującą wielotorbielowatością nerek

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice i in.

Tło:Nerkaorganoidy zostały szeroko uzyskane z dostępnych w handlu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC); jednak dużym wyzwaniem było skuteczne wytworzenie modeli organoidalnych nerek od pacjentów z autosomalnie dominującą policystycznąnerkachoroba (ADPKD), która podsumowuje zarówno embriogenezę, jak i mechanizmy cystogenezy.

Kliknij, aby uzyskać skutki uboczne cistanche i korzyści dla nerek

Metody: progenitory erytroidalne krwi (EP) z dwóch ADPKD (autosomalnie dominujące policystycznenerkachoroby) i jednego zdrowego dawcy (HC) zastosowano jako kontrolę porównawczą w celu normalizacji wielu etapów technicznych przeprogramowania EP i generowania organoidów. zostały zróżnicowane w organoidy kanalików nerkowych, a następnie stymulowane przez forskolinę w celu wywołania tworzenia torbieli.

Wyniki: iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) pochodzące z EP wykazywały wszystkie cechy pluripotencji i były zdolne do różnicowania się we wszystkie trzy listki zarodkowe. Organoidy kanalikowe 3D zostały wygenerowane z pojedynczych komórek po 28 dniach w Matrigel. HC i ADPKD(autosomalny dominujący policystycznynerkachoroby) organoidy nie tworzyły samoistnie cyst, ale po stymulacji forskoliną w ADPKD (autosomalnie dominująca policystycznanerkachoroba) organoidy, ale nie w organoidach pochodzących z HC.

Wniosek: Wyniki tego badania wykazały, żenerkaorganoidy zostały pomyślnie wygenerowane z komórek EP krwi ADPKD (autosomalny dominujący policystycznynerkachoroby) pacjentów i zdrowego dawcy kontrolnego. Takie podejście powinno stanowić potężne narzędzie dla embrionównerkamodel rozwoju, który jest w stanie podsumować bardzo wczesne mechanizmy patofizjologiczne zaangażowane w cytogenezę.

KLIKNIJ TUTAJ, ABY CZĘŚCIĆⅠ

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisaliśmy szczegółowo procedurę wytwarzania organoidów nerkowych z ludzkich iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) uzyskanych z komórek progenitorowych krwinek erytroidalnych pacjentów z ADPKD (autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek). Wiele typów komórek somatycznych zostało pomyślnie przeprogramowanych w iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste), w tym komórki krwi [Z]. W tym przypadku zdecydowaliśmy się użyć progenitorów erytroidalnych krwi jako wyjściowego typu komórek z wielu powodów, takich jak ich integralność genomowa, pamięć epigenetyczna i skuteczne przeprogramowanie [11,17,18]. Wydajność, dzięki której progenitory erytroidalne zostały przekształcone w iPSC, była aż o dwa rzędy wielkości lepsza (7 procent -28 procent) niż wydajność zróżnicowanych typów krwinek (0.0 2 proc. -00,60 proc.)lub fibroblastów (0,74 proc.)[Z]. Pomimo niskiej liczebności tych komórek we krwi obwodowej, można je łatwo izolować i namnażać in vitro, aby wyprodukować wystarczającą liczbę do przeprogramowania. Jednym z najważniejszych wyzwań przy ustalaniu odpowiednich iPSC jest ich zmienność genotypowa i fenotypowa [6], ale istnieją pewne techniczne strategie proponowane do obejścia lub zmniejszenia takiej zmienności. W niniejszych eksperymentach zastosowaliśmy nieintegrujący system episomalny do przeprogramowania, który nie wymaga integracji genomu w celu ekspresji przeprogramowujących genów [10], co pozwala na mniejszą immunogenność i sprawia, że ​​komórki są bardziej stabilne genetycznie [19, 20]. Co więcej, wszystkie próbki pochodziły z tego samego źródła, co pozwala zminimalizować zmienność epigenetyczną [12] przy założeniu, że zróżnicowanie komórki wyjściowej może wpływać na efektywność wyników końcowych. Analiza markerów pluripotencji i zdolności iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) do różnicowania się we wszystkie trzy listki zarodkowe porównano obok siebie, a także porównano je z embrionalną linią komórkową H9, którą zastosowano jako kontrolę pozytywną . Wszystkie te porównania nie wykazały istotnych różnic między pacjentami z ADPKD (autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek), HC i komórkami H9.

Opracowano kilka protokołów indukowania różnicowania iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) w organoidy nerek [13, 21]. Na podstawie protokołów opisanych przez Cruz et al. [6] uzyskaliśmy struktury o charakterystyce kanalików proksymalnych, w tym ekspresję NHE3 i AOP1. Ponadto organoidy wykazywały ekspresję NPHS2, co wskazuje na obecność komórek podobnych do podocytów.

Odwrotnie, AQP2 nie ulegało ekspresji w tych organoidach kanalikowych. To odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi badaniami wskazującymi na kilka ograniczeń w opracowywaniu struktur pochodzących z pączka moczowodu (UB) in vitro, z rozwojem UB wymagającym określonych protokołów, ponieważ okno czasowe na dodanie określonego induktora jest bardzo ograniczone [ 6,22,23].

W procesie generowania organoidów nerkowych z iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) cała embriogeneza nerek jest rekapitulowana in vitro, początkowo obejmując tworzenie kawitowanych sferoidów z pojedynczych komórek [14]. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że niezróżnicowane iPSCss (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) zarówno od pacjentów z ADPKD (autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek), jak i od zdrowej grupy kontrolnej, tworzyły podobne do epiblastu struktury sferoidalne, które były podobne morfologicznie. Chociaż w niniejszym badaniu nie przeprowadzono sekwencjonowania DNA genów PKD1 i PKD2, aktualne wyniki wskazują, że rodzaj mutacji niesionej przez pacjentów nie miał wpływu na typową morfogenezę epiblastu. Wciąż potrzebne są dalsze badania, aby dokładniej ocenić ekspresję kluczowych cząsteczek zaangażowanych w tę fazę rozwoju embrionalnego.

Zgodnie z protokołem opracowanym przez Freedman et al. [14], zaobserwowaliśmy, że sferoidy różnicowały się w kanalikowe organoidy 26 dni po indukcji różnicowania, a czas był podobny zarówno dla pacjentów z ADPKD (autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek), jak i HC (ryc. ③). Niemniej jednak zauważyliśmy pewną zmienność dotyczącą harmonogramu ekspresji i poziomów markerów różnicowania. Z drugiej strony morfologia struktur kanalikowych była podobna i porównywalna w próbkach od pacjentów z ADPKD i HC. W przeciwieństwie do tego, stosując iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) pochodzące z biopsji nerek pacjentów z ADPKD (autosomalnie dominującą wielotorbielowatością nerek), grupa Cruz i wsp. wykazała większą zmienność zdolności tych komórek do tworzenia organoidów [6]. Oprócz ogromnej różnorodności mutacji właściwych dla tej choroby, różnice w skuteczności pozyskiwania organoidów można również wytłumaczyć heterogenicznymi typami komórek obecnymi w próbkach biopsyjnych, w przeciwieństwie do erytroidalnych progenitorów, które stanowią bardziej jednorodną populację komórek. Podsumowując, wyniki te wskazują, że pomimo zmienności i różnic w wydajności różnych klonów iPSC do tworzenia organoidów nerkowych, otrzymanie tych ostatnich od pacjentów z ADPKD (autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek) może stanowić unikalny model do badania wielu postaci objawów fenotypowych tej choroby. Ponadto należy zauważyć, że jeśli istnieje znaczna zmienność mutacji w populacji dotkniętej ADPKD, specyficzne dla pacjenta iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) są całkowicie kompatybilne z odpornością, mogą być w przyszłości stosowane w indywidualnych terapiach regeneracyjnych , oprócz umożliwienia opracowania modelu in vitro w celu sprawdzenia, czy bardzo wczesne objawy fenotypowe są również tak zróżnicowane, jak obraz kliniczny.

Niestymulowane organoidy pochodzące od pacjentów z HC lub ADPKD (autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek) nie tworzyły samoistnie cyst. Typowa morfologia cyst i ekspresja markerów cystogenezy nie były wykrywalne w żadnej próbce, nawet przedłużając różnicowanie organoidów w hodowli do ukończenia 35 dni. Wykazano, że sama proliferacja komórek nie wytwarza cyst [24]. Co więcej, trzecie niezależne zdarzenie (znane jako trzecie uderzenie) jest wymagane do przyspieszenia tworzenia i wzrostu torbieli in vivo [23]. Odwrotnie, tworzenie torbieli wywołane przez forskolinę wystąpiło w organoidach od pacjentów z ADPKD, ale nie u tych z HC. Warto zauważyć, że chociaż obecne, cysty były obserwowane w niskim odsetku w próbkach ADPKD nawet w obecności forskoliny, jak również zaobserwowali Freedman i in. [14] w organoidach utworzonych z modelu choroby ADPKD CRISPR/Cas9. Można postawić pewne hipotezy wyjaśniające niską częstość występowania torbieli w niniejszym modelu. 1) Organoidy hodowane w środowisku zawiesiny 3D wykazały znacznie wyższą wydajność cystogenezy w porównaniu z organoidami przylegającymi [6], co wskazuje, że mikrośrodowisko jest bezpośrednio związane z cystogenezą. 2) Protokół eksperymentalny zastosowany w niniejszym badaniu utworzył organoidy kanalików proksymalnych, ale nie dystalne części nefronu [23]. Chociaż ze wszystkich segmentów nefronu mogą pochodzić cysty, w tym kanaliki proksymalne [25], najwyraźniej te pochodzące z przewodów zbiorczych wydają się być większe i liczniejsze niż te z innych segmentów [26], 3) Wreszcie niedawno wykazano, że cysty może wiązać się z obecnością wielu mutacji PKD1, które determinują ciężkość choroby oraz że tworzenie torbieli w przewodach zbiorczych było związane z nasileniem choroby [27, 28].

Podsumowując, niniejsze odkrycia wykazały, że możliwe jest wytworzenie organoidów o trójwymiarowych strukturach podobnych do architektury progenitorowej nerek za pomocą iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) przeprogramowanych z progenitorów erytroidalnych, które można łatwo wyizolować z ADPKD (autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek). pacjentów i że te organoidy są w stanie tworzyć cysty pod wpływem stymulacji forskoliną. Ta obiecująca metodologia ujawnia metodę pogłębiania wiedzy na temat bardzo wczesnych etapów genetycznych, fenotypowych i fizjologicznych powstawania torbieli w przypadku ADPKD (autosomalnej dominującej wielotorbielowatej choroby nerek).

Bibliografia

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomalna dominująca wielotorbielowatość nerek: podstawa programowa 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:26530876

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatyczna mutacja w poszczególnych torbielach wątroby wspiera dwutorowy model cystogenezy w autosomalnej dominującej wielotorbielowatości nerek. Mol Cell, 2: {{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P i wsp.: Somatyczne mutacje PKD2 w poszczególnych torbielach nerek i wątroby wspierają model cystogenezy „dwóch uderzeń” w autosomalnej dominującej wielotorbielowatości nerek typu 2. Soc Nephrol, 10; 1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Krytyczny przełącznik rozwojowy określa kinetykę powstawania torbieli nerkowych po utracie Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD i in.: Uszkodzenie nerek jest trzecim trafieniem promującym szybki rozwój wielotorbielowatej choroby nerek u dorosłych. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: Organoid cystogeneza ujawnia kluczową rolę mikrośrodowiska w ludzkiej policystycznej chorobie nerek. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Indukcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z kultur fibroblastów. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007,418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ i wsp.: Zmniejszona policystyna rzęskowa-2 w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych od pacjentów z zespołem policystycznych nerek z mutacjami PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Pochodzenie indukowanych wolnych od transgenów pluripotencjalnych komórek macierzystych z pojedynczej kropli krwi. //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wolne od sekwencji wektorowych i transgenu. Nauka, 324: 797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/nauka. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Etap różnicowania określa potencjał komórek krwiotwórczych do przeprogramowania w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM i wsp.: Wydajne pozyskiwanie ludzkich komórek iPS przez nieintegrujący się plazmid z komórek krwi z unikalnymi sygnaturami epigenetycznymi i ekspresji genów. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Organoidy nerkowe pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych: technologia in vivo podobna do in vivo. Eur J Pharmacol, 790: 12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06 059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V i wsp.: Modelowanie choroby nerek za pomocą zmutowanych organoidów nerkowych CRISPR pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych sferoidów epiblastycznych. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. Obaii J. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Ujednolicone kryteria diagnostyki ultrasonograficznej ADPKD (autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek). Jam Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T i in.: Inhibitor ROCK umożliwia przeżycie zdysocjowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Wysokowydajny system do generowania i badania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka. Cel/ Komórka Macierzysta. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420