LIMIT to immunogenny LncRNA stosowany w odporności na nowotwory i immunoterapii

Abstrakcyjny

MHC-I prezentuje antygeny nowotworowe limfocytom T CD8+ i wyzwala odporność przeciwnowotworową. Ludzie mogą mieć 30,000-60,000 długich niekodujących RNA (lncRNA). Jednakże pozostaje słabo poznane, czy lncRNA mogą wpływać na odporność nowotworu. Tutaj identyfikujemy LncRNA zdolny do indukowania MHC-I i immunogenności nowotworu (LIMIT) u ludzi i myszy. Odkryliśmy, że stymulowany IFN LIMIT, LIMIT klaster genów białka wiążącego guanylan aktywowany cis (GBP) LIMIT, a GBP zakłócają powiązanie między HSP90 a czynnikiem szoku cieplnego-1 (HSF1) - powodując w ten sposób aktywację HSF1 i transkrypcję MHC-I maszyny, ale nie PD-L1. Aktywacja LIMIT CRISPR pod kontrolą RNA wzmocniła GBP i MHC-I oraz wzmocniła immunogenność nowotworu i terapię punktów kontrolnych.

Wyciszanie LIMIT, GBP i/lub HSF1 zmniejsza MHC-I, upośledza odporność przeciwnowotworową i osłabia skuteczność immunoterapii. Klinicznie, transkrypty i białka sygnalizacyjne LIMIT, GBPs i HSF1-korelują z MHC-I, limfocytami T naciekającymi nowotwór i odpowiedzią na blokadę punktu kontrolnego u pacjentów chorych na raka. W sumie wykazujemy, że LIMIT jest nieznanym wcześniej lncRNA immunogennym dla nowotworu, a oś LIMIT-GBP-HSF1 może nadawać się do stosowania w immunoterapii nowotworów.

Słowa kluczowe 

Długi niekodujący RNA; LIMIT; MHC-I; IFN; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; odporność limfocytów T; immunoterapia nowotworów

Wstęp

Blokada punktów kontrolnych uwalnia siłę odpornościową za pośrednictwem limfocytów T CD8+ przeciw rakowi1. Główny kompleks zgodności tkankowej I (MHC-I) odgrywa kluczową rolę w pobudzaniu i aktywacji limfocytów T CD8+2. Jednakże poziom MHC-I jest często obniżony w komórkach nowotworowych, co powoduje unikanie odporności nowotworu i oporność na immunoterapię3,4. Ważne jest, aby zrozumieć, jak przywrócić ekspresję MHC-I w nowotworze i ożywić przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną5. LncRNA pojawiają się szybko wraz z postępem w głębokim sekwencjonowaniu RNA, obejmując znacznie więcej loci w ludzkim genomie niż geny kodujące białka6. LncRNA regulują geny kodujące białka na wielu poziomach7-9 i odgrywają kluczową rolę w imprintingu genomowym10, różnicowaniu komórek11 i progresji nowotworu12. Jednakże tożsamość, sposób działania, funkcja i znaczenie kliniczne specyficznych lncRNA w odporności na nowotwory i immunoterapii pozostają nieznane. Tutaj identyfikujemy LIMIT jako nieznany wcześniej, immunogenny na raka lncRNA. LIMIT wpływa na mechanizmy MHC-I i odporność przeciwnowotworową. Odkryliśmy, że LIMIT lokalnie celuje w GBP, tworząc w ten sposób molekularną kaskadę LIMIT-GBP-HSF1-MHC zmieniającą odporność przeciwnowotworową i skuteczność immunoterapii nowotworów. Nasza praca nie tylko ujawnia nieznaną wcześniej biologię immunogennego lncRNA, LIMIT, ale także sugeruje, że oś LIMIT-GBP-HSF1 może stanowić cel immunoterapii nowotworów.

LIMIT jest immunogennym lncRNA

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Aby zbadać nieznane geny regulatorowe odporności nowotworu, w oparciu o naciek limfocytów T CD8+ nowotworu, podzieliliśmy ludzkiego czerniaka (TCGA, SKCM) na nowotwory gorące i zimne oraz przeanalizowaliśmy korelacje genów immunogennych. Oprócz transkryptów CD8A, IFN i MHC-I (HLA-ABC) odkryliśmy, że kandydat na lncRNA został wzbogacony w gorącym guzie, wśród 3926 kandydatów na lncRNA opatrzonych adnotacją GENCODE13 (ryc. 1a; tabela uzupełniająca 1). Na podstawie badań funkcjonalnych w następujących eksperymentach wyznaczyliśmy tego kandydata na lncRNA jako LIMIT: lncRNA indukujący MHC-I i immunogenność nowotworu (LIMIT). W zbiorze danych dotyczących ludzkiego czerniaka poziomy LIMIT dodatnio korelowały z poziomami IFN, MHC-I i CD8 (ryc. 1b-d). Zgodnie z tym analiza wzbogacania zestawu genów (GSEA) ujawniła, że ​​ekspresja LIMIT koreluje z genami odpowiedzi na IFN, prezentacją antygenu za pośrednictwem MHC-I i aktywacją immunologiczną (ryc. 1e-h). Co więcej, poziomy LIMIT korelowały ze zwiększonymi wskaźnikami odpowiedzi na immunoterapię w punkcie kontrolnym 14-17 (ryc. 1i) i były powiązane z przeżyciem u pacjentów z czerniakiem (ryc. 1j). Dodatkowo ekspresja LIMIT korelowała z IFN, MHC-I i CD8 w wielu typach nowotworów (dane rozszerzone, ryc. 1a-l). Zatem LIMIT jest potencjalnym immunogennym lncRNA.

Sprawdziliśmy, czy LIMIT jest lncRNA. Analiza metodą Northern wykazała, że ​​LIMIT miał długość około 2 kb w ludzkich komórkach czerniaka A375 (ryc. 1k). Zastosowaliśmy szybką amplifikację końców cDNA (RACE) i scharakteryzowaliśmy końce cDNA LIMIT zarówno w ludzkich (A375), jak i mysich (B16) komórkach czerniaka (ryc. 1l, m). Następnie sklonowaliśmy LIMIT pełnej długości zarówno u ludzi, jak i myszy i dopasowaliśmy go do odpowiednich sekwencji genomu (dane rozszerzone, ryc. 2a, b). Ludzki LIMIT znajdował się na chromosomie 1, z 1967 nukleotydami i 6 eksonami (dane rozszerzone, ryc. 2a), podczas gdy mysi Limit znajdował się na chromosomie 3, z 1634 nukleotydami i 7 eksonami (dane rozszerzone, ryc. 2b). LIMIT nie zawierał prawidłowej sekwencji Kozaka. Kiedy przygotowaliśmy RNA z frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej komórek A375, LIMIT wykryto głównie we frakcji jądrowej (ryc. 1n). Zatem LIMIT nie ma potencjału kodowania białek. Łącznie LIMIT spełnia wszystkie kryteria, aby określić go jako lncRNA. Warto zauważyć, że w locus LIMIT, kandydacie na lncRNA, pseudogen GBP1 (GBP1P1) znaleziono w raku wątrobowokomórkowym (HCC)18. Jednak LIMIT wykazywał niskie podobieństwa z GBP1P1 lub GBP1 (dane rozszerzone ryc. 2c, tabela uzupełniająca 2). Zatem LIMIT nie jest GBP1P1. Wysoka korelacja między LIMIT a sygnaturą genu reagującą na IFN (ryc. 1e) sugeruje, że IFN może stymulować ekspresję LIMIT. Rzeczywiście, leczenie IFN indukowało ekspresję LIMIT, jak pokazano metodą Northern blot (ryc. 1k) i sekwencją RNA w komórkach A375, HT29, Meijuso i A549 (ryc. 1o). Jednakże leczenie innymi cytokinami, takimi jak IFN i TNF, nie wywołało ekspresji LIMIT (ryc. 1k). Co więcej, IFN nie indukował LIMIT w komórkach A375 z nokautem STAT1 (KO) (ryc. 1p). Zatem LIMIT jest wcześniej nieznanym lncRNA reagującym na IFN zarówno w komórkach ludzkich, jak i mysich.

LIMIT zwiększa ekspresję MHC-I

Korzyści z suplementu cistanche – jak wzmocnić układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Aby zbadać funkcję LIMIT w komórkach nowotworowych, najpierw znokautowaliśmy LIMIT za pomocą małych RNA o strukturze spinki do włosów (shLIMIT). Zastosowaliśmy narzędzie Blast, aby wybrać LIMIT shRNA, które nie mają kandydatów poza celem (tabele uzupełniające 3-6). ShLIMIT nie celował w geny kodujące GBP (dane rozszerzone, ryc. 3a). W komórkach A375 shLIMIT tłumił ekspresję LIMIT (ryc. 2a), ale nie wpływał na fosforylację STAT1 (ryc. 2b) w odpowiedzi na IFN – co sugeruje, że LIMIT nie wpływa na globalną sygnalizację genu IFN. MHC-I i PD-L1 to geny docelowe IFN19-21. ShLIMIT doprowadził do zmniejszenia ekspresji MHC-I (ryc. 2c), ale nie PD-L1 (dane rozszerzone ryc. 3b), w odpowiedzi na stymulację IFN. Zgodnie z tymi danymi u ludzi, granica wyciszenia w mysich komórkach czerniaka YUMM1.7 lub komórkach raka okrężnicy CT26 skutkowała zmniejszoną ekspresją MHC-I w odpowiedzi na IFN (ryc. 2d-g). W komórkach A375 shLIMIT wpływał nie tylko na ekspresję MHC-I (HLA-ABC, HLA-E i HLA-F), ale także na ekspresję MHC-II (HLA-DRA i HLA-DMA); podczas gdy LIMIT nie zmienił ekspresji innego genu sygnalizującego IFN (dane rozszerzone, ryc. 3c). Zatem LIMIT uczestniczy w regulacji indukowanej przez IFN ekspresji MHC-I i MHC-II bez zmiany globalnego szlaku sygnalizacyjnego IFN.

LIMIT to przerwany gen z dużymi intronami, zajmujący w genomie około 17 kb. Nie udało nam się wyeliminować locus LIMIT za pomocą sparowanych sgRNA i Cas9. Biorąc pod uwagę, że w promotorze LIMIT przewidywanych jest 5 miejsc wiązania STAT1/IRF1, zaprojektowaliśmy 4 sparowane sgRNA w celu usunięcia tych miejsc wiązania w promotorze LIMIT (dane rozszerzone, ryc. 3d). Wygenerowaliśmy komórki A375 z delecją promotora LIMIT we wszystkich 4 kombinacjach sgRNA. Stwierdziliśmy, że IFN nie był już skuteczny w indukowaniu ekspresji LIMIT i MHC-I w komórkach nowotworowych z delecją promotora LIMIT w porównaniu z komórkami typu dzikiego (ryc. 2h, i). Dodatkowo zastosowaliśmy system aktywacji CRISPR kierowany RNA, aby aktywować ekspresję Limit w komórkach nowotworowych22. Ustaliliśmy 4 kierujące RNA ukierunkowane na region promotora Limit (sgLimit) i ulegające koekspresji z dCas9-VPR, trójdzielnym aktywatorem transkrypcji połączonym z Cas9 pozbawionym nukleazy, w komórkach B16 (dane rozszerzone, ryc. 4a). Wszystkie 4 sgLimit wzmocniły ekspresję Limitu, a także MHC-I (dane rozszerzone, ryc. 4b, c). Kiedy transfekowaliśmy komórki B16 pulą sgLimit i nieukierunkowanymi sgRNA (sgNT), sgLimit indukował ekspresję Limitu i MHC-I, ale nie PD-L1 (ryc. 2j, k). Dlatego Limit selektywnie celuje w MHC-I, ale nie w PD-L1. W sumie eksperymenty polegające na utracie i wzmocnieniu funkcji pokazują, że LIMIT może zmienić 1,5-3-krotną ekspresję MHC-I w wielu komórkach nowotworowych u myszy i ludzi. Następnie zbadaliśmy, czy ekspresja MHC-I zmieniona przez LIMIT wpływa na zabijanie nowotworu za pośrednictwem komórek T CD8+ specyficznych dla TAA in vitro. W tym celu najpierw genetycznie znokautowaliśmy B2M za pomocą specyficznych shRNA w albuminie jaja kurzego (OVA)--komórkach wykazujących ekspresję B16. shRNA-B2M spowodowało 1,5--krotne zmniejszenie ekspresji OVA-H2Kb (dane rozszerzone, ryc. 4d). Kiedy komórki B16-OVA niosące shFluc i shB2M inkubowano z komórkami OT-I, zaobserwowaliśmy spadek zabijania komórek shB2M-B16-OVA za pośrednictwem OT-I w porównaniu z shFluc-B{{63 }}Komórki OVA (dane rozszerzone, ryc. 4e-g). Dane sugerują, że 1,5-3-krotne zmiany w ekspresji MHC-I kontrolowane przez LIMIT mogą mieć znaczenie funkcjonalne w wpływaniu na aktywność CTL specyficzną dla TAA. Aby to potwierdzić, aktywowaliśmy LIMIT w komórkach B16-OVA wyrażających szelak i shB2M. Zgodnie z oczekiwaniami, aktywacja CRISPR LIMIT indukowała minimalną ekspresję MHC-I w komórkach shB2M w porównaniu z komórkami kontrolnymi (ryc. 2l). Odpowiednio, komórki OT-I pośredniczyły w minimalnym zabijaniu nowotworu w komórkach shB2M-OVA-B16 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (ryc. 2m, n). Dane sugerują, że indukowana przez LIMIT ekspresja MHC-I jest ważna w aktywacji i funkcjonowaniu komórek T specyficznych dla TAA. Komórki prezentujące antygen (APC), w tym makrofagi i komórki dendrytyczne (DC), wyrażają MHC-I, prezentują antygeny i aktywują limfocyty T specyficzne dla TAA. Rozszerzyliśmy nasze badania z komórek nowotworowych na APC. IFN silnie stymulował ekspresję graniczną w DC i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (dane rozszerzone, ryc. 4h, i). Transfekowaliśmy makrofagi za pomocą limitu celowania siRNA znakowanego 5'FAM (siLIMIT). Powalenie LIMIT skutkowało niższą ekspresją MHC-I w odpowiedzi na stymulację IFN w porównaniu z kontrolą (dane rozszerzone, ryc. 4j, k). Zatem LIMIT jest lncRNA reagującym na IFN i może promować ekspresję MHC-I zarówno w komórkach nowotworowych, jak i APC.

LIMIT wzmacnia odporność przeciwnowotworową

Korzyści z cistanche tubulosa-przeciwnowotworowego

Niewystarczająca ekspresja MHC-I powoduje unikanie odporności nowotworu i oporność na immunoterapię3. Aby zrozumieć rolę Limitu w przeciwnowotworowych odpowiedziach immunologicznych in vivo, zaszczepiliśmy komórki nowotworowe YUMM1.7 kontrolne (shFluc) i wyciszające Limit (shLimit) do NOD z niedoborem scid c (NSG, niedobór odporności) i C57BL/6 typu dzikiego (immunologicznie kompetentnych) myszy. W porównaniu z guzami kontrolnymi, guzy shLimit YUMM1.7 rosły porównywalnie u myszy NSG (ryc. 3a), podczas gdy postępowały szybciej u myszy typu dzikiego (ryc. 3b). Ponadto zaszczepiliśmy nowotwory shLimit CT26 myszom BALB/c typu dzikiego. Ponownie granica wyciszenia spowodowała zwiększony wzrost guza CT26 w modelu immunokompetentnym (ryc. 3c). Dane sugerują, że granica wyciszająca może upośledzać odporność przeciwnowotworową i ułatwiać wzrost nowotworu w sposób zależny od odporności. Na poparcie tego wykryliśmy redukcję limfocytów T CD3+, IFN + i TNF + w guzach shLimit YUMM1.7 (ryc. 3d, e). Łącznie wyciszenie Limitu osłabia odporność przeciwnowotworową. Aby określić ekspresję MHC-I i MHC-I: SIINFEKL in vivo, ustaliliśmy komórki YUMM1.7 stabilnie eksprymujące OVA (YUMM1.7-OVA) i transdukowane shRNA ukierunkowanym na Limit lub Fluc. Po traktowaniu IFN wykryliśmy zmniejszoną ekspresję powierzchniową OVA-H2Kb w komórkach shLimit-YUMM1.7 (dane rozszerzone, ryc. 5a). Zaszczepiliśmy komórki shLimit YUMM1.7-OVA i komórki shFluc-YUMM1.7-OVA myszom C57BL/6. Następnie wypreparowaliśmy tkanki nowotworowe i wykryliśmy ekspresję H2Db i OVA-H2Kb w komórkach nowotworowych. Zaobserwowaliśmy redukcję H2Db i OVA-H2Kb w komórkach shLimit-YUMM1.7-OVA w porównaniu z komórkami kontrolnymi (dane rozszerzone, ryc. 5b-f). Dane wskazują, że Limit może wpływać na ekspresję antygenu MHC-I i MHC-I: in vivo. Dodatkowo zaszczepiliśmy komórki kontrolne (sgNT) i aktywujące limit (sgLimit) B16 myszom C57/BL6 typu dzikiego. Zgodnie z oczekiwaniami, sgLimit (Limit aktywacji) radykalnie zmniejszył wzrost guza (ryc. 3f). Towarzyszyła temu zwiększona liczba limfocytów T naciekających nowotwór i aktywacja (ryc. 3g, h). Czerniak B16 jest stosunkowo niewrażliwym modelem nowotworu na blokadę PD-L123. Zgodnie z tym, blokada PD-L1 nie kontrolowała wzrostu guza sgNT B16 u myszy. Co ciekawe, aktywacja Limitu w guzie B16 za pomocą sgLimit uwrażliwiła odpowiedź nowotworu na blokadę PD-L1, co wykazano przez zmniejszoną progresję nowotworu (ryc. 3i). Podsumowując, Limit wzmacnia odporność nowotworu i uwrażliwia odpowiedź immunoterapeutyczną nowotworu.

LIMIT cis-aktywuje GBP w celu wzmocnienia MHC-I i odporności na nowotwory

Następnie zbadaliśmy, w jaki sposób LIMIT wpływa na MHC-I i odporność nowotworu. LncRNA mogą lokalnie regulować ekspresję sąsiadujących genów24. LIMIT jest zlokalizowany blisko klastra genów, białek wiążących guanylan (GBP), zarówno w genomie człowieka, jak i myszy (dane rozszerzone, ryc. 2a, b). Zapytaliśmy, czy LIMIT może regulować ekspresję GBP. Wyciszenie LIMIT zmniejszyło poziom prekursorowych i dojrzałych mRNA GBP (ryc. 4a) oraz białek GBP1-5 (ryc. 4b) w ludzkich komórkach A375 w odpowiedzi na leczenie IFN. Dane sugerują, że LIMIT może promować transkrypcję GBP w cis. Na poparcie tej możliwości wyciszenie Limitu zmniejszyło również ekspresję Gbp2 w mysich komórkach YUMM1.7 i CT26 (dane rozszerzone, ryc. 6a, b). Ponadto aktywacja CRISPR Limitu indukowała ekspresję Gbp2 w komórkach B16 (ryc. 4c). Aby sprawdzić, czy LIMIT może transregulować GBP, wymusiliśmy ekspresję cDNA LIMIT w komórkach A375. Odkryliśmy, że GBP1 i wiele czynników odpornościowych (w tym IRF1, HLA-ABC i PD-L1) pozostały niezmienione przez nadekspresję LIMIT (dane rozszerzone, ryc. 6c). Zatem LIMIT jest lncRNA działającym w układzie cis, zdolnym do indukowania ekspresji GBP. Wśród członków rodziny Gbp, Gbp2 jest dominującym członkiem rodziny Gbp w komórkach myszy (dane rozszerzone, ryc. 6d). Aby sprawdzić, czy LIMIT może regulować MHC-I poprzez GBP, ustaliliśmy stabilne komórki YUMM1.7 niosące szelak, shLimit, shGbp2 lub shLimit plus shGbp2. Odkryliśmy, że w odpowiedzi na stymulację IFN shLimit i shGbp2 prowadziły do ​​porównywalnego spadku ekspresji Gbp2 i MHC-I; jednoczesne wyciszenie Limitu i Gbp2 nie zmieniło dodatkowo ekspresji Gbp2 i MHC-I (ryc. 4d, e). Co więcej, zastanawialiśmy się, czy nadekspresja GBP może uratować obniżoną ekspresję MHC-I w MHC-I w Limit, niszcząc komórki nowotworowe. Wymusiliśmy ekspresję GBP1 w komórkach shLIMIT A375 (GBP1OE) i potraktowaliśmy te komórki IFN. Zaobserwowaliśmy, że shLIMIT spowodował zmniejszoną ekspresję MHC-I w komórkach kontrolnych, ale nie w komórkach GBP1OE (dane rozszerzone, ryc. 6e). ShLIMIT lub GBP1OE nie miały wpływu na ekspresję PD-L1 i IRF1 (dane rozszerzone, ryc. 6e, f). Zatem Limit może regulować ekspresję MHC-I w sposób zależny od GBP. Następnie zaszczepiliśmy myszy C57BL/6 komórkami YUMM1.7 z wyciszeniem Limit i/lub Gbp. Wyciszenie Limitu i wyciszenie GBP podobnie spowodowało szybszy wzrost guza w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy jednoczesne wyciszenie LIMIT i GBP nie miało dalszego wpływu na progresję nowotworu (ryc. 4f). Ponadto wykryliśmy spadek liczby limfocytów T naciekających nowotwór i aktywację w guzach shLimit, guzach shGbp2 i guzach shLimit plus shGbp2 (ryc. 4g i dane rozszerzone ryc. 6g). Łącznie LIMIT zwiększa ekspresję MHC-I i odporność nowotworu w sposób zależny od GBP. GBP to geny reagujące na IFN w fibroblastach25 i makrofagach26 w kontekście obrony gospodarza przed patogenami. Jednakże rola GBP w odporności na nowotwory jest nieznana. Biorąc pod uwagę, że wyciszenie GBP zmniejsza ekspresję MHC-I i aktywację limfocytów T CD8+ (ryc. 4g i dane rozszerzone ryc. 6g), postawiliśmy hipotezę, że GBP mogą wpływać na skuteczność immunoterapii nowotworów. Aby przetestować tę hipotezę, wyciszyliśmy Gbp2 w komórkach MC38, modelu nowotworu wrażliwym na immunoterapię23. Zgodnie z oczekiwaniami, wyciszenie Gbp2 w komórkach MC38 zmniejszyło ekspresję MHC-I po leczeniu IFN (ryc. 4h) i w dużym stopniu zniosło skuteczność blokady PD-L1 (ryc. 4i). To, wraz z wyżej wymienionymi danymi, sugeruje udział LIMIT i GBP w kontrolowaniu skuteczności immunoterapii nowotworów. Na poparcie tej możliwości analiza danych klinicznych wykazała, że ​​wysoki poziom ekspresji GBP korelował z LIMIT, ekspresją MHC-I i odpowiedzią na immunoterapię (dane rozszerzone, ryc. 6h-j) u pacjentów z czerniakiem14-17. Ponadto poziomy ekspresji GBP były dodatnio powiązane z przeżyciem pacjentów (dane rozszerzone, ryc. 6k). Aby sprawdzić, czy GBP są genami reagującymi na IFN w komórkach nowotworowych, stymulowaliśmy komórki A375 IFN i innymi cytokinami. GBP były indukowane przez IFN, ale inne cytokiny odpornościowe miały na nie minimalny wpływ (ryc. 4j). Następnie użyliśmy systemu CRISPR-Cas9 do ukierunkowania wspólnych sekwencji między GBP1-5 i wygenerowaliśmy komórki A375 z nokautem GBP1-5 (KO) (ryc. 4k). Zaobserwowaliśmy, że IFN słabo stymulował transkrypty maszynerii genu MHC-I (ryc. 4l) i powierzchniowe białka HLA-ABC w komórkach GBP KO A375 (ryc. 4m). Dlatego LIMIT cis-aktywuje GBP, aby wzmocnić maszynerię MHC-I i odporność na nowotwory.

GBP aktywują HSF1 w celu stymulacji MHC-I i odporności na nowotwór

Aby zademonstrować, w jaki sposób GBP mogą regulować ekspresję MHC-I i odporność na nowotwory, wymusiliśmy ekspresję GBP w komórkach A375. Co ciekawe, nadekspresja GBP zwiększyła ekspresję ludzkiego MHC-I - jak wykazano za pomocą qRT-PCR (ryc. 5a), barwienie powierzchni błony (ryc. 5b) i Western blot (ryc. 5c). Dane sugerują, że GBP mogą aktywować MHC-I na poziomie transkrypcji. Konsekwentnie nadekspresja Gbp2 zwiększała ekspresję mysiego MHC-I w komórkach YUMM1.7 i B16 (ryc. 5d). Aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne regulujące MHC-I poprzez GBP w odpowiedzi na IFN, przeprowadziliśmy prognozy bioinformatyczne za pomocą PROMO27. Znaleźliśmy 8 czynników transkrypcyjnych zmienionych przez IFN w komórkach A375, które mogą być ukierunkowane na HLA-ABC, HSPA5, CALR i TAP1. Oprócz kilku dobrze znanych czynników, aktywność HSF1 była silnie indukowana przez IFN (dane rozszerzone, ryc. 7a). Przetwarzając zbiory danych ChIP-seq w ENCODE28, odkryliśmy, że zarówno STAT1, jak i HSF1 zostały wzbogacone w promotory genów związanych z MHC-I o różnych wzorach wiązania (dane rozszerzone, ryc. 7b). Przeprowadziliśmy test ChIP z przeciwciałem anty-HSF1 w komórkach A375 stymulowanych IFN. HSF1 został wzbogacony w promotory HLA-ABC, HSPA5, CALR i TAP1, ale nie w HPRT1, kontrolę ujemną (ryc. 5e). Wyniki sugerują, że HSF1 jest czynnikiem transkrypcyjnym dla MHC-I. HSF1 jest zwykle aktywowany przez przerwanie proteostazy29. Aby sprawdzić, czy aktywacja HSF1 zwiększy ekspresję MHC-I, potraktowaliśmy komórki A375 listą czynników stresogennych30: szokiem cieplnym, stresem oksydacyjnym (Luperox), inhibitorami translacji (puromycyna), proteasomem (MG-132) i opiekun (17-AAG). Co ciekawe, stresory te powszechnie stymulowały ekspresję MHC-I – podczas gdy KRIBB11, inhibitor HSF1, zmniejszał ten efekt (ryc. 5f i dane rozszerzone ryc. 7c). Zatem aktywacja HSF1 na ogół indukuje ekspresję MHC-I. Następnie zadaliśmy sobie pytanie, czy GBP mogą aktywować HSF1. Wymuszona ekspresja GBP indukowała aktywność lucyferazy reportera HSF1 HSE-Luc (ryc. 5g), jak również fosforylację HSF1 (ryc. 5h). Sugeruje to, że GBP mogą aktywować HSF1. IFN nie indukował ekspresji HSPA5 w komórkach GBP-KO A375 (ryc. 5i). Zatem IFN aktywuje HSF1 poprzez indukcję ekspresji GBP. Ponadto leczenie KRIBB11, inhibitorem HSF1, zniosło regulację w górę MHC-I za pośrednictwem nadekspresji GBP1 (ryc. 5j). Dlatego GBP stymulują ekspresję MHC-I w sposób zależny od HSF. Aby utrwalić mechanistyczną zależność między GBP i HSF1, wyciszyliśmy Gbp2 i / lub Hsf1 w komórkach MC38 (ryc. 5k). Po leczeniu IFN wyciszenie samego Gbp2 lub Hsf1 zmniejszyło ekspresję MHC-I, ale jednoczesne wyciszenie Gbp2 i Hsf1 nie spowodowało dodatkowego modulowania ekspresji MHC-I (ryc. 5l). Aby wykazać funkcjonalne znaczenie wzajemnego oddziaływania między GBP i HSF1 w odporności na nowotwór, zaszczepiliśmy myszy C57BL/6 komórkami nowotworowymi MC38 wyrażającymi szelak, shGbp2, shHSF1 lub shGbp2 plus shHSF1. W porównaniu do kontroli shFluc, wyciszenie Gbp2 i wyciszenie Hsf1 porównywalnie przyspieszyło wzrost guza (ryc. 5m) oraz zmniejszyło liczbę i aktywację limfocytów T naciekających guz (ryc. 5n i dane rozszerzone ryc. 7d). Co więcej, jednoczesne wyciszenie Gbp2 i Hsf1 nie wpłynęło na dalszy wzrost guza i komórki T naciekające nowotwór (ryc. 5m, n i dane rozszerzone ryc. 7d). Łącznie GBP stymulują ekspresję MHC-I i odporność przeciwnowotworową poprzez aktywację HSF1.

Oś LIMIT-GBP-HSF1 napędza MHC-I i odporność na nowotwory

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Następnie zbadaliśmy, w jaki sposób GBP aktywują HSF1, aby zmienić ekspresję MHC-I i odporność na nowotwór. W normalnych warunkach monomeryczny HSF1 jest związany i tłumiony przez chaperony, takie jak HSP9031. Przerwanie ich interakcji umożliwia trimeryzację i akumulację HSF1 w jądrze, co skutkuje aktywacją transkrypcyjną jego docelowych genów32. Postawiliśmy hipotezę, że GBP mogą zakłócać powiązanie między HSP90 i HSF1, powodując aktywację HSF1. Aby przetestować tę możliwość, traktowaliśmy komórki A375 IFN i przeprowadziliśmy Co-IP z przeciwciałem HSP90. Odkryliśmy, że endogenne GBP indukowane przez IFN były powiązane z HSP90 (ryc. 6a). Dodatkowo transfekowaliśmy komórki A375 egzogennym Flag-GBP1 i przeprowadziliśmy eksperyment Co-IP z przeciwciałem Flag. HSP90 wykryto w produkcie IP z komórek transfekowanych Flag-GBP1, ale nie w komórkach kontrolnych transfekowanych wektorem (ryc. 6b). Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że GBP i HSP90 były w dużej mierze zlokalizowane w cytoplazmie (ryc. 6c). Kiedy transfekowaliśmy komórki 293T rosnącymi dawkami plazmidów GBP1, HSP90-związany z HSP został zredukowany w sposób zależny od dawki (ryc. 6d). Dane sugerują, że GBP wchodziły w interakcję z HSP90 i ta interakcja zakłóciła powiązanie między HSF1 i HSP90. HSP90 jest białkiem opiekuńczym odpowiedzialnym za wielokrotne zwijanie i stabilność białek, zastanawialiśmy się, czy GBP mogą zmieniać aktywność białka opiekuńczego HSP90. Chociaż inhibitor HSP90 tłumił ekspresję białek klienckich HSP90 (takich jak RAF1, BCL2 i CDK433), nadekspresja GBP nie spowodowała tego efektu (ryc. 6e). Zatem GBP oddziałują z HSP90 i uwalniają HSP90-powiązany z HSP, ale nie zmieniają aktywności HSP90. Następnie bezpośrednio zbadaliśmy rolę HSF1 w ekspresji MHC-I. Traktowaliśmy komórki A375 IFN w obecności inhibitora HSF1 KRIBB11. Zgodnie z oczekiwaniami, leczenie KRIBB11 zmniejszyło stymulowaną IFN ekspresję mRNA genów związanych z MHC-I, w tym HLA-ABC, TAP1, HSPA5 i CALR, ale nie IRF1 (ryc. 6f). Co ciekawe, KRIBB11 zmniejszał indukowaną IFN ekspresję MHC-I, ale miał minimalny wpływ na ekspresję PD-L1 (ryc. 6g). Zatem HSF1 może regulować indukowaną przez IFN ekspresję MHC-I bez zmiany globalnej sygnalizacji IFN. Aby zbadać, czy MHC-I regulowany przez HSF1-jest funkcjonalny, hodowaliśmy B16-OVA z komórkami OT-I w obecności KRIBB11 i IFN. KRIBB11 hamował indukowaną przez IFN ekspresję MHC-I związanego z OVA (dane rozszerzone, ryc. 8a). Zgodnie z tym KRIBB11 tłumił także działanie cytotoksyczne za pośrednictwem komórek OT-I na B16-OVA (dane rozszerzone, ryc. 8b). Aby rozszerzyć nasze obserwacje na dodatkowe nowotwory, wyciszyliśmy Hsf1 za pomocą shHsf1 w komórkach YUMM1.7 i CT26. Wyciszenie Hsf1 spowodowało zmniejszenie ekspresji MHC-I w komórkach YUMM1.7 (ryc. 6h, i) i CT26 (dane rozszerzone, ryc. 8c) w odpowiedzi na stymulację IFN. W komórkach YUMM1.7 wyciszenie HSF1 nie wpłynęło na ekspresję Gbp2 w odpowiedzi na IFN (ryc. 6h), co wskazuje, że Gbp2 nie jest genem docelowym HSF1. W komórkach shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 nie tłumił ekspresji MHC-I stymulowanej IFN (dane rozszerzone, ryc. 8d). Dane sugerują, że HSF1 zwiększa ekspresję MHC-I w odpowiedzi na IFN, a Hsf1 jest mechanistycznym celem KRIBB11 regulującym MHC-I. Biorąc pod uwagę, że HSF1 wpływa na ekspresję MHC-I, postawiliśmy hipotezę, że HSF1 reguluje odporność przeciwnowotworową in vivo. Aby przetestować tę hipotezę, zaszczepiliśmy komórki nowotworowe kontrolne i shHsf1 YUMM1.7 myszom NSG i C57BL/6. Zaobserwowaliśmy, że wyciszenie HSF1 częściowo spowolniło postęp guza YUMM1.7 u myszy NSG (ryc. 6j), co potwierdza, że ​​Hsf1 pomógł utrzymać homeostazę białek i progresję nowotworu w modelu z niedoborem odporności. Jednakże wyciszenie Hsf1 radykalnie przyspieszyło wzrost guza YUMM1.7 u myszy C57BL/6 typu dzikiego (ryc. 6k). Dane wskazują, że Hsf1 może nieoczekiwanie promować silną odporność przeciwnowotworową w modelu immunokompetentnym. Na poparcie tego wykryliśmy zmniejszenie odsetka limfocytów T CD3+, Ki67+, IFN + i TNF + naciekających nowotwór (ryc. 6l i dane rozszerzone ryc. 8e) w guzy shHsf1 YUMM1.7 w porównaniu z kontrolami mieszanymi shFluc. Ponadto zaszczepiliśmy komórki shHsf1 CT26 myszom BALB/c typu dzikiego. Ponownie wyciszenie Hsf1 spowodowało zwiększony wzrost guza CT26 (dane rozszerzone, ryc. 8f). Towarzyszyło temu zmniejszenie odsetka limfocytów T CD3+, Ki67+, IFN+ i TNF+ naciekających nowotwór (dane rozszerzone, ryc. 8g, h). Łącznie dane sugerują, że oś GBP-HSF1 napędza ekspresję MHC-I i odporność przeciwnowotworową. Aby mechanicznie połączyć Hsf1 i LIMIT, wyciszyliśmy LIMIT w ogniwach A375. Wyciszenie LIMIT zmniejszyło aktywność transkrypcyjną HSF1 w odpowiedzi na IFN, jak określono za pomocą testu reporterowego lucyferazy (HSE-luc) (ryc. 6m). Dane sugerują, że LIMIT przyczynia się do aktywacji HSF1 w odpowiedzi na IFN. Aby przetestować potencjalny udział HSF1 w indukcji MHC-I za pośrednictwem LIMIT, stymulowaliśmy LIMIT poprzez aktywację CRISPR w komórkach B16, w obecności KRIBB11. Zaobserwowaliśmy, że regulacja w górę MHC-I, indukowana przez aktywację LIMIT, została zniesiona przez inhibitor HSF1 (ryc. 6n). Dane sugerują, że LIMIT zwiększa ekspresję MHC-I w sposób zależny od HSF. Na koniec przeanalizowaliśmy powiązanie między LIMIT, GBP i HSF1 w kontekście ekspresji MHC-I, odporności na nowotwór i immunoterapii u pacjentów z rakiem. Analiza kliniczna wykazała, że ​​geny sygnałowe HSF1-korelowały z ekspresją MHC-I, naciekiem limfocytów T CD8+ i przeżyciem pacjenta (dane rozszerzone, ryc. 9a–c). W badaniu blokady immunologicznych punktów kontrolnych u pacjentów z rakiem podstawnokomórkowym34 analiza sekwencjonowania RNA jednokomórkowych ujawniła 2 skupiska nowotworów; jeden skupisko nowotworów był bardziej wrażliwy na leczenie anty-PD, o czym świadczy znacznie zmniejszona populacja nowotworów (dane rozszerzone, ryc. 9d). Co ciekawe, ten klaster nowotworów wrażliwy na punkt kontrolny układu odpornościowego wykazywał wyższy poziom genów sygnałowych HSF1-, a także maszynerii genów MHC-I (dane rozszerzone, ryc. 9e). Co więcej, w badaniu blokady immunologicznych punktów kontrolnych u pacjentów z czerniakiem35 analiza proteomiczna wykazała, że ​​ekspresja białek GBP, genów sygnalizacyjnych HSF1 i MHC-I była wyższa u pacjentów odpowiadających na leczenie w porównaniu z pacjentami nieodpowiadającymi na leczenie (dane rozszerzone, ryc. 9f). Dodatkowo zaobserwowaliśmy dodatnią korelację między genami sygnalizacyjnymi GBP1 i HSF1-w przypadku ludzkich nowotworów (dane rozszerzone, ryc. 9g). Dane potwierdzają, że oś LIMIT-GBP-HSF1 może aktywować ekspresję MHC-I i sprzyjać odporności przeciwnowotworowej (dane rozszerzone, ryc. 10).

Dyskusja

Zioło chińskie cistanche roślina-przeciwnowotworowa

Ludzie mają 30,000-60,000 lncRNA. Jednak tożsamość i funkcje biologiczne ogromnej większości tych potencjalnych lncRNA pozostają słabo poznane. W dziedzinie biologii raka lncRNA były w dużej mierze badane w modelu z niedoborem odporności, pozostawiając lukę w wiedzy na temat lncRNA w kontekście układu odpornościowego. Doniesiono, że kilka lncRNA wpływa na funkcjonowanie komórek odpornościowych36,37, progresję nowotworu i skuteczność chemioterapii38,39. Jednak to, czy specyficzne lncRNA biorą udział w odporności przeciwnowotworowej i odpowiedzi immunoterapeutycznej, pozostaje bez odpowiedzi. W niniejszym badaniu odkryliśmy, że LIMIT jest wcześniej niescharakteryzowanym lncRNA reagującym na IFN zarówno w komórkach ludzkich, jak i mysich. LIMIT może indukować ekspresję MHC-I i MHC-II, promując odpowiedź immunologiczną nowotworu za pośrednictwem limfocytów T i zwiększając skuteczność immunoterapii. Zatem LIMIT jest nieznanym wcześniej lncRNA immunogennym nowotworem. Szlak sygnałowy IFN odgrywa kluczową rolę w określaniu odpowiedzi terapeutycznej na immunoterapię nowotworów40 poprzez wiele mechanizmów19,20,41,42. Mutacje genetyczne w genach sygnalizacyjnych IFN przyczyniają się do oporności na blokadę punktów kontrolnych u pacjentów chorych na raka43-48. Jednakże sygnalizacja IFN może indukować hamującą ekspresję PD-L149. Dlatego idealnym rozwiązaniem jest identyfikacja i ukierunkowanie na kluczowy gen sygnalizacyjny IFN, który selektywnie pośredniczy w odporności przeciwnowotworowej, a nie w unikaniu odporności nowotworu. Zgodnie z tym poglądem wykazujemy, że LIMIT pośredniczy w regulacji w górę MHC-I i MHC-II, ale nie wpływa na ekspresję PD-L1 w odpowiedzi na IFN. Zatem LIMIT może mieć wyjątkową pozycję jako immunogenny cel immunoterapii nowotworów. Zaproponowano kilka strategii terapeutycznych ukierunkowanych na patogenne lncRNA50. Jednakże sposób podniesienia poziomu korzystnych lncRNA pozostaje wyzwaniem. Ponieważ lncRNA działające w układzie cis działają lokalnie, wymuszona ekspresja tych lncRNA może nie umożliwiać dokładnego zlokalizowania51. Chociaż lncRNA działające w pozycji trans mogą funkcjonować poprzez specyficzne struktury drugorzędowe, nadekspresja tych lncRNA może nie być w stanie wygenerować ich naturalnych struktur z powodu braku odpowiednich białek opiekuńczych RNA52. Stosując strategię aktywacji CRISPR pod kontrolą RNA22, bezpośrednio aktywowaliśmy ekspresję LIMIT w komórkach nowotworowych w modelach przedklinicznych. Aktywacja CRISPR LIMIT pod kontrolą RNA może napędzać ekspresję MHC-I nowotworu i nasilać terapię blokującą punkty kontrolne. Biorąc pod uwagę, że w ludzkich nowotworach często występuje utrata sygnatur genów MHC-I i IFN, sugerujemy, że aktywacja CRISPR korzystnych lncRNA, takich jak LIMIT, może uratować ekspresję MHC-I nowotworu i stanowić potencjalne podejście terapeutyczne. Poszukując mechanizmu, za pomocą którego LIMIT wpływa na odporność nowotworu, wyjaśniliśmy, że LIMIT celuje w GBP w sposób cis. GBP odgrywają rolę we wrodzonej odporności26,53,54. Myszy pozbawione całego skupiska Gb/s wykazują słabą odpowiedź przeciw Toxoplasma gondii55. Jednak przed naszą pracą mechanistyczne powiązanie między LIMIT i GBP a biologiczną funkcją GBP w odporności na nowotwory i immunoterapii było nieokreślone. Odkryliśmy, że GBP są wymagane do wywołanej przez IFN ekspresji MHC-I nowotworu, skuteczności zabijania limfocytów T CD8+ i skutecznej terapii punktów kontrolnych. Dane sugerują, że GBP są potencjalnymi genami docelowymi zwiększającymi immunogenność nowotworu. Nieoczekiwanie odkryliśmy, że GBP aktywują HSF1 w celu stymulacji ekspresji genów MHC-I i związanych z MHC-I. Aktywacja HSF1 za pośrednictwem inhibitorów HSP90 koreluje z kontrolą nowotworu w modelach immunokompetentnych. Jednakże, pomimo wielu badań klinicznych z inhibitorami HSP90, żaden z ocenianych inhibitorów HSP90 nie został dotychczas zatwierdzony przez FDA do leczenia nowotworów. Ten rozczarowujący fakt zwiększa możliwość, że inhibitory HSP90 mogą mieć szkodliwy wpływ na odporność nowotworu. Toksyczność tych inhibitorów HSP90 może sprzyjać zniszczeniu kilku białek klienckich HSP90, takich jak RAF1 i BCL2, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla proliferacji i przeżycia efektorowych komórek T59,60. Biorąc pod uwagę, że GBP oddziałują z HSP90 i uwalniają HSP90-zwabiony HSF1, ale nie zmieniają aktywności HSP90, nasze dane sugerują, że celowanie w GBP może być wcześniej niedocenianą i bezpieczną strategią aktywacji HSF1 do immunoterapii nowotworów. Podsumowując, identyfikujemy LIMIT jako nieznany wcześniej rakotwórczy lncRNA. Nasza praca sugeruje, że celowanie w oś sygnalizacyjną LIMIT-GBP-HSF1 może uratować ekspresję i funkcję MHC-I, co stanowi obiecujące podejście immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów.

Metody

Eksperymenty na zwierzętach

Sześcio- do ośmiotygodniowa samica NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, nr katalogowy 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, nr katalogowy 000664), BALB/c (BALB /cJ, nr katalogowy 000651) i OT-1 (C57BL/{15}}Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, nr katalogowy 003831) otrzymano z Jackson Laboratory. Wszystkie myszy trzymano w warunkach wolnych od patogenów. Pomieszczenie dla zwierząt ma kontrolowaną temperaturę (18-23 stopni), wilgotność (40-60%) i cykl 12 światła/12 ciemności. Komórki YUMM1.7 (1 x 105), CT26 (1 x 105), MC38 (2,5 x 106) i B16 (1 x 105) wstrzyknięto podskórnie w prawy bok myszy. W celu leczenia anty-PD-L1 w modelu MC38, w dniach 6., 9. i 12 po zaszczepieniu nowotworu. W celu leczenia anty-PD-L1 w modelu B16, w dniach 0, 3, dootrzewnowo podano 5 mg/kg anty-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) i przeciwciało kontrolne (InVivoMAb, LTF-2). 6, 9, 12 i 15 po zaszczepieniu nowotworu. Średnicę guza mierzono za pomocą suwmiarki. Objętość guza obliczono jako długość × szerokość × szerokość/2. Badania na zwierzętach przeprowadzono za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Michigan (PRO00008278). Badanie jest zgodne ze wszystkimi obowiązującymi przepisami etycznymi dotyczącymi badań na zwierzętach. W żadnym z eksperymentów wielkość nowotworu ksenoprzeszczepu nie przekraczała 2 cm w jakimkolwiek wymiarze i żadne zwierzę nie miało poważnego wzdęcia brzucha (większego lub równego 10% wzrostu pierwotnej masy ciała). Liczebność próby dobrano na podstawie danych wstępnych. Po zaszczepieniu nowotworu myszy losowo przydzielono do różnych grup w celu leczenia.

Odczynniki

KRIBB11 i 17-AAG zakupiono od Cayman Chemical. MG-132, Puromycyna i Luperox pochodziły z firmy Sigma-Aldrich. Rekombinowany ludzki IFN (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) i mysi IFN (485-MI) pochodziły z działu badań i rozwoju.

Plazmidy

Aby wygenerować HSE-LUC, zsyntetyzowano sekwencje DNA odpowiadające elementom szoku cieplnego (HSE), połączono i zligowano z podstawowym plazmidem PGL3-(Promega). FLAG-HSF1 był prezentem od Stuarta Calderwooda (Addgene #32537). W celu wymuszonej ekspresji ludzkiego GBP1, GBP2, GBP5 i mysiego Gbp2, odpowiednie sekwencje kodujące amplifikowano metodą PCR z cDNA wytworzonego z komórek A375 lub B16 traktowanych IFN, a następnie wstawiano do plazmidu PCI-Flag. Plazmid PCI-Flag przygotowano przez wstawienie następującej sekwencji Kozaka plus znacznik Flag plus 5 x sekwencja glicyny do plazmidu PCI-neo (Promega) pomiędzy NheI i XhoI. Aby zniszczyć ludzki LIMIT i mysi LIMIT, zaprojektowano shRNA i wstawiono je do plazmidu PLKO.1 (Addgene #10879). ShRNA ukierunkowane na lucyferazę świetlika (shFluc) służyło jako kontrola negatywna. Aby celować w region promotora Limitu dla aktywacji CRISPR, zaprojektowano sgRNA (sgLimit) i wstawiono je do plazmidu phU6- sgRNA (Addgene #53188). Nieukierunkowujący sgRNA (sgNT) służył jako kontrola negatywna. Aby usunąć miejsca wiązania STAT1/IRF1 w promotorze LIMIT, zaprojektowano sparowane sgRNA (psgLIMIT) i wstawiono je do plazmidu PX459 (Addgene #48139). Aby zniszczyć mysie Hsf1 i Gbp2, zaprojektowano shRNA i wstawiono je do plazmidu PLKO.1 (Addgene #10879). Aby wybić GBP1-5, zaprojektowano sgRNA i wstawiono do plazmidu PX459 (Addgene #48139). Sekwencje docelowe wymieniono w tabeli dodatkowej 7. Sekwencje starterów wymieniono w tabeli dodatkowej 8.

Hodowlę komórkową

Linia komórkowa ludzkiego czerniaka A375 (CRL-1619), linie komórkowe czerniaka mysiego, B16-F0 (CRL-6322) i YUMM1.7 (CRL-3362 ), mysią linię komórkową raka okrężnicy CT26 (CRL-2638) i 293T (CRL-3216) zakupiono z American Type Culture Collection (ATCC). Linię komórkową raka okrężnicy myszy MC38 stosowano wcześniej w laboratorium Zou23,48. Komórki OVA B16- ustalono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami42. W tym badaniu wygenerowano linie komórkowe z delecją promotora A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO i A375 LIMIT. Wszystkie linie komórkowe rutynowo badano pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą i potwierdzono wynik negatywny na obecność mykoplazmy. Komórki hodowano w pożywce RMPI (Gibco #11875) uzupełnionej 10% FBS, z wyjątkiem komórek A375 i 293T, przy czym 2 ostatnie linie hodowano w DMEM (Gibco #11965) uzupełnionej 10% FBS. Wszystkie komórki utrzymywano w temperaturze 37 stopni i 5% CO2. W przypadku szoku cieplnego komórki umieszczono w inkubatorze w temperaturze 43 stopni i 5% CO2 na 2 godziny. Aby wygenerować linie komórkowe z nokautem, wytworzono cząstki lentiwirusowe poprzez transfekcję plazmidu shRNA PLKO.1 psPAX2 (Addgene #12260) i pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) do komórek 293T, a następnie transdukowano do komórek nowotworowych komórki z polibrenem (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) przez noc. 48 godzin po transfekcji komórki selekcjonowano puromycyną (1-2 ug/ml) przez dodatkowe 2 tygodnie. Aby ustalić linie komórkowe z nokautem, plazmidy PX459- sgRNA transfekowano do komórek nowotworowych przez 2 dni i selekcjonowano puromycyną (1-2 ug/ml) przez dodatkowe 2 dni. Komórki następnie rozcieńczono seryjnie i wysiano na płytki o 96 dołkach. Po 2-3 tygodniach kolonie pojedynczych komórek rozdzielono i ponownie wysiano na płytki z 6 dołkami. Po zlaniu się komórek zebrano połowę komórek i zweryfikowano skuteczność nokautu (KO) metodą Western blot. Aby zastosować system aktywacji CRISPR do aktywacji mysiego Limitu, phU6-sgRNA transfekowano razem z SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) do komórek B16. Wszystkie transfekcje przeprowadzono z użyciem lipofektaminy 2000 (Thermofisher) w stosunku 1 µg plazmidu: 2 µl regenta do transfekcji. Dawkę do transfekcji określono poprzez miareczkowanie.

Test aktywności lucyferazy

Komórki A375 transfekowano HSE-LUC i PRL-SV40P (Addgene #27163) przez 24 godziny razem z PCI-neo (wektor) lub GBP1, GBP2 przez 48 godzin. Komórki A375 shFluc lub A375 shLIMIT transfekowano HSE-LUC i PRL-SV40P (Addgene #27163) przez 24 godziny, a następnie traktowano IFN przez dodatkowe 48 godzin. Aktywność lucyferazy dla lucyferazy świetlika (HSE-LUC) i lucyferazy renilla (PRL-SV40P) mierzono za pomocą systemu Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Względną aktywność lucyferazy świetlika normalizowano za pomocą aktywności lucyferazy renilla.

Barwienie powierzchni i analiza cytometrii przepływowej (FACS)

Komórki trypsynizowano i przemywano buforem MACS (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). Barwienie powierzchni przeprowadzono dodając następujące przeciwciała do zawiesiny komórek w 50 µl buforu MACS: anty-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anty-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anty-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anty-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) i anty-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Po inkubacji przez 30 minut komórki przemywano buforem MACS i analizowano w cytometrze przepływowym BD Fortessa.

Ilościowa analiza PCR (qPCR).

Całkowity RNA wyizolowano z komórek metodą oczyszczania na kolumnie (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) z traktowaniem DNazą. cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAid (Thermo Fisher Scientific) z losowymi starterami heksamerowymi. Ilościową PCR (qPCR) przeprowadzono na cDNA przy użyciu Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) w systemie StepOnePlus Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Ekspresję genów określono ilościowo przy użyciu starterów wymienionych w tabeli uzupełniającej 8. Krotność zmian w ekspresji mRNA obliczono metodą ΔΔCt, stosując ACTB jako kontrolę endogenną. Wyniki wyrażono jako krotność zmiany poprzez normalizację do kontroli.

Northern blotting

Analizę Northern blot przeprowadzono z 10 µg całkowitego RNA przygotowanego z komórek A375 traktowanych IFN, IFN i TNF. RNA rozdzielono metodą elektroforezy w denaturującym żelu agarozowym (Ambion) i przeniesiono na membrany Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT wykryto przy użyciu sond DNA znakowanych digoksyną i zestawu DIG Northern Starter Kit (Roche). Sekwencje sond ukierunkowane na LIMIT wymieniono w tabeli dodatkowej 7.

Szybka amplifikacja końców cDNA (RACE)

Przeprowadzono RACE w celu identyfikacji końców cDNA ludzkiego LIMIT lub mysiego Limitu za pomocą zestawu do amplifikacji cDNA SMARTer RACE (Clontech). Startery dla RACE wymieniono w tabeli uzupełniającej 8.

Klon pełnometrażowego LIMIT

Po otrzymaniu sekwencji końcowych cDNA, pełnej długości LIMIT amplifikowano metodą PCR i wstawiono do plazmidu PCI-neo pomiędzy XhoI i NotI. Startery klonowe dla ludzkiego LIMIT i mysiego Limitu wymieniono w tabeli uzupełniającej 8.

Frakcjonowanie komórek do RT-PCR

Komórki A375 poddane wstępnej obróbce IFN zebrano z 15 cm płytek przez zeskrobanie i jednokrotne przemycie zimnym PBS. Komórki osadzono przez wirowanie przy 700 g przez 5 minut i poddano lizie hipotonicznym buforem do lizy (10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3% (obj./obj.) NP{{ 12}}, 10% (obj./obj.) gliceryny) w celu zebrania frakcji cytoplazmatycznej. Cytoplazmatyczny RNA otrzymano przez wytrącanie etanolem przez noc w -20 stopniach, a następnie ponowną ekstrakcję przy użyciu odczynnika TRIZOL. Pozostały osad jądrowy przemyto trzykrotnie hipotonicznym buforem do lizy, a następnie ekstrahowano odczynnikiem TRIZOL zgodnie z instrukcjami producenta. RNA wyizolowane z frakcji jądrowych lub cytoplazmatycznych poddano odwrotnej transkrypcji i RT-PCR dla LIMIT ze wskazanymi starterami. Niesplicowane lub dojrzałe ACTB zastosowano jako kontrole dla RNA jądrowego lub cytoplazmatycznego. Startery dla ACTB wymieniono w tabeli uzupełniającej 8.

Western blotting

Komórki przemyto zimnym PBS i poddano lizie w 1 x buforze do lizy RIPA (Pierce) z 1 x inhibitorem proteazy (Pierce). Lizaty inkubowano na lodzie przez 10 minut i klarowano przez wirowanie przy 15,000g przez 15 minut. Stężenie białka oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Thermo Fisher). Białko zawierające trzydzieści mikrogramów zmieszano z buforem do próbki (Thermo Fisher) z -ME i denaturowano w temperaturze 95 stopni przez 5 minut. Próbkę rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Bio-Rad). Błony blokowano 5% wag./obj. odtłuszczonego mleka w proszku i inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4°C i przeciwciałami wtórnymi skoniugowanymi z HRP (CST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnał wykryto przy użyciu substratów Clarity i Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) i wychwycono przy użyciu systemu obrazowania ChemiDoc (Bio-Rad). Przeciwciała były następujące: anty-ludzki GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1:500), anty-HSF1 (CST, 12972, 1:1,000), anty-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1:1000), anty-GBP1 (Proteintech, 15303, 1:1,000), anty-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1:1,000) , anty-HSP90 (CST, 4877, 1:1,000), anty-HSPA5 (CST, 3177, 1:1,000), anty-STAT1 (CST, 9172, 1:1 ,000), anty-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1:1000), anty-RAF1 (CST, 9422, 1:1000), anty-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anty-CDK4 (CST, 12790, 1:1000) i anty-GAPDH (Proteintech, 60004, 1:5000). Do analizy Western blot ludzkiego MHC-I, całkowite lizaty komórkowe zdenaturowano w buforze do próbek bez -ME (nieredukującego), aby zachować mostki dwusiarczkowe i konformację białek wykrywanych przez przeciwciało anty-HLA-ABC (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1:1000).

Koimmunoprecypitacja (Co-IP)

Komórki zebrano za pomocą buforu do lizy IP (Pierce, 87787) plus inhibitor proteazy. Stężenie białka oznaczono za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA. 200-500 µg próbek białka dodano do 1-3 µg pierwotnych przeciwciał anty-HSP90 (Proteintech, 13171) lub anty-HSF1 (CST, 12972) i inkubowano z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 stopni przez noc. Następnie próbki inkubowano dalej z 20 ul białka A/G PLUS-agarozy (Santa Cruz, sc-2003) przez 2 godziny w temperaturze 4 stopni; i odwirowano przy 7500 xg przez 30 sekund w temperaturze 4 stopni. Osad komórkowy przemyto 4 razy buforem do lizy IP, ponownie zawieszono w 40 ul 2 x buforu do próbek z -ME i ogrzewano przez 5 minut w temperaturze 95°C. Próbki zdenaturowanego białka analizowano metodą Western blot. W przypadku Flag IP lizaty komórkowe inkubowano z 20 ul żelu powinowactwa EZview Red ANTI-FLAG M2 (Sigma Aldrich), przemywano, denaturowano i analizowano jak opisano powyżej.

Barwienie immunofluorescencyjne

Komórki A375 osadzone na szkiełkach nakrywkowych traktowano IFN przez 24 godziny. Po dwukrotnym przemyciu PBS komórki utrwalono 4% PFA przez 15 minut i przemyto 2 razy PBS po 5 minut każda. Następnie komórki permeabilizowano za pomocą 0,5% tritonu x-100 w PBS przez 10 minut i płukano 2 razy PBS po 5 minut każdy. Antygeny blokowano 10% normalną surowicą kozią w PBS przez 30 minut. Następnie dodano przeciwciała pierwotne w rozcieńczeniach 1:50 mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu GBP1-5 (Santa Cruz, 166960) lub króliczego przeciwciała przeciw ludzkiemu HSP90 (CST, 4877) i inkubowano w temperaturze 4 stopni przez noc. Następnie komórki przemyto i inkubowano z rozcieńczeniami 1:500 znakowanego Qdot 605 drugorzędowego koziego przeciwciała przeciw mysim (Thermo Fisher, Q11002) lub znakowanego AF488-wtórnego koziego przeciwciała przeciw królikowi (Thermo Fisher, A11034), a następnie zamontowano na szkiełkach przy użyciu odczynnika ProLong Gold zawierającego DAPI. Obrazy fluorescencji konfokalnej zebrano przy użyciu obiektywu olejowo-imersyjnego 63X (konfokalny Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM).

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

ChIP przeprowadzono z usieciowaną chromatyną z komórek A375 traktowanych IFN i przeciwciałem HSF1 (CST, 12972) lub normalną króliczą IgG (CST, 2729), przy użyciu zestawu Simple ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) (CST, 9005). Wzbogacone DNA oznaczono ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów wymienionych w tabeli uzupełniającej 8. Ilość immunoprecypitowanego DNA w każdej próbce przedstawiono jako sygnał w stosunku do całkowitej ilości wejściowej chromatyny, która jest równoważna 1.

Izolacja komórek OT-I i wspólna hodowla z komórkami nowotworowymi OVA+

Myszy C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (karta JAX nr 003831) zakupiono w The Jackson Laboratory. Śledzionę homogenizowano, a pojedyncze komórki zawieszano w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (Sigma-Aldrich) na 1 minutę. Splenocyty osadzono, przemyto i ponownie zawieszono w ilości 2 x 106 komórek na ml w pożywce hodowlanej RPMI zawierającej 1 ug/ml peptydu OVA257-264, 5 ug/ml rekombinowanej mysiej IL-2 i 40 μM { {15}} merkaptoetanol. Komórki inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 5 dni. Aby rozpocząć wspólną hodowlę komórek nowotworowych OT-I i OVA+, po 5-dniowej aktywacji zebrano splenocyty. Komórki OT-I oczyszczono przy użyciu zestawu EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit (Stemcell). Komórki B16-OVA wysiano przez noc. Następnie do hodowli dodano komórki OT-I w różnych proporcjach. Wszystkie komórki zebrano metodą trypsynizacji i analizowano metodą cytometrii przepływowej (FACS).

Komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC) i makrofagi (BMDM)

Szpik kostny wyizolowano z kości udowych myszy C57BL/6 i hodowano w kompletnej pożywce RPMI1640 z 20 ng/ml GM-CSF (R&D). Komórki inkubowano w temperaturze 37 stopni i 5% CO2. Dodatkowe 10 ml pożywki z 20 ng/ml GM-CSF dodano w dniu 3. W dniu 7 zebrano nieadherentne i luźno przylegające komórki z supernatantu hodowli poprzez delikatne przemycie PBS i uznano je za BMDC. Przylegające komórki uznano za BMDM.

Wewnątrznowotworowe profilowanie komórek odpornościowych

Aby określić ilościowo ekspresję wewnątrznowotworowych limfocytów T i cytokin efektorowych komórek T, przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek ze świeżych tkanek nowotworu poprzez fizyczne przepuszczanie przez sitka komórkowe o średnicy 100 μm. Komórki odpornościowe wzbogacono poprzez wirowanie w gradiencie gęstości. W celu barwienia cytokinami wewnątrznowotworowe komórki odpornościowe inkubowano w pożywce hodowlanej RPMI zawierającej PMA (5 ng/ml), jonomycynę (500 ng/ml), brefeldynę A (1:1,000) i Monessen (1:1 ,000) w temperaturze 37 stopni przez 4 godziny. 2-3 ul Anty-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anty-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anty-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), przeciwciała anty-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) i anty-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) dodano na 20 minut w celu wybarwienia powierzchni. Komórki następnie przemyto i ponownie zawieszono w 1 ml świeżo przygotowanego roztworu Fix/Perm (BD Biosciences) w temperaturze 4 stopni przez noc. Po przemyciu buforem Perm/Wash (BD Biosciences), komórki barwiono 2-3ul anty-Ki67 (B56, BD Biosciences), anty-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), i anty-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) przez 30 minut, przemyto i utrwalono w 4% formaldehydzie (Sigma Aldrich). Wszystkie próbki odczytywano na cytometrze LSR Fortessa i analizowano za pomocą oprogramowania FACS DIVA wersja 8.0 (BD Biosciences).

Obliczanie wyniku podpisu

Zastosowaliśmy znormalizowaną ekspresję genów, aby zdefiniować następujące sygnatury: infiltracja limfocytów T CD8+ (CD8A, CD8B, PRF1 i GZMB), ekspresja MHC-I (HLA-A, HLA-B i HLA-C) i sygnalizacja HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 i HSP90B1).

Analiza statystyczna

W przypadku eksperymentów na komórkach, ogólnie w każdym pojedynczym eksperymencie przeprowadzono trzy powtórzenia biologiczne, chyba że zaznaczono inaczej. W przypadku badań na zwierzętach zastosowano nie mniej niż 5 powtórzeń na grupę. Zwierzęta podzielono losowo na różne grupy po zaszczepieniu komórek nowotworowych. Badacze nie byli ślepi na alokację podczas eksperymentów i oceny wyników. Dane przedstawiono jako wartości średnie z wyprowadzeniem standardowym. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Do porównania grup terapeutycznych z grupami kontrolnymi zastosowano dwustronny 2-test t; Funkcję przeżycia oszacowano metodami Kaplana–Meiera, a do obliczenia różnic statystycznych wykorzystano test log-rank.

Dostępność danych

Dane dotyczące sekwencji RNA (GSE99299) i przetworzone dane dotyczące pojedynczych komórek (GSE123814) uzyskano z Gene Expression Omnibus (GEO). Dane proteomiczne MS (PXD006003) uzyskano z repozytorium PRIDE. Zestawy danych TCGA dotyczące raka uzyskano z UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). Dane dotyczące sekwencji RNA i informacje kliniczne do badań klinicznych ICB zostały dostarczone przez odpowiednich autorów. Wszystkie surowe dane potwierdzające wnioski z tego badania są dostępne na żądanie u odpowiedniego autora. W artykule podane są dane źródłowe.

Dostępność kodu

Wszystkie analizy użyte w tym badaniu przeprowadzono zgodnie z podręcznikiem Prism Graphpad w wersji 8.0 i witryną internetową pod adresem http://xena.ucsc.edu/. W trakcie tego badania nie opracowano żadnego nowego kodu ani algorytmów.

Rozszerzone dane

Rozszerzone dane Ryc. 1:

LIMIT koreluje z efektorowymi genami odporności w przypadku wielu typów nowotworów.

Rozszerzone dane Ryc. 2:

Loci genetyczne i sekwencje ludzkiego LIMIT i mysiego Limitu.

Rozszerzone dane Ryc. 3: LIMIT zwiększa wyrażenie MHC-1

Rozszerzone dane Ryc. 5:

LIMIT zwiększa ekspresję MHC-1 obciążonego antygenem in vivo.

Rozszerzone dane Ryc. 6:

LIMIT cis-aktywuje GBP w celu wzmocnienia MHC-1 i odporności na nowotwory.

Rozszerzone dane Ryc. 7:

GBP aktywują HSF1 w celu stymulacji ekspresji MHC-I.

Rozszerzone dane Ryc. 8:

HSF1 napędza ekspresję MHC-I i odporność na nowotwory.

Rozszerzone dane Ryc. 9:

Geny sygnalizacyjne HSF1 korelują z MHC-I i odpornością na nowotwór.

Rozszerzone dane Ryc. 10: Schemat pokazujący, jak oś LIMIT-GBP-HSF1 wpływa na MHC-I i odporność nowotworu

Materiał uzupełniający

Dodatkowe materiały można znaleźć w wersji internetowej w serwisie PubMed Central.

Podziękowanie

Dziękujemy członkom laboratorium Zou za ich wkład intelektualny. Praca ta była częściowo wspierana przez granty badawcze z grantów US NIH/NCI R01 (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) i (CA216919, CA213566, CA120458 (MC) oraz NIH za pośrednictwem Uniwersytetu grantu Michigan Rogel Cancer Center (CA46592).

Bibliografia

1. Zou W, Wolchok JD i Chen L Blokada szlaku PD-L1 (B7-H1) i PD-1 w terapii nowotworów: mechanizmy, biomarkery odpowiedzi i kombinacje. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN i Schreiber RD Neoantygeny w immunoterapii nowotworów. Science 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Antygeny MHC klasy I Garcia-Lora A, Algarra I i Garrido F, nadzór immunologiczny i ucieczka odporności nowotworu. J Cell Physiol 195, 346–355, doi: 10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Antygeny MHC Festenstein H i Garrido F a złośliwość. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM i van Hall T Pilna potrzeba odzyskania MHC klasy I w nowotworach w celu skutecznej immunoterapii. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC i in. Atlas ludzkich długich, niekodujących RNA z dokładnymi końcami 5'. Natura 543, 199–204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME i Mattick JS Długie niekodujące RNA: wgląd w funkcje. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi: 10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL i Reik W. Ewolucja i funkcje długich niekodujących RNA. Komórka 136, 629–641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H i Spector DL ​​Długie niekodujące RNA: funkcjonalne niespodzianki ze świata RNA. Genes Dev 23, 1494–1504, doi: 10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D i Lee JT Długie niekodujące RNA: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość. Genetyka 193, 651–669, doi: 10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA i Chang HY Długie niekodujące RNA w programowaniu i przeprogramowaniu losu komórki. Cell Stem Cell 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Pojawiająca się rola lncRNA w nowotworach. Nat Med 21, 1253–1261, doi: 10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A i in. Adnotacja referencyjna GENCODE dotycząca genomu człowieka i myszy. Kwasy nukleinowe Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N i in. Ewolucja nowotworu i mikrośrodowiska podczas immunoterapii niwolumabem. Komórka 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W. i in. Genomowe i transkryptomiczne cechy odpowiedzi na terapię anty-PD-1 w czerniaku z przerzutami. Komórka 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM i in. Genomowe korelaty odpowiedzi na blokadę CTLA-4 w czerniaku z przerzutami. Science 350, 207–211, doi: 10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T i in. Mutacje somatyczne i homologia neoepitopów w czerniakach leczonych blokadą CTLA-4. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J. i in. Systematyczne analizy nowej sygnatury związanej z lncRNA jako biomarkera prognostycznego raka wątrobowokomórkowego. Cancer Med, doi: 10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH i in. Demonstracja systemu nadzoru nowotworu zależnego od interferonu gamma u myszy immunokompetentnych. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi: 10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Prezentacja antygenu Fruh K i Yang Y przez MHC klasy I i jego regulacja przez interferon-gamma. Curr Opin Immunol 11, 76–81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H. i in. Związany z nowotworem B7-H1 promuje apoptozę komórek T: potencjalny mechanizm unikania odporności. Nat Med 8, 793–800, doi: 10,1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P i in. Aktywacja genów pod kontrolą RNA przez czynniki transkrypcyjne oparte na CRISPR-Cas9-. Nat Methods 10, 973–976, doi: 10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H. i in. Ekspresja PD-L1 u gospodarza określa skuteczność regresji nowotworu za pośrednictwem blokady szlaku PD-L1. J Clin Invest 128, 1708, doi: 10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q i Prasanth KV Długie niekodujące RNA jądrowe: kluczowe regulatory ekspresji genów. Trendy Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ i Yin FH Interferon indukcja białek fibroblastów z aktywnością wiązania guanylanu. J Biol Chem 258, 7746–7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH i in. Indukowane interferonem białka wiążące guanylan w aktywacji inflamasomów i obronie gospodarza. Nat Immunol 17, 481–489, doi: 10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X i in. PROMO: wykrywanie znanych elementów regulujących transkrypcję za pomocą wyszukiwania dostosowanego do gatunku. Bioinformatyka 18, 333–334, doi: 10.1093/bioinformatyka/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Consortium, EP Zintegrowana encyklopedia elementów DNA w ludzkim genomie. Natura 489, 57–74, doi: 10.1038/natura11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C i Sampson SB HSF1: Strażnik proteostazy w raku. Trendy Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y i Morano KA Małocząsteczkowe aktywatory reakcji na szok cieplny: właściwości chemiczne, cele molekularne i obietnica terapeutyczna. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi: 10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF i Voellmy R Represja aktywacji czynnika transkrypcyjnego szoku cieplnego HSF1 przez HSP90 (kompleks HSP90), który tworzy kompleks wrażliwy na stres z HSF1. Komórka 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Regulacja współczynnika szoku cieplnego u ssaków 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 i opieka nad rakiem. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi: 10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE i in. Klonalna wymiana limfocytów T specyficznych dla nowotworu po blokadzie PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi: 10,1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M i in. Proteomika odpowiedzi czerniaka na immunoterapię ujawnia zależność mitochondrialną. Komórka 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA i Lindsay MA Długie niekodujące RNA w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Trendy Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Długie niekodujące RNA w regulacji odpowiedzi immunologicznej i wytrenowanej odporności. Front Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM i Chang HY Długie niekodujące RNA w szlakach nowotworowych. Cancer Cell 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT i in. LncRNA GClnc1 wspomaga karcynogenezę żołądka i może działać jako modułowe rusztowanie kompleksów WDR5 i KAT2A w celu określenia wzoru modyfikacji histonów. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA i Ribas Pierwotna, adaptacyjna i nabyta odporność na immunoterapię nowotworów. Komórka 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D i in. Epigenetyczne wyciszanie chemokin typu TH1- kształtuje odporność nowotworu i immunoterapię. Natura 527, 249–253, doi: 10.1038/natura15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W i in. Limfocyty T CD8(+) regulują ferroptozę nowotworu podczas immunoterapii nowotworu. Nature 569, 270–274, doi:10,1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J. i in. Utrata genów szlaku IFN-gamma w komórkach nowotworowych jako mechanizm oporności na terapię anty-CTLA-4. Komórka 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM i in. Mutacje związane z nabytą opornością na blokadę PD-1 w czerniaku. N Engl J Med 375, 819–829, doi: 10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT i in. Badania przesiewowe CRISPR in vivo identyfikują Ptpn2 jako cel immunoterapii raka. Natura 547, 413–418, doi: 10.1038/natura23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS i in. Podstawowa oporność na blokadę PD-1 za pośrednictwem mutacji JAK1/2. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A i in. Nabyta oporność na IFNgamma upośledza odporność przeciwnowotworową i powoduje powstawanie zmian czerniakowych opornych na limfocyty T. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J i in. Epigenetyczne mutacje kierowcy w ARID1A kształtują fenotyp immunologiczny raka i immunoterapię. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL i in. Sygnalizacja interferonu nowotworowego reguluje program oporności wielogenowej na blokadę punktów kontrolnych układu odpornościowego. Komórka 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD i Spector DL ​​Terapeutyczne celowanie w długie niekodujące RNA w raku. Trendy Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N i Ulitsky I Regulacja ekspresji genów przez długie niekodujące RNA działające w układzie cis. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi: 10,1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN i Sattler M Wyzwania i perspektywy biologii strukturalnej lncRNA – przykład powtórzeń Xist lncRNA A. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR i in. GBP5 promuje montaż inflamasomu NLRP3 i odporność u ssaków. Science 336, 481–485, doi: 10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A i MacMicking JD Białka wiążące guanylan indukowane interferonem: Strażnicy obrony gospodarza w zdrowiu i chorobie. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M i in. Skupisko indukowanych interferonem-gamma GTPaz p65 odgrywa kluczową rolę w obronie gospodarza przed Toxoplasma gondii. Immunitet 37, 302–313, doi:10.1016/j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM i in. Hamowanie HSP90 wzmacnia immunoterapię nowotworów poprzez zwiększenie ekspresji genów odpowiedzi na interferon. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA i Kaufmann GF ukierunkowane na białko szoku cieplnego 90 (HSP90) jako strategia uzupełniająca w celu blokowania immunologicznych punktów kontrolnych w terapii raka. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A i in. Ocena kliniczna i profilowanie biomarkerów inhibitorów Hsp90. Metody Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J. i in. Nadekspresja Bcl-2 zwiększa przeżycie komórek T specyficznych dla nowotworu. Cancer Res 65, 2001–2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H i in. Raf-1 jest wymagany do produkcji IL2 przez komórki T. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]