Miejsce podatności na SARS-CoV-2 Skok indukuje przeciwciała o szerokim zakresie ochronnym przeciwko odmiennym antygenowo podwariantom Omikronu

Szybka ewolucja wariantów wirusa 2 wirusa ciężkiego ostrego układu oddechowego (SARS-CoV-2) firmy Omicron uwydatniła potrzebę identyfikacji przeciwciał o szerokich zdolnościach neutralizujących, aby zapewnić przyszłe terapie monoklonalne i strategie szczepień. W niniejszym dokumencie zidentyfikowaliśmy S728-1157, przeciwciało o szerokim zasięgu neutralizującym (bnAb) skierowane przeciwko miejscu wiązania receptora (RBS), które pochodziło od osoby zakażonej wcześniej WT SARS-CoV-2 przed rozprzestrzenieniem się wirusa warianty budzące obawy (LZO). S728-1157 wykazał szeroką neutralizację krzyżową wszystkich dominujących wariantów, w tym D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu i Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Ponadto S728-1157 chronił chomiki przed prowokacją in vivo wirusami WT, Delta i BA.1. Analiza strukturalna wykazała, że ​​przeciwciało to celuje w epitop klasy 1/RBS-A w domenie wiążącej receptor poprzez liczne interakcje hydrofobowe i polarne z regionem 3 determinującym komplementarność łańcucha ciężkiego (CDR-H3), oprócz wspólnych motywów w CDR-H1/ CDR-H2 przeciwciał klasy 1/RBS-A. Co ważne, epitop ten był łatwiej dostępny w stanie otwartym i przed fuzją lub w konstruktach kolców stabilizowanych heksaproliną (6P) w porównaniu z konstruktami diproliny (2P). Ogólnie rzecz biorąc, S728-1157 wykazuje szeroki potencjał terapeutyczny i może pomóc w projektowaniu szczepionek ukierunkowanych na cel przeciwko przyszłym wariantom SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Wstęp

Od początku pandemii w grudniu 2019 r. wirus koronawirusowy zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) doprowadził do ponad 660 milionów przypadków choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) i ponad 6,5 milionów zgonów na całym świecie. Chociaż szybki rozwój i dystrybucja szczepionek i środków terapeutycznych w dużym stopniu ograniczyły skutki COVID-19, pojawienie się krążących potencjalnie niebezpiecznych wariantów (LZO) w dalszym ciągu stanowi główne zagrożenie ze względu na możliwość dalszego unikania odporności i zwiększoną patogeniczność. Wariant D614G był najwcześniejszym, który się pojawił, a następnie stał się powszechnie rozpowszechniony. W porównaniu z WT, wariant D614G wykazywał raczej zwiększoną zdolność do przenoszenia niż zwiększoną patogenność, w związku z czym było mało prawdopodobne, aby zmniejszał skuteczność szczepionek w badaniach klinicznych (1). Od pojawienia się D614G do października 2021 r. na całym świecie wyewoluowały 4 dodatkowe znaczące LZO, w tym alfa, beta, gamma i delta. Wśród tych wariantów Delta stała się poważnym globalnym zagrożeniem ze względu na możliwość przenoszenia, zwiększone nasilenie choroby i częściowe obejście układu odpornościowego, na co wskazuje zmniejszona zdolność surowicy poliklonalnej i mAb do neutralizacji tego szczepu (2–6). Wkrótce potem, w listopadzie 2021 r., zidentyfikowano wariant Omicron i ogłoszono go jako nowy LZO. Wariant ten posiadał jak dotąd największą liczbę mutacji i wydawał się rozprzestrzeniać szybciej niż poprzednie szczepy (7, 8). Obecnie istnieje szeroki zakres podlinii Omicron prowadzących do nowych przypadków-19 COVID, przy czym BQ.1, BQ.1.1 i XBB.1.5 stały się dominujące nad BA.5 i stanowiły wówczas większość nowych przypadków na całym świecie pisania. Warianty Omicron mogą w różnym stopniu nie zostać rozpoznane przez odporność związaną ze szczepionką przeciwko COVID-19, w ten sposób znacznie zmniejszając siłę neutralizującą przeciwciał w surowicy od osób rekonwalescencji, w pełni zaszczepionych mRNA oraz osób, którym podano dawkę przypominającą nową dwuwalentną szczepionką WT/BA.5 szczepionka mRNA (9, 10). Podobnie, warianty Omicron były w stanie uniknąć wiązania kilku terapeutycznych mAb z autoryzacją do stosowania w sytuacjach awaryjnych (EUA), mimo że wcześniej wykazano, że są one skuteczne przeciwko wcześniejszym LZO (10–12). Ze względu na obniżoną neutralizację przeciwko Omicron i ciągłe zagrożenie przyszłymi LZO, istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania szerokiego zakresu i silnych przeciwciał neutralizujących, które mogą chronić przed różnymi, ewoluującymi liniami SARS-CoV-2. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy silne mAb reaktywne w domenie wiążącej receptor (reaktywne w RBD) z krwi obwodowej rekonwalescencji SARS-CoV-2, które skutecznie neutralizowało alfa, beta, kappa, delta, mu, i warianty Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 i XBB). To mAb, S728-1157, znacząco zmniejszyło miano wirusa BA.1 Omicron, Delta i WT w płucach i błonie śluzowej nosa po prowokacji in vivo u chomików. S728-1157 wiąże miejsce wiązania receptora (RBS), które jest w pełni odsłonięte, gdy RBD na kolcu ma konformację górną. mAb wykorzystuje motywy znalezione w CDR-H1 i CDR-H2, które są wspólne dla przeciwciał IGHV3-53/3-66 klasy 1/RBS-A (13, 14), ale także poprzez rozległe unikalne kontakty z CDR -H3, aby ominąć mutacje w skokach LZO. Sugeruje to, że racjonalny projekt przyszłych wzmocnień szczepionki obejmujących warianty Omicron powinien zostać zmodyfikowany, aby zapewnić ustabilizowany skok w konfiguracji w większości zwiększonej, aby optymalnie indukować mAb klasy 1/RBS-A, które mają podobne cechy CDR-H3.

Cistanche przynosi korzyści - wzmacnia układ odpornościowy

Wyniki

Izolacja mAb reagujących z RBD, które wykazują różnorodne wzorce neutralizacji i siły działania. Przed rozprzestrzenianiem się linii Omicron scharakteryzowaliśmy wcześniej 43 mAb ukierunkowane na różne epitopy na białku kolca, w tym domenę N-końcową (NTD), RBD i podjednostkę 2 (S2). Żadne z tych przeciwciał nie było w stanie zneutralizować krążących wówczas wariantów SARS-CoV-2 (15). W tym badaniu dodatkowy panel mAb reagujących na RBD wyrażano od 3 osób z wysoką odpowiedzią, u których wystąpiły silne odpowiedzi przeciw szczytowym IgG, jak zdefiniowano wcześniej (16) (tabele uzupełniające 1 i 3; materiały uzupełniające dostępne w Internecie w tym artykule; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Chociaż odsetek kolczastych komórek B wiążących RBD był podobny u osób o wysokim wskaźniku odpowiedzi w porównaniu z osobami o średniej i niskiej odpowiedzi (ryc. 1, A – C), wskaźniki hipermutacji somatycznej łańcucha ciężkiego były znacznie większe w grupie o wysokim wskaźniku odpowiedzi (ryc. 1 , D i E), co sugeruje, że osoby te mogą mieć najwyższy potencjał do generowania silnych, reagujących krzyżowo mAb (16). Przeciwciała te badano dalej przeciwko mutantom RBD w celu zidentyfikowania ich klasyfikacji epitopów (17). Spośród 14 mAb reaktywnych wobec RBD zidentyfikowaliśmy 4 mAb klasy 2, 2 mAb klasy 3 i 8 niesklasyfikowanych mAb, które wykazały niewielką lub żadną redukcję wiązania wobec jakichkolwiek kluczowych testowanych mutantów RBD (Figura 1F). Należy zauważyć, że przeciwciała klasy 2, klasy 3 i klasy 4 w przybliżeniu odpowiadają epitopom RBS BD, S309 i CR3022 zdefiniowanym w poprzednich badaniach (13, 18). mAb RBD klasy 2 i 3 nie rozpoznały wielowariantowego mutanta RBD zawierającego substytucje K417N/E484K/L452R/N501Y, sztucznie zaprojektowanego RBD zawierającego kluczowe mutacje umożliwiające ucieczkę wirusa (17, 18), ani nie wykazały żadnej reaktywności krzyżowej z RBD SARS-CoV-1 i bliskowschodni zespół oddechowy (MERS)-CoV (ryc. 1F). Funkcjonalnie, mAb RBD klasy 2 i 3 silnie neutralizowały warianty D614G i Delta, ale aktywność neutralizująca była bardziej ograniczona w stosunku do Beta, Kappa i Mu (Figura 1G). Żadne z badanych przeciwciał klasy 2 lub 3 nie neutralizowało żadnego testowanego wariantu Omicron.

Natomiast większość niesklasyfikowanych mAb wiązało się z wielowariantem RBD i reagowało krzyżowo z RBD SARS-CoV-1 (Rysunek 1F). Wśród nich zidentyfikowaliśmy 3 mAb, S451-1140, S626-161 i S728-1157, które wykazały wysoką siłę neutralizacji przeciwko D614G i neutralizowanym krzyżowo Beta, Delta, Kappa, Mu i Omicron BA.1 o 99% stężeniu hamującym (IC99) w zakresie 20–2500 ng/ml (ryc. 1G). Biorąc pod uwagę szeroką siłę neutralizacji tych 3 mAb, oprócz platformy do testu łysinek, przeprowadziliśmy także aktywność neutralizującą wobec autentycznych BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Wirusy BA.5 i XBB wykorzystujące test neutralizacji redukcji ogniska (FRNT) (Rysunek 1G). Spośród nich S728-1157 wykazywał wysoką aktywność neutralizującą w stosunku do panelu wariantów Omicron, w tym BA.1, BA.2, BA.4 i BA.5, z IC99 do 100 ng/ml mierzonym metodą próba płytki nazębnej. Podobny scenariusz zaobserwowano przy użyciu FRNT, gdzie S728-1157 zachował wysoką aktywność neutralizującą wobec BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 i XBB przy IC50 w zakresie 8–300 ng /ml (Figura 1G). S451-1140 silnie neutralizował BA.1, BA.2, BA.2.75 i BL.1, ale nie BA.4 i BA.5, co zaobserwowano w obu platformach testów neutralizacji. Z drugiej strony S626-161 nie wykazał działania neutralizującego wobec wariantów Omicron poza wariantem BA.1 (Rysunek 1G). Chociaż S626-161 miał niższą siłę neutralizacji testowanych LZO niż pozostałe 2 przeciwciała, było to jedyne mAb, które wykazywało reaktywność krzyżową nie tylko wobec SARS CoV-1 RBD, ale było również w stanie zneutralizować nietoperze koronawirusy WIV-1 i RsSHC014 (ryc. 1, F i G). Dane te sugerują, że S626-161 rozpoznaje konserwatywny epitop, który jest wspólny dla tych linii arbowirusów, ale jest nieobecny w szczepach BA.2 i późniejszych. Dodatkowo, w porównaniu z S728-1157 i S451-1140, S626-161 ma dłuższy CDR-H3, który może zapewnić lepszą zdolność rozpoznawania wysoce konserwatywnego obszaru reszt wspólnych dla arbowirusów, jak opisano w poprzednim badaniu (19) (rysunek uzupełniający 1). Porównując geny zmienne łańcucha ciężkiego (IGHV) i lekkiego (IGLV lub IGKV) tych 3 mAb z dostępną bazą danych mAb neutralizujących SARS-CoV-2 (13, 15, 20–27), odkryliśmy, że łańcuch ciężki geny zmienne wykorzystywane przez S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) i S626-161 (IGHV4-39) mają wcześniej zgłaszano, że koduje kilka silnie neutralizujących przeciwciał SARS-CoV-2 skierowanych przeciwko RBD (21, 22, 28, 29). Jednakże tylko S728-1157 miał unikalne pary zmiennych genów łańcucha ciężkiego i lekkiego, które nie zostały zgłoszone w bazie danych (tabela uzupełniająca 3), co wskazuje, że nie jest to klonotyp publiczny.

Rycina 1. Charakterystyka mAb reagujących na RBD wyizolowanych od osób rekonwalescencji z COVID-19

Te 3 mAb (S451-1140, S626-161 i S728-1157) scharakteryzowano dalej, aby określić zakres ich wiązania z LZO SARSCoV-2 (Rysunek 2, A i B) . Wykazano, że stabilizowany prefuzją impuls zawierający 2-podstawienia proliny w podjednostce S2 (2P; diprolina) jest lepszym immunogenem w porównaniu z impulsem WT i jest podstawą kilku obecnych SARS-CoV-2 szczepionki, w tym szczepionki oparte na mRNA (30, 31). Niedawno doniesiono, że białko kolców stabilizowane 6 prolinami (6P; heksaprolina) zwiększa ekspresję i jest jeszcze bardziej stabilne niż oryginalny konstrukt diproliny; w rezultacie zaproponowano go do stosowania w szczepionkach przeciwko COVID-19 nowej generacji (32, 33). Aby określić, czy istnieją różnice w antygenowości między konstruktami kolców diproliny i heksaproliny, oba immunogeny włączono do naszego panelu testowego. Jak zmierzono za pomocą testu ELISA, odkryliśmy, że 3 mAb wiązały antygen szczytowy 6P-WT w większym stopniu w porównaniu z impulsem WT-2P (Figura 2, A i B). Wszystkie 3 mAb wykazywały porównywalne wiązanie z kolcami wirusów Alpha, Beta, Gamma i Delta w porównaniu z WT-2P (Figura 2, A i B). Jednakże reaktywność wiązania tych 3 mAb była znacznie zmniejszona w stosunku do panelu antygenów z rodziny Omicron (Figura 2, B i C). Wiązanie S451-1140 było wrażliwe na mutacje znalezione w BA.1 i BA.2, co skutkowało dużym spadkiem wiązania i 31-krotnym zmniejszeniem neutralizacji wobec tych wariantów w porównaniu z WT-2 Odpowiednio antygen P i wirus D614G (Figura 2B). mAb neutralizujące krzyżowo sarbekowirusa, S626-161, również wykazywało 1,2- do 3,5--krotnie zmniejszone wiązanie z antygenem szczytowym BA.1, co może odpowiadać za {{45} }krotna redukcja aktywności neutralizującej wobec BA.1 (Rysunek 1G i Rycina 2, B i C). W przypadku najsilniejszego przeciwciała o szerokim spektrum neutralizacji (bnAb), S728-1157, wiązanie z antygenami Omicron zostało zmniejszone w mniejszym stopniu (w zakresie od 1,1- do 4,4-krotnie) w porównaniu z Skok WT-2P i nie miał on wpływu na działanie neutralizujące (Rysunek 1G i Ryc. 2, B i C). Znaczący spadek wiązania mAb neutralizującego Omicron z pikiem BA.1 może wynikać ze zmian w jego ruchliwości i być związany ze ścisłym upakowaniem struktur Omicron 3-RBD-down Omicron i preferencją dla 1- zwiększyć RBD, które pomagają w unikaniu przeciwciał, jak podano w poprzednim badaniu (34). Mutacje stabilizujące 2P i 6P mają także zróżnicowany wpływ na warianty Omicron, gdzie wszystkie 3 mAb wykazały ponad 2.8-krotnie zwiększone wiązanie ze szczytem BA.1-6P w porównaniu z BA.1-2P wersja, ale tylko nieznacznie zwiększone wiązanie z wersjami spike BA.2 i BA.4/5 6P w porównaniu z ich wersjami 2P o 1,2 × do 1,4 ×, co sugeruje nieco lepszą dostępność mAb neutralizujących Omikron dla wersji heksapolowych, szczególnie w przypadku konstrukcji kolca BA.1. Oprócz testu ELISA, zastosowano interferometrię biowarstwy (BLI) do ilościowego określenia szybkości wiązania i stałych równowagi (kon, koff i KD) tych 3 mAb z panelem antygenów kolczastych (Uzupełniająca Figura 2). Szybkość rozpoznawania kon fragmentu wiązania antygenu (Fab) z impulsami heksaproliny była 1,5- do 3,3-krotnie większa w porównaniu z impulsami diproliny (Uzupełniający Rysunek 2, B i C), co pokazuje, że przeciwciała wiązały się z konstruktem 6P szybciej niż z konstruktem 2P. Można było się tego spodziewać, gdyby epitopy były bardziej dostępne na RBD w stanie otwartym na kolcu heksaproliny. Z wyjątkiem S626- 161, Fab dysocjowały od impulsu heksaproliny wolniej (miały niższy koff) niż impulsu diproliny, tak że ogólna KD pokazała, że ​​S728-1157 i S451-1140 wiązały się z kolec heksaproliny z większym powinowactwem (rysunek uzupełniający 2, B i C). Wzrost wiązania z impulsem heksaproliny był jeszcze bardziej zauważalny w przypadku nienaruszonej IgG w modelu interakcji 1:2, jak pokazano za pomocą mAb S728-1157 i S451- 1140, zgodnie z ekspozycją wielu epitopów ze stabilizacją 6P umożliwiającą poprawiona awidność (Uzupełniająca Figura 2, A i C). Podsumowując, wyniki te sugerują, że docelowe epitopy mogą być stosunkowo bardziej dostępne na szczycie stabilizowanym 6P, gdy RBD jest w stanie otwartym. Następnie przeprowadzono analizy strukturalne, aby zweryfikować to przypuszczenie.

Figura 2. Szerokość wiązania mAb neutralizujących Omicron

Analiza strukturalna szeroko neutralizujących mAb. Jako pierwsze przybliżenie związanych epitopów zastosowano test kompetycyjny ELISA w celu ustalenia, czy te 3 szeroko neutralizujące mAb pokrywają się w jakimkolwiek stopniu z naszym obecnym panelem mAb, zbiorem mAb o znanej specyficzności epitopowej z poprzednich badań (15, 25, 35). i 2 inne mAb obecnie stosowane klinicznie, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) i REGN10933 (Regeneron) (37). Miejsca wiązania S451-1140 i S728-1157 częściowo pokrywały się z CC12.3 (23, 25), przeciwciałem neutralizującym klasy 1 i większością przeciwciał klasy 2, w tym LY-CoV555 i REGN10933, ale nie z przeciwciałami klasy 3 i 4 (ryc. 3A). S626-161 ma zauważalne nakładanie się w regionie wiążącym z CC12.3 klasy 1, kilkoma przeciwciałami klasy 4, w tym CR3022 i innymi niesklasyfikowanymi przeciwciałami, jednocześnie w pewnym stopniu pokrywa się z kilkoma przeciwciałami klasy 2 i jednym przeciwciałem klasy 3 (ryc. 3A). Analogicznie, test konkurencji BLI ujawnił, że S451-1140 i S728-1157 silnie konkurują ze sobą o wiązanie ze szczytem WT-6P, podczas gdy S626-161 nie (rysunek uzupełniający 3). Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że S451-1140 i S728-1157 rozpoznają podobne epitopy, które różnią się od S626-161.

Rysunek 3. Mechanizm szerokiej neutralizacji S728-1157

Przeciwciało S728-1157 było kodowane przez IGHV3-66 i posiadało krótki region 3 determinujący komplementarność (CDR-H3). W szczególności mAb, które wiążą RBS w trybie wiązania 1 (tj. miejsce RBS-A lub klasa 1), typowane przez CC12.1, CC12.3, B38 i C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), zwykle używają IGHV3-53 lub 3-66 i są wrażliwi na mutacje VOC (40). Jednakże region CDR-H3 S728-1157 bardzo różni się od innych przeciwciał tej klasy, co potencjalnie odpowiada za jego szerszą aktywność. Aby zrozumieć podstawy strukturalne szerokiej neutralizacji przez S728-1157 w tym epitopie, rozwiązaliśmy strukturę mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) (Figura 3B) IgG S728-1157 w kompleksie z kolcem WT{ {31}}P-Mut7, wersja kolca WT-6P posiadająca międzyprotomerowe wiązanie disiarczkowe przy C705 i C883, przy globalnej rozdzielczości około 3,3 Å (rysunek uzupełniający 4E). Stosując rozszerzanie symetrii, skupioną klasyfikację i metody udoskonalania, osiągnęliśmy lokalną rozdzielczość na interfejsie RBD-Fv do około 4 Å (rysunek uzupełniający 4E i tabela uzupełniająca 8). Strukturę krystaliczną S728-1157 Fab określono przy rozdzielczości 3,1 Å i wykorzystano do zbudowania modelu atomowego na granicy faz RBD-Fv. Nasze struktury potwierdzają, że S728-1157 związał epitop RBS-A (lub klasy 1) w konformacji RBD-up (ryc. 3B i dodatkowy ryc. 4E), podobnie jak inne IGHV3-53/{{55} } przeciwciała (Figura 3C). Przestrzenna blokada miejsca wiązania enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) przez S728-1157 wyjaśnia jego wysoką siłę neutralizacji przeciwko SARS-CoV-2. Motyw 32NY33 i motyw 53SGGS56 (23) w S728-1157 CDR-H1 i -H2 oddziałują z RBD w prawie taki sam sposób jak CC12.3 (rysunek uzupełniający 4, B i C). Jednakże w porównaniu z VH 98DF99 w CC12.3, VH 98DY99 w S728-1157 CDR-H3 tworzy bardziej rozległe interakcje, obejmujące zarówno oddziaływania hydrofobowe, jak i polarne, z RBD, co może odpowiadać za szeroką neutralizację wobec LZO (rysunek 3D i tabele uzupełniające 6 i 7). Diglicyna VH 100GG101 w S728- 1157 CDR-H3 może również ułatwiać bardziej rozległe wiązanie w porównaniu z VH Y100 w CC12.3, prawdopodobnie ze względu na elastyczność reszt glicyny, która prowadzi do innej konformacji końcówki CDR -H3 pętla i względne przesunięcie reszt przy 98DY99.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Chociaż LZO Omicron mają rozległe mutacje w RBD, większość tych reszt nie oddziałuje z S728-1157, ponieważ nadal obserwuje się wiązanie (Uzupełniający Rysunek 4A). Z naszego modelu spike WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 przewiduje się, że Y505 do VL Q31 i E484 do VH Y99 utworzą wiązania wodorowe (rysunek uzupełniający 4D i tabela uzupełniająca 6 ), które mogą zostać zakłócone przez mutacje Omicron Y505H i E484A. Jednakże mutacja Y505H nadal pozwalałaby na wiązanie wodorowe z VL Q31, a mutacja E484A dodałaby kolejny hydrofobowy łańcuch boczny w pobliżu reszt hydrofobowych VL Y99, F456 i Y489. Kontakty te mogą częściowo wyjaśniać mechanizm, który umożliwia S728-1157 zachowanie, choć zmniejszonej, aktywności neutralizującej wobec antygenu kolca BA.1 (Rysunek 1G i Ryc. 2B). Z kolei antygen BA.1 jest prawdopodobnie powiązany z mutacjami Omicron zmieniającymi krajobraz konformacyjny białka kolca (34). Jednakże kilka zmutowanych somatycznie reszt, tj. VH L27, L28, R31, F58 oraz VL V28 i Q31, w S728-1157 bierze udział w interakcji z SARS-CoV-2 RBD (Uzupełniający Rysunek 1 i Tabela uzupełniająca 7), co może również przyczyniać się do jego szerokiej reaktywności w porównaniu z CC12.3. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania strukturalne ujawniły podstawę szerokiej neutralizacji S728-1157, która może pomieścić większość mutacji w LZO SARS-CoV-2.

Rycina 4. Skuteczność ochronna bnAbs przed infekcją SARS-CoV-2 u chomików.

S728-1157 ogranicza replikację SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta i WT SARS-CoV-2 u chomików syryjskich. Aby ocenić skuteczność ochronną naszych szeroko neutralizujących mAb, wykorzystaliśmy model zakażenia chomikiem złotym syryjskim, który był szeroko stosowany w przypadku SARS-CoV-2. Chomiki otrzymały 5 mg/kg naszego testowego mAb lub kontrolę izotypową ukierunkowaną na nieistotny antygen (glikoproteinę wirusa ebola) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 1 dzień po zakażeniu wirusami SARS CoV-2. Tkanki płuc i nosa pobrano 4 dni po zakażeniu (ryc. 4A). Terapeutyczne podanie S728-1157 spowodowało zmniejszenie mian wariantów WT, BA.1 Omicron i Delta zarówno w małżowinach nosowych, jak i płucach zakażonych chomików (ryc. 4, B – D). Co ciekawe, wpływ S728-1157 na płuca był dramatyczny, zmniejszając miano wirusa WT i BA.1 Omicron o około 104 PFU, przy całkowitym zniesieniu miana wirusa wariantu BA.1 Omicron (ryc. 4C). W przeciwieństwie do neutralizacji in vitro (Rysunek 1G), S451-1140 nie zmniejszał replikacji wirusa BA.1 Omicron w płucach i małżowinach nosowych, co wskazuje na rozdźwięk pomiędzy neutralizacją in vitro a ochroną tego klonu in vivo (Rysunek 4E) . Dla porównania, podawanie S626-161 spowodowało marginalnie istotne zmniejszenie miana wirusa w płucach po prowokacji WT i BA.1 (Figura 4, F i G). Dane te podkreślają, że w celu precyzyjnego zdefiniowania szeroko ochronnych mAb wymagana jest ocena skuteczności ochrony równolegle z aktywnością neutralizującą. Idąc dalej, interesujące będzie zbadanie, w jakim stopniu zdolność ochronna S728-1157 jest zależna od Fc. Ogólnie rzecz biorąc, S728-1157 stanowi obiecujące mAb o szerokiej skuteczności neutralizacji przeciwko wariantom SARS CoV-2, które są zdolne do radykalnego ograniczenia replikacji WT, Delta i BA.1 in vivo.

Zakażenie SARS-CoV-2 rzadko wywołuje silne, podobne do S728-1157, neutralizujące krzyżowo mAb. Biorąc pod uwagę krzyżowy potencjał neutralizacji i profilaktyki S728-1157, staraliśmy się ocenić, czy przeciwciała podobne do S728–1157 są często indukowane w odpowiedziach poliklonalnych u pacjentów z SARS-CoV-2. Aby to ocenić, przeprowadziliśmy konkurencyjne testy ELISA przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej w celu wykrycia mian przeciwciał anty-RBD, które mogłyby konkurować o wiązanie z S728-1157 (ryc. 5A). Pacjentów podzielono na 3 grupy w oparciu o wielkość odpowiedzi przeciwciał, jak zdefiniowano wcześniej (15, 16). Chociaż osoby z wysoką i umiarkowaną odpowiedzią miały wyższe miano przeciwciał w surowicy kompetycyjnych wobec S728-1157 w porównaniu z osobami o niskiej odpowiedzi (ryc. 5B), miana były dość niskie we wszystkich grupach, co sugeruje, że nabywanie wysokiego poziomu S{{ jest rzadkością 18}}-podobne przeciwciała w surowicy poliklonalnej po zakażeniu WT SARS-CoV-2. Oprócz S728-1157 testowaliśmy konkurencję surowicy rekonwalescencji z innymi mAb, w tym S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 i CC12.3. Podobnie jak w przypadku S728-1157, zaobserwowaliśmy stosunkowo niskie miano przeciwciał konkurujących z S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 i CC12.3 w surowicy poliklonalnej większości rekonwalescencji osobniki (ryc. 5, C – F i H). Niemniej jednak osoby z wysoką odpowiedzią miały zazwyczaj znacznie wyższe miana przeciwko neutralizującym mAb niż osoby z niską odpowiedzią (Figura 5, B – F i H). Przeciwnie, przeciwciała skierowane przeciwko miejscu epitopu CR3022 były bardziej wyraźne u osób rekonwalescencji, co sugeruje wzbogacenie przeciwciał klasy 4 RBD w surowicy poliklonalnej (Figura 5G). Warto zauważyć, że nie było znaczącej różnicy w mianach CR3022 pomiędzy 3 grupami odpowiadającymi na leczenie, co sugeruje, że przeciwciała przeciwko miejscu CR były konsekwentnie indukowane podczas zakażenia WT SARS-CoV-2 u większości osób. Co ciekawe, w porównaniu z CC12.3, S728-1157 wykryto na 4-krotnie niższym poziomie w surowicy osób z dużą odpowiedzią. Zatem pomimo tego, że przeciwciała klasy 1 są często indukowane przez naturalną infekcję i szczepienie (14, 20, 28, 29, 41–43), nasze dane sugerują, że przeciwciała podobne do S728–1157, które reprezentują podzbiór tej klasy, są stosunkowo rzadkie.

Dodatkowo zbadaliśmy różnicę w reaktywności na skok stabilizowany 2P i 6P w naszych surowicach kohortowych w okresie rekonwalescencji (ryc. 5, I – K). Odkryliśmy, że we wszystkich 3 grupach odpowiadających na leczenie wytworzyły się przeciwciała reaktywne przeciw szczytom WT stabilizowanym 6P w większym stopniu niż szczytowe WT stabilizowane 2P, 6–11-krotnie (Figura 5J), co wskazuje, że główne epitopy antygenowe były lepiej eksponowane lub stabilizowane na antygenie stabilizowanym 6P. Używając tych samych próbek, osoby z wysoką i umiarkowaną odpowiedzią miały również niższe miano przeciwciał przeciwko BA.1-2P niż BA.1-6P, 4–5-krotnie (ryc. 5K). Warto zauważyć, że u osób o niskiej odpowiedzi zaobserwowano mniejszą czterokrotną zmianę reaktywności wiązania w przypadku skoku BA.1 Omicron-2P i 6P (2-krotna redukcja) w porównaniu z WT-2skokiem P i 6P ({ {28}}krotna redukcja) (Figura 5, J i K), co sugeruje, że przeciwciała w surowicy przeciwko epitopom reagującym z Omikronem BA.1 mogą być bardziej ograniczone u pacjentów słabo reagujących. Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że istnieje ulepszone wiązanie poliklonalne indukowane przez naturalną infekcję do kolca stabilizowanego 6P, zarówno w przypadku wirusów WT, jak i Omicron.

Przeciwciała podobne do S728–1157 są optymalnie indukowane w kontekście odporności hybrydowej. Pierwotne zakażenie SARS-CoV-2 bez szczepienia stało się rzadkością w obecnej sytuacji globalnej, a kilka badań wykazało, że odporność na SARS-CoV-2 różni się u osób z konkretną historią szczepień/infekcji. W rezultacie staraliśmy się następnie zbadać, które częste narażenie, poza zakażeniem WT samym wirusem SARS-CoV-2 przodków, skutecznie indukuje przeciwciała podobne do S728–1157 w osoczu od monowalentnych szczepionek na bazie mRNA, z lub bez wcześniejszej infekcja. Pozyskaliśmy niezbędne próbki biologiczne z kohorty badawczej Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARYŻ), która monitoruje pracowników służby zdrowia od początku pandemii (44). Wybraliśmy próbki osocza od w pełni uodpornionych (2 × zaszczepionych) uczestników badania z infekcją i bez infekcji, a także od uczestników wzmocnionych (3 × zaszczepionych) z infekcją i bez infekcji. Ponadto uwzględniliśmy również próbki od uczestników badania, którzy otrzymali dwuwartościową szczepionkę mRNA (przodek WA1/2020 plus Omicron BA.5) (ryc. 6A i tabela uzupełniająca 2). Przełomowe infekcje u uczestników, którzy otrzymali szczepionki przypominające, miały miejsce w czasie, gdy linie rodowe Omicron wyparły wszystkie inne linie SARS-CoV-2 w obszarze metropolitalnym Nowego Jorku. Stwierdziliśmy, że osoby dwukrotnie zaszczepione miały najniższe miano przeciwciał konkurencyjnych przeciwko S728-1157 w surowicy spośród 5 grup badanych próbek (ryc. 6B). Warto zauważyć, że poziomy te były podobne do obserwowanych w naszej kohorcie nieszczepionej w okresie rekonwalescencji (wszyscy, którzy odpowiedzieli na leczenie; Ryc. 5B). Dla porównania, osoby z naturalną infekcją w wywiadzie, w tym osoby rekonwalescencji, które otrzymały 2 z 3 dawek szczepionki oraz osoby, które przeszły infekcję przełomową i otrzymały dwuważną dawkę przypominającą, wykazywały znacząco wyższy poziom wywoływania S728-1157 w porównaniu z osobami niezakażonymi. ale zaszczepione osoby (ryc. 6B). Chociaż niezainfekowana 3-grupa dawki wykazywała jedynie nieistotny wzrost w porównaniu z grupą 2-dawki, podział na pary według rodzaju szczepionki wskazał, że homologiczne trzecie dawki BNT162b2 i mRNA-1273 znacząco zwiększyły S{{ 38}}podobnie jak miano przeciwciał neutralizujących odpowiednio o 2,72 × i 2,85 × (ryc. 6, C i D). Należy zauważyć, że wśród uczestników, którzy w jakikolwiek sposób mieli 3 styczność ze szpicem, miano przeciwciał S728-1157-podobnych było 3 razy wyższe u osób, które wróciły do ​​zdrowia po podwójnym szczepieniu w porównaniu z osobami, które wcześniej nie zaszczepiły się potrójnie, co sugeruje, że SARS-CoV{{ 51}} infekcja w sposób bardziej optymalny indukuje ten klonotyp. Wśród grup odporności hybrydowej zaobserwowaliśmy, że większość osób otrzymujących dawkę przypominającą, u których doszło do przełomu i które otrzymały dawkę biwalentnej szczepionki przypominającej, miała jedynie nieznacznie wyższe miano przeciwciał S728-1157 w porównaniu z grupami zaszczepionymi przed rekonwalescencją przed omikronem, co sugeruje, że grupa S{{53 }} miano prawdopodobnie zbliżało się do plateau po 3 ekspozycjach. Zbadaliśmy także miana przeciwciał poliklonalnych, które konkurowały z CC12.3 i CR3022 oprócz S728-1157. U wszystkich osób wykazano stosunkowo wysokie miano przeciwciał CC12.3- i CR3022-podobnych, niezależnie od liczby i rodzaju ekspozycji (rysunek uzupełniający 5), w przeciwieństwie do tego, co zaobserwowaliśmy dla S728-1157- jak przeciwciała. Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że zakażenie SARS-CoV-2 i szczepienie mRNA przyczyniają się do indukcji przeciwciał S728-1157-podobnych, przy czym infekcja odgrywa bardziej dominującą rolę u zaszczepionych osób.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Na koniec, porównując odpowiedzi przeciwko wzrostowi stabilizowanemu 2P i 6P w kohorcie szczepienia mRNA, odkryliśmy, że większość grup wywołała podobny poziom przeciwciał przeciwko obu konstruktom. Wyjątkiem była niezainfekowana grupa potrójnie zaszczepiona, która wykazała statystycznie wyższą, choć tylko nieznacznie zwiększoną, reaktywność na 2P w porównaniu ze szczytem stabilizowanym 6P (Figura 6E). Dane te sugerują, że w przeciwieństwie do naturalnej infekcji (ryc. 5, J i K), samo szczepienie wywołuje odpowiedź poliklonalną, która jest bardziej ograniczona do epitopów w konstrukcie Spike-2P, zgodnie z konstruktem Spike{{12 }}P formuła obecnych szczepionek. Ostatecznie odkrycia te potwierdzają pogląd, że stabilizacja 6P przyszłych szczepionek SARS-CoV-2 może przynieść ogromne korzyści w indukowaniu klonotypów przeciwciał o szerokim zakresie ochronnym, takich jak S728-1157.

Rycina 5. Konkurencja przeciwciał w surowicy po rekonwalescencji z szeroko neutralizującymi mAb reaktywnymi wobec RBD i porównanie odpowiedzi przeciwciał w surowicy przeciwko kolcom stabilizowanym 6P i 2P

Figura 6. Konkurencja przeciwciał surowiczych szczepionych mRNA z mAb neutralizującymi S728-1157 neutralizującymi RBD i porównanie odpowiedzi przeciwciał surowiczych wobec impulsów stabilizowanych 6P i 2P.

Dyskusja

W tym badaniu identyfikujemy silny bnAb wyizolowany z komórki B pamięci osoby, która wyzdrowiała z zakażenia SARS-CoV-2 podczas pierwszej fali pandemii COVID-19. Ten bnAb, S728- 1157, zachował znaczną reaktywność wiązania i wykazywał stałą aktywność neutralizującą wobec wszystkich testowanych LZO SARS-CoV-2, w tym Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 i XBB i był w stanie znacznie zmniejszyć miano wirusa zakaźnego po zakażeniu chomików Delta i BA.1.

Odkryliśmy, że surowica rekonwalescencji z naszej kohorty zawierała niskie stężenia przeciwciał, które konkurują z mAb z epitopem S728-1157 (klasa 1/RBS-A) i epitopem klasy 2. Sugeruje to, że S728-1157 różni się nieco od innych przeciwciał ukierunkowanych na epitopy klasy 1 i jest rzadko indukowany w puli komórek B pamięci specyficznych dla RBD. Zamiast tego wydawało się, że nasza naturalna kohorta infekcji indukuje przeciwciała skierowane przeciwko epitopowi CR3022 (klasa 4); przeciwciała o tej specyficzności są często reaktywne krzyżowo, ale słabiej neutralizują niż przeciwciała skierowane przeciwko RBS (14, 17). Dane te uzupełniają nasze wcześniejsze ustalenia, które wykazały, że obfitość przeciwciał klasy 3/S309 w surowicach rekonwalescencji może przyczyniać się do działania neutralizującego wobec wariantów Alpha i Gamma, podczas gdy brak przeciwciał klasy 2 może odpowiadać za zmniejszoną zdolność neutralizacji przeciwko Delta (15). . Niezależnie od tego, według doniesień zakres aktywności większości przeciwciał skierowanych przeciwko RBS (RBS-A/klasa 1, RBS-B, C/klasa 2 i RBS-D, S309/klasa 3) przeciwko wariantom Omicron jest wysoce ograniczony (11, 40, 45).

Kluczowym wyzwaniem w przyszłości będzie określenie, w jaki sposób poprawić wywoływanie przeciwciał o szerokiej reaktywności krzyżowej wobec konserwatywnych epitopów RBS. W tym względzie zaobserwowaliśmy tutaj, że osoby z odpornością hybrydową wykazywały znacznie wyższe miano przeciwciał S728-1157-podobnych niż osoby zaszczepione bez wcześniejszej infekcji. Co ważne, zjawisko to zaobserwowano nawet wtedy, gdy kontrolowano liczbę narażenia (tj. u rekonwalescentów podwójnie zaszczepionych w porównaniu z niezakażonymi potrójnymi szczepionkami), co sugeruje, że jakiś element odporności związanej z infekcją (lub skład szczepionki, który może naśladować ten typ odporności) jest ważne dla wywołania tego klonotypu. Jest to zgodne z dowodami eksperymentalnymi dokumentującymi, że osoby z odpornością hybrydową mają szerszy profil reaktywności przeciwciał w porównaniu z osobami, które mają odpowiedź immunologiczną jedynie wywołaną szczepieniem lub pierwotną infekcją (9).

Niniejsze struktury ilustrują, że S728-1157 wiąże epitop RBS-A/klasa 1 w RBD o konformacji up. Epitop ten wydaje się być łatwiej dostępny na kolcach stabilizowanych 6P, które, jak doniesiono, prezentują 2 RBD na północy stanu, w porównaniu z kolcami 2P, które prezentują tylko 1 (30, 33, 46, 47) i wobec których nasze przeciwciała specyficzne dla skoku uformowania w górę wykazują ulepszone wiązanie. S728-1157 wyizolowano po naturalnej infekcji; w takich kontekstach prawdopodobieństwo indukcji klonów podobnych do S728-1157 jest prawdopodobnie większe, biorąc pod uwagę, że RBD musi być w stanie przyjąć konformację up, nawet przejściowo, aby związać się z ACE2, odsłaniając w ten sposób ten epitop. W przeciwieństwie do większości przeciwciał IGHV3-53/3-66 RBS-A/klasy 1, S728-1157 może pomieścić kluczowe mutacje w skokach VOC dzięki rozległym interakcjom między CDR-H3 i RBD (29, 48–50). S728-1157 wykorzystuje także inny łańcuch lekki (IGLV3-9) w porównaniu z innymi mniej powszechnymi przeciwciałami, takimi jak CC12.3 (IGKV3-20), co może wpływać na ogólne interakcje wiązania; jednakże nasza analiza wskazuje, że między łańcuchem lekkim S728-1157 a RBD jest mniej wiązań wodorowych w porównaniu z CC12.3 (tabela uzupełniająca 7). Chociaż większość reszt kontaktowych CDR-H3 krytycznych dla reaktywności krzyżowej LZO w tej interakcji jest kodowana w linii zarodkowej i nie jest wprowadzana przez mutacje somatyczne, kilka zmutowanych somatycznie reszt w regionach zrębowych lub CDR-H1, CDR-H2 i CDR-L1 jest zaangażowane w interakcję z SARS-CoV-2 RBD. Z jednej strony sugeruje to, że komórki B pamięci kodujące przeciwciała klasy IGHV3-53/66 mogą uzyskać podobny stopień reaktywności krzyżowej w wyniku dalszego dojrzewania powinowactwa. Z drugiej strony wskazuje to również na możliwość zaprojektowania immunogenów ukierunkowanych na linię zarodkową, które atakują naiwne komórki B podobne do S. Chociaż zaprojektowanie szczepionek, które mogą specyficznie wywoływać przeciwciała podobne do S728-1157 z wybranymi CDR-H3 zdolnymi do przezwyciężenia mutacji VOC, może być wyzwaniem, zachęcające jest to, że ograniczenie genu IGHV obserwuje się w przypadku innych silnych SARS-CoV{ {58}} badania neutralizujących mAb (13, 15, 20–27). Alternatywnie może to być również wykonalne poprzez iteracyjną immunizację zoptymalizowanymi immunogenami RBD, jak opisano wcześniej w przypadku innych patogenów (51–55).

Chociaż zaobserwowano wiele mutacji w miejscu antygenowym RBS-A/klasa 1 (18), w odniesieniu do epitopu S728-1157, 13 z 15 wszystkich reszt kontaktowych RBD i 2 z 3 CDR-H{{9} }związane pozostałości kontaktowe RBD są konserwowane w Omicron i wszystkich innych LZO. Sugeruje to, że region RBD, w którym znaleziono epitop S728-1157, może zawierać reszty krytyczne dla jego funkcji dynamicznej i sprawności wirusa, a zatem byłby mniej tolerancyjny na mutacje i dryf antygenowy niż otaczające reszty miejsca RBS-A/klasa 1. W takim przypadku należy zmniejszyć tendencję do utraty tego konkretnego epitopu w miarę ewolucji wariantów wirusa, co sprawi, że charakterystyka S728-1157 i podobnych przeciwciał i epitopów będzie ważna dla szczepionek opornych na warianty lub rozwoju terapii mAb. Podsumowując, nasze badanie identyfikuje bnAb, które mogą pomóc w projektowaniu immunogenów w szczepionkach przeciwko wirusowi nowej generacji odpornych na warianty lub służyć jako leki mAb odporne na ewolucję SARS CoV-2. W szczególności, jeśli chodzi o łączną moc i zakres, S728-1157 wydaje się być najlepszym w swojej klasie wyizolowanym do tej pory przeciwciałem. Biorąc pod uwagę, że przeciwciało to wiąże się łatwiej w przypadku stabilizacji 6P, przewiduje się, że będzie preferencyjnie indukowane przez rekombinowane białka kolców stabilizowane 6P lub cały wirus, co sugeruje, że modyfikacja heksaproliny może przynieść korzyści przyszłym konstruktom szczepionek w celu optymalnej ochrony przed przyszłym SARS-CoV -2 warianty i inne arbowirusy.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Metody

Izolacja przeciwciał monoklonalnych. PBMC wyizolowano z filtrów leukoredukcyjnych i zamrożono, jak opisano wcześniej (24). Komórki B wzbogacono z PBMC za pomocą FACS. Komórki barwiono CD19, CD3 i sondami antygenowymi skoniugowanymi z oligofluoroforem; komórki będące przedmiotem zainteresowania zidentyfikowano jako CD3– CD19+ Antigen+. Wszystkie mAb wygenerowano ze znakowanych oligo komórek posortowanych za pomocą przynęty antygenowej, zidentyfikowanych za pomocą jednokomórkowej sekwencji RNA-Seq, jak opisano wcześniej (15, 24). Dane dotyczące pojedynczych komórek B wygenerowane w tym badaniu zostały zdeponowane w Gene Expression Omnibus: GSE171703 i GSM5231088 – GSM5231123.

Wyselekcjonowano komórki B specyficzne dla antygenu w celu wytworzenia mAb w oparciu o intensywność sondy antygenowej analizowaną za pomocą JMP Pro 15. Geny łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciał syntetyzowano za pomocą Integrated DNA Technologies (IDT) i klonowano do ludzkiej IgG1 oraz ludzkiego łańcucha lekkiego κ lub λ wektory ekspresyjne według zestawu Gibsona, jak opisano wcześniej (56). Łańcuchy ciężkie i lekkie odpowiedniego mAb przejściowo kotransfekowano do komórek HEK293T (ATCC). Po transfekcji przez 18 godzin, transfekowane komórki uzupełniono supernatantem pożywki wolnej od białka hybrydomy (PFHM-II, Gibco). Supernatant zawierający wydzielane mAb zebrano w dniu 4 i oczyszczono przy użyciu kulek agarozowych z białkiem A (Thermo Fisher Scientific), jak szczegółowo opisano wcześniej (56). Sekwencje łańcuchów ciężkich i lekkich dobrze scharakteryzowanych przeciwciał uzyskano z Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (ID PDB: 7KMG), CR3022 (ID PDB: 6W7Y) i REGN1{{ 125}}933 (ID PDB: 6XDG) i zsyntetyzowano jak opisano powyżej. mAb CC12.3 (ID PDB: 6XC4) dostarczyła Meng Yuan z Instytutu Badawczego Scripps (San Diego, Kalifornia, USA). Ekspresja rekombinowanego białka kolczastego. Rekombinowany kolec D614G SARS-CoV-2 pełnej długości (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, pojedyncze mutanty RBD (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A i Y505F), kombinacja mutanta RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD i MERS-CoV RBD zostały wygenerowane wewnętrznie. W skrócie, rekombinowane antygeny wyrażano przy użyciu komórek Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Gen będący przedmiotem zainteresowania wklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego (własnie zmodyfikowany AbVec) i transfekowano przy użyciu zestawu ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) zgodnie z protokołem producenta. Supernatant zebrano 4 dnia po transfekcji i inkubowano z agarozą kwasu Ni-nitrylotrioctowego (Ni-NTA) (Qiagen). Oczyszczanie przeprowadzono przy użyciu kolumny z przepływem grawitacyjnym i eluowano buforem zawierającym imidazol, jak opisano wcześniej (57, 58). Eluat buforowano i wymieniano PBS przy użyciu jednostki wirówkowej Amicon (Millipore). Rekombinowane kolce FL stabilizowały mutacje 2P wariantów B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 i BA.4 Omicron i były wyprodukowane w Sather Laboratory w Seattle Children's Research Institute. RBD K417V, N439K i E484K oraz rekombinowany kolec FL WT-2P i 6P wyprodukowano w laboratorium Krammer w Icahn School of Medicine w Mount Sinai. SARS-CoV-2-6P-Mut7 i kolec BA.1-6P zostały zaprojektowane i wyprodukowane zgodnie z opisem w poprzednim badaniu (59). Sekwencje białkowe i zasoby dla każdego antygenu wymieniono w tabeli uzupełniającej 4. ELISA. Rekombinowanymi białkami spike/RBD SARS-CoV-2 naniesiono na płytki mikrotitracyjne o wysokim stopniu wiązania białek (Costar) w stężeniu 2 µg/ml w PBS w ilości 50 µl/studzienkę i trzymano przez noc w temperaturze 4°C. Płytki przemywano PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBS-T) i blokowano 150 µl PBS zawierającym 20% FBS przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Przeciwciała monoklonalne rozcieńczano seryjnie 3-krotnie, zaczynając od 10 ug/ml w PBS i inkubowano w dołkach przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie płytki przemywano i inkubowano ze skoniugowanym z HRP kozim przeciwciałem anty-ludzkim IgG (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po przemyciu dodano 100 µl substratu Super AquaBlue ELISA (eBioscience) na dołek. Absorbancję mierzono przy 405 nm na spektrofotometrze mikropłytkowym (Bio-Rad). Testy standaryzowano przy użyciu przeciwciała kontrolnego S144-509 (15), o znanej charakterystyce wiązania na każdej płytce, a płytki wywoływano do momentu, gdy absorbancja kontroli osiągnęła OD wynoszącą 3,0. Wszystkie mAb testowano dwukrotnie, a każde doświadczenie przeprowadzono dwukrotnie.

ELISA w surowicy. Płytki do mikromiareczkowania o wysokim stopniu wiązania białek pokryto rekombinowanymi antygenami kolczastymi SARS-CoV-2 w stężeniu 2 µg/ml w PBS przez noc w temperaturze 4°C. Płytki przemyto PBS 0.05% Tween i zablokowano 200 µl PBS 0.1% Tween + 3% odtłuszczone mleko w proszku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Próbki osocza inaktywowano termicznie przez 1 godzinę w temperaturze 56 stopni przed wykonaniem eksperymentu serologicznego. Osocze rozcieńczono seryjnie 2-krotnie w PBS 0,1% Tween + 1% odtłuszczonego mleka w proszku. Płytki inkubowano z rozcieńczeniami surowicy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wykrycia wiązania przeciwciał użyto sprzężonego z HRP koziego przeciwciała przeciw ludzkiej Ig rozcieńczonego w stosunku 1:3000 PBS 0,1% Tween + 1% odtłuszczonego mleka w proszku. Po 1 godzinie inkubacji płytki wywoływano za pomocą 100 µl roztworu SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) przez 10 minut. Następnie zastosowano 50 µl 3M HCl w celu zatrzymania reakcji wywoływania. Absorbancję mierzono przy 490 nm na spektrofotometrze mikropłytkowym (Bio-Rad). Miana punktów końcowych ekstrapolowano z sigmoidalnej krzywej standardowej 4PL (gdzie x oznacza log stężenie) dla każdej próbki. Granicę wykrywalności (LOD) definiuje się jako średnią + 3 SD sygnału OD zarejestrowanego przy użyciu osocza od osób przed SARS-CoV-2. Wszystkie obliczenia wykonano w programie GraphPad Prism (wersja 9.0).

Konkurs ELISA. Aby określić klasyfikację docelowych epitopów mAb reaktywnych wobec RBD, przeprowadzono konkurencyjne testy ELISA, stosując inne mAb o znanej charakterystyce wiązania epitopu jako mAb konkurencyjne. Konkurencyjne mAb biotynylowano przy użyciu EZ-Link sulfo-NHS-biotyny (Thermo Fisher Scientific) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nadmiar biotyny z biotynylowanych mAb usunięto za pomocą kolumn do odsalania wirowego Zeba (Thermo Fisher Scientific) z wartością odcięcia masy cząsteczkowej 7 k (MWCO). Płytki pokryto 2 µg/ml antygenu RBD przez noc w temperaturze 4°C. Płytki blokowano PBS–20% FBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i dodawano 2--krotne rozcieńczenie mAb nieokreślonej klasy lub surowicy, zaczynając od 20 ug/ml mAb i rozcieńczenie surowicy 1:10. Po inkubacji przeciwciała przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dodano biotynylowane konkurencyjne mAb w stężeniu dwukrotnie większym od jego stałej dysocjacji (KD) i inkubowano przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej razem z wcześniej dodanym mAb lub surowicą. Płytki przemywano i inkubowano ze 100 µl streptawidyny skoniugowanej z HRP (Southern Biotech) w rozcieńczeniu 1:1000 przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni. Płytki opracowano z użyciem podłoża Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Aby znormalizować testy, do studzienki dodano konkurencyjne biotynylowane mAb bez żadnych konkurujących mAb lub surowicy jako kontroli. Dane rejestrowano, gdy absorbancja dołka kontrolnego osiągnęła OD 1,0–1,5. Następnie obliczono procent konkurencji między mAb, dzieląc zaobserwowaną OD próbki przez OD osiągniętą przez kontrolę pozytywną, odejmując tę ​​wartość od 1 i mnożąc przez 100. W przypadku surowicy OD przekształcono log10 i analizowano metodą regresji nieliniowej w celu określenia 50 Wartości % stężenia hamowania (IC50) przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism (wersja 9.0). Dane przekształcono w Log1P i wykreślono na wykresie przedstawiającym wzajemne rozcieńczenie surowicy IC50 rozcieńczenia surowicy, które może osiągnąć 50% współzawodnictwo z interesującym konkurencyjnym mAb. Wszystkie mAb testowano w dwóch powtórzeniach, każdy eksperyment przeprowadzono niezależnie 2 razy, a wartości z 2 niezależnych eksperymentów uśredniono.

Testy płytkowe. Testy łysinkowe przeprowadzono z wariantami wirusów SARS-CoV-2 na komórkach Vero E6/TMPRSS2 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (tabela uzupełniająca 5). Komórki hodowano do osiągnięcia 90% konfluencji, po czym trypsynizowano i zaszczepiano przy gęstości 3 x 104 komórek/studzienkę na płytkach 96-studzienkowych. Następnego dnia 102 PFU wariantu SARS-CoV-2 inkubowano z 2-krotnie rozcieńczonymi mAb przez 1 godzinę. Mieszaninę przeciwciało-wirus inkubowano z komórkami Vero E6/TMPRSS2 przez 3 dni w temperaturze 37°C. Płytki utrwalono 20% metanolem, a następnie zabarwiono roztworem fioletu krystalicznego. Całkowite stężenia hamujące (IC99) obliczono przy użyciu log(inhibitora) w funkcji znormalizowanej odpowiedzi (zmienne nachylenie), wykonanej w programie GraphPad Prism (wersja 9.0). Wszystkie mAb testowano dwukrotnie, a każde doświadczenie przeprowadzono dwukrotnie. Test neutralizacji redukcji ostrości. Do określenia aktywności neutralizacji wykorzystano testy neutralizacji redukcji ogniskowej (FRNT) jako dodatkową platformę oprócz testu płytki nazębnej. Seryjne rozcieńczenia surowicy, począwszy od końcowego stężenia 1:20, zmieszano ze 103 jednostkami wirusa tworzącymi ognisko na studzienkę i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Zbiorcza próbka surowicy sprzed pandemii służyła jako kontrola. Mieszaniną przeciwciało-wirus zaszczepiono komórki Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) w 96-studzienkowych płytkach i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Do każdej studzienki dodano równą objętość roztworu metylocelulozy. Komórki inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni, a następnie utrwalono formaliną. Po usunięciu formaliny komórki barwiono immunologicznie mysim mAb przeciwko SARS-CoV-1/2 nukleoproteina [klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], a następnie kozią antymysią immunoglobuliną znakowaną HRP (Sigma- Aldricha; A8924). Zakażone komórki barwiono substratem TrueBlue (SeraCare Life Sciences), a następnie przemywano wodą destylowaną. Po wysuszeniu liczbę ognisk określono ilościowo przy użyciu analizatora ImmunoSpot S6, oprogramowania ImmunoCapture i oprogramowania BioSpot (Technologia komórkowa). IC50 obliczono z interpolowanej wartości z log(inhibitora) w porównaniu ze znormalizowaną odpowiedzią, stosując regresję nieliniową o zmiennym nachyleniu (4 parametry) przeprowadzoną w programie GraphPad Prism (wersja 9.0).

Bibliografia

1. Hou YJ i in. Wariant SARS-CoV-2 D614G wykazuje wydajną replikację ex vivo i transmisję in vivo. Nauka. 2020;370(6523):1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF i in. Wiele wariantów SARS CoV-2 unika neutralizacji przez odporność humoralną wywołaną szczepionką. Komórka. 2021;184(9):2523.

3. Wall EC i in. Neutralizujące działanie przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2 LZO B.1.617.2 i B.1.351 przez szczepienie BNT162b2. Lancet. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Edara VV i in. Zakażenie i wywołana szczepionką odpowiedź przeciwciał neutralizujących na warianty SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.

5. Zhou D i in. Dowody na ucieczkę wariantu B.1.351 wirusa SARS-CoV-2 B.1.351 z surowicy naturalnej i wywołanej szczepionką. Komórka. 2021;184(9):2348–2361.

6. Weisblum Y. i in. Ucieczka przed przeciwciałami neutralizującymi dzięki wariantom białka kolczastego SARS-CoV-2. Elifa. 2020;9:e61312.

7. Graham F. Codzienna odprawa: Wariant wirusa Omicron stawia naukowców w pogotowiu. Natura. 2021;.

8. Karim SSA, Karim QA. Wariant Omicron SARS-CoV-2: nowy rozdział w pandemii COVID-19. Lancet. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM i in. Aktywność surowicy rekonwalescencyjnej i szczepionki przeciwko SARS-CoV-2 Omicron. Natura. 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q i in. Alarmujące właściwości unikania przeciwciał rosnących podwariantów SARS-CoV-2 BQ i XBB. Komórka. 2022;186(2):279–286.

11. VanBlargan LA i in. Zakaźny wirus SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron unika neutralizacji przez terapeutyczne przeciwciała monoklonalne. Nat Med. 2022;28(3):490–495.

12. Takashita E i in. Skuteczność przeciwciał i leków przeciwwirusowych przeciwko Covid-19 Wariant Omicron. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Yuan M. i in. Rozpoznanie domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 przez przeciwciała neutralizujące. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.

14. Barnes CO i in. Struktury przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 stanowią podstawę strategii terapeutycznych. Natura. 2020;588(7839):682–687.

15. Changrob S i in. Neutralizacja krzyżowa pojawiających się wariantów SARS-CoV-2 budzących obawy przez przeciwciała skierowane przeciwko różnym epitopom na szczycie. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ i in. Ciężkość zakażenia SARS-CoV-2 jest powiązana z lepszą odpornością humoralną na szczyt. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ i in. Mapowanie mutacji w RBD SARS-CoV-2, które wymykają się wiązaniu przez różne klasy przeciwciał. Nat Commun. 2021;12(1):4196.

18. Liu H., Wilson IA. Ochronne epitopy neutralizujące w SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.

19. Jette CA i in. Szeroka reaktywność krzyżowa pomiędzy arbowirusami wykazywana przez podzbiór przeciwciał neutralizujących pochodzących od dawcy wirusa COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM i in. Silne przeciwciała neutralizujące pochodzące od pacjentów z COVID-19 definiują wiele celów podatności. Nauka. 2020;369(6504):643–650.

21. Pinto D i in. Neutralizacja krzyżowa SARS CoV-2 przez ludzkie przeciwciało monoklonalne SARS-CoV. Natura. 2020;583(7815):290–295.

22. Robbiani DF i in. Zbieżna odpowiedź przeciwciał na SARS-CoV-2 u osób rekonwalescencji. Natura. 2020;584(7821):437–442.

23. Yuan M i in. Strukturalne podstawy wspólnej odpowiedzi przeciwciał na SARS-CoV-2. Nauka. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL i in. Profilowanie immunodominacji komórek B po zakażeniu SARS-CoV-2 ujawnia ewolucję przeciwciał w kierunku nieneutralizujących celów wirusowych. Odporność. 2021;54(6):1290–1303.

25. Rogers TF i in. Izolacja silnych przeciwciał neutralizujących SARS CoV-2 i ochrona przed chorobami na małym modelu zwierzęcym. Nauka. 2020;369(6506):956–963.

26. Schmitz AJ i in. Przeciwciało publiczne indukowane szczepionką chroni przed SARS-CoV-2 i pojawiającymi się jego wariantami. Odporność. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. Shi R i in. Ludzkie przeciwciało neutralizujące celuje w miejsce wiązania receptora SARS-CoV-2. Natura. 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y i in. Silne przeciwciała neutralizujące przeciwko SARS-CoV-2 zidentyfikowane poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie pojedynczych komórek komórek B rekonwalescencji pacjentów. Komórka. 2020;182(1):73–84.

29. Barnes CO i in. Struktury ludzkich przeciwciał związanych ze szczytem SARS-CoV-2 ujawniają wspólne epitopy i powtarzające się cechy przeciwciał. Komórka. 2020;182(4):828–842.

30. Corbett KS i in. Projekt szczepionki mRNA SARS-CoV-2 umożliwił przygotowanie prototypu patogenu. Natura. 2020;586(7830):567–571.

31. Amanat F i in. Wprowadzenie dwóch prolin i usunięcie wielozasadowego miejsca rozszczepienia doprowadziło do wyższej skuteczności rekombinowanej szczepionki SARS-CoV-2 opartej na kolcach w modelu mysim. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W. i in. Wirus rzekomego pomoru drobiu wykazujący ekspresję stabilizowanego białka kolczastego SARS-CoV-2 indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną. Nat Commun. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL i in. Projekt oparty na strukturze stabilizowanych wstępnie fuzją kolców SARS-CoV-2. Nauka. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM i in. Strukturalne zróżnicowanie skoku SARS-CoV-2 Omikrona. Komórka Mol. 2022;82(11):2050–2068.

35. Yuan M i in. Wysoce konserwatywny tajemniczy epitop w domenach wiążących receptory SARS-CoV-2 i SARS-CoV. Nauka. 2020;368(6491):630–633.

36. Starr TN i in. Pełna mapa mutacji RBD SARS-CoV-2, które wymykają się przeciwciału monoklonalnemu LY-CoV555 i jego koktajlowi z LY-CoV016. Przedstawiciel komórkowy Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A i in. Przeciwciała REGN-COV2 zapobiegają i leczą infekcję SARS-CoV-2 u makaków rezusów i chomików. Nauka. 2020;370(6520):1110–1115.

38. Wu NC i in. Alternatywny sposób wiązania przeciwciał IGHV3-53 z domeną wiążącą receptora SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y i in. Niekonkurencyjna para ludzkich przeciwciał neutralizujących blokuje wiązanie wirusa COVID-19 z jego receptorem ACE2. Nauka. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Yuan M i in. Strukturalne i funkcjonalne konsekwencje dryfu antygenowego w najnowszych wariantach SARS-CoV-2. Nauka. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q i in. Przeciwciała neutralizujące3-53-kodowane przez germinalną IGHV, ukierunkowane na RBD, są powszechnie obecne w repertuarze przeciwciał pacjentów z COVID-19. Pojawiające się mikroby infekują. 2021;10(1):1097–1111.

42. Zhang Q i in. Silne i ochronne przeciwciała IGHV3- 53/3-66 publiczne i ich wspólny mutant uciekający w szczytowym momencie SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021;12(1):4210.

43. Wang Z i in. Przeciwciała przeciwko SARS-CoV-2 i krążącym wariantom wywołane szczepionką mRNA. Natura. 2021;592(7855):616–622.

44. Simon V i in. PARYŻ i SPARTA: znalezienie pięty achillesowej SARS-CoV-2. mSfera. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN i in. Przeciwciała SARS-CoV-2 RBD, które maksymalizują zasięg i odporność na ucieczkę. Natura. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Walls AC i in. Struktura, funkcja i antygenowość glikoproteiny szczytowej SARS-CoV-2. Komórka. 2020;181(2):281–292.

47. Henderson R i in. Kontrolowanie konformacji glikoproteiny szczytowej SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.

48. Shrestha LB i in. Szeroko neutralizujące przeciwciała przeciwko pojawiającym się-2 wariantom SARS-CoV. Przedni immunol. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ i in. Przeciwciała powstałe w wyniku szczepienia mRNA-1273 wiążą się szerzej z domeną wiążącą receptor niż te powstałe w wyniku zakażenia SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM i in. Zakażenie wariantem beta wirusa SARS-CoV-2 wywołuje silne przeciwciała specyficzne dla danej linii i reagujące krzyżowo. Nauka. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J. i in. W odpowiedzi ludzkich komórek B na zakażenie wirusem grypy pandemicznej H1N1 z 2009 r. dominują przeciwciała o szerokiej reaktywności krzyżowej. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.

52. Guthmiller JJ i in. Pierwsza ekspozycja na wywołane pandemią wirusy H1N1, szeroko neutralizujące przeciwciała skierowane przeciwko epitopom głowy hemaglutyniny. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G i in. Inżynieria antygenów grypy koncentruje się na odpowiedziach immunologicznych na subdominujący, ale zasadniczo ochronny epitop wirusa. Mikrob gospodarz komórkowy. 2019;25(6):827–835.

54. Nachbagauer R i in. W randomizowanym badaniu I fazy kontrolowanym placebo, uniwersalna szczepionka przeciwko wirusowi grypy oparta na chimerycznej hemaglutyninie indukuje szeroką i długotrwałą odporność. Nat Med. 2021;27(1):106–114.

55. Angeletti D i in. Oskrzydlająca immunodominacja w celu ukierunkowania na subdominujące epitopy szeroko neutralizujące. Proc Natl Acad Sci USA A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ i in. Skuteczna metoda wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z ludzkich komórek B. Metody Mol Biol. 2019;1904:109–145.

57. Amanat F. i in. Test serologiczny służący do wykrywania serokonwersji SARS-CoV-2 u ludzi. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.

58. Stadlbauer D i in. Serokonwersja SARS-CoV-2 u ludzi: szczegółowy protokół testu serologicznego, produkcji antygenu i konfiguracji testu. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL i in. Strukturalne spostrzeżenia na temat bardzo silnego, panneutralizującego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C i in. Zautomatyzowana mikroskopia molekularna: nowy system Leginon. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.

61. Lander GC i in. Appion: zintegrowany potok oparty na bazie danych ułatwiający przetwarzanie obrazów EM. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.

62. Voss NR i in. DoG Picker i TiltPicker: narzędzia programowe ułatwiające selekcję cząstek w mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.

63. Pettersen EF i in. UCSF Chimera--system wizualizacji do badań eksploracyjnych i analiz. J. Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.

64. Punjani A i in. Niejednorodne udoskonalenie: adaptacyjna regularyzacja poprawia rekonstrukcję krio-EM z pojedynczą cząstką. Metody Nata. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: Wyznaczanie i korekcja CTF w czasie rzeczywistym. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. Zivanov J i in. Nowe narzędzia do automatycznego określania struktury Cryo-EM w wysokiej rozdzielczości w RELION-3. Elifa. 2018;7:e42166.

67. Casanal A i in. Aktualne osiągnięcia w łysce do budowania modeli makromolekularnych z kriomikroskopii elektronowej i danych krystalograficznych. Nauka o białku. 2020;29(4):1069–1078.

68. Frenz B. i in. Automatyczne naprawianie błędów w strukturach glikoproteinowych za pomocą Rosetty. Struktura. 2019;27(1):134–139.

69. Klaholz BP. Wyprowadzanie i udoskonalanie modeli atomowych w krystalografii i Cryo-EM: najnowsze narzędzia Phenix ułatwiające analizę struktury. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pkt 10):878–881.

70. Pettersen EF i in. UCSF ChimeraX: wizualizacja struktury dla badaczy, nauczycieli i programistów. Nauka o białku. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Przetwarzanie danych dyfrakcji rentgenowskiej zebranych w trybie oscylacyjnym. Metody Enzymol. 1997;276:307–326.

72. McCoy AJ i in. Oprogramowanie krystalograficzne Phaser. J Appl Crystallogr. 2007;40(pkt 4):658–674.

73. Qiang M. i in. Przeciwciała neutralizujące przeciwko SARS CoV-2 zostały wybrane z biblioteki ludzkich przeciwciał stworzonej kilkadziesiąt lat temu. Adw. Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: narzędzia do budowania modeli grafiki molekularnej. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60(pkt 12 pkt 1):2126–2132.

75. Adams PD i in. PHENIX: kompleksowy system oparty na Pythonie do rozwiązywania struktur makromolekularnych. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pkt 2):213–221.

76. Montiel-Garcia D i in. Epitope-Analyzer: oparte na strukturze narzędzie internetowe do analizy szeroko zakrojonych epitopów neutralizujących. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.