MikroRNA w rozwoju i chorobach nerek Ⅱ

Rozwój nerek

Thenerka ssaka(lub metanephros) to ważny narząd, który odgrywa kluczową rolę wwydalanie produktów przemiany materii,regulacja objętości płynu pozakomórkowego, Ikonserwacja elektrolituIhomeostaza kwasowo-zasadowa. Ponadto nerki wytwarzają ważne hormony, takie jakerytropoetyna, kalcytriol,renina, Iprostaglandyny(48). Wydajność funkcjonalna nerek koreluje z liczbą funkcjonujących nefronów, które powstają podczas rozwoju nerek przed urodzeniem, co nazywa się także wyposażeniem nefronów. Każda ludzka nerka zawiera średnio 1,000,000 nefronów, chociaż liczba ta znacznie się różni i szacunkowo waha się od 200,000 do 2,000,{{8 }} nefrony (49, 50). Zstarzenie się,utrata funkcjonalnej rezerwy nefronowejzachodzi z biegiem czasu (51, 52); dlatego też niski poziom wyposażenia nefronów przy urodzeniu wiąże się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju nadciśnienia i przewlekłej choroby nerek (CKD) w późniejszym życiu (53–55). Co więcej, CAKUT, prowadzący do zmniejszenia wyposażenia i czynności nefronów, jest główną przyczyną niewydolności nerek u dzieci, powodując znaczną zachorowalność i śmiertelność związaną z przeszczepami i dializami (56, 57). Zatem lepsze zrozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw ustalenia liczby nefronów i prawidłowego tworzenia się nefronów zapewnia wgląd w nowe możliwości przewidywania, zapobiegania i leczenia chorób nerek u dzieci.

JAK DŁUGO DZIAŁA CISTANCHE U PACJENTÓW Z CHOROBAMI NEREK?

Rozwój nerek metanerczowychrozpoczyna się około 10.5 dnia embrionalnego (E10.5) u myszy i około piątego tygodnia ciąży u ludzi (58). W odpowiedzi na sygnały indukcyjne z mezenchymu metanerkowego, zawiązek moczowodu rozciąga się od ogonowego końca przewodu Wolffa i wnika do sąsiedniego mezenchymu (ryc. 2). Jednocześnie morfogeny wydobywające się z zawiązka moczowodu indukują kondensację mezenchymu metanerkowego, tworząc mezenchym czapeczki (zwany także progenitorami nefronów) wokół końcówek zawiązka moczowodu. W miarę postępu nefrogenezy zawiązek moczowodu przechodzi kolejne rundy rozgałęziania, wydłużania i różnicowania, tworząc kanały zbiorcze nerki. Subpopulacja progenitorów nefronów przechodzi przemianę mezenchymalno-nabłonkową, tworząc pęcherzyki nerkowe, które po polaryzacji i wydłużeniu stają się strukturami ciała w kształcie przecinka i litery S. Wreszcie dystalna część trzonu w kształcie litery S łączy się z przewodem zbiorczym, tworząc funkcjonalny nefron (59–61). Ciało w kształcie litery S podlega dalszemu różnicowaniu, tworząc dojrzałe typy komórek nefronu, poza przewodem zbiorczym. Komórki progenitorowe zrębu Foxd1+ sąsiadują z progenitorami nefronów w zewnętrznej strefie korowej lub nefrogennej rozwijającej się nerki (ryc. 2) (62). Uważa się, że sygnały ze zrębu korowego hamują ekspansję komórek progenitorowych nefronów i stymulują ich różnicowanie, ponieważ ablacja zrębu nerki powoduje upośledzenie różnicowania progenitorów nefronów (63). Z komórek progenitorowych Foxd1+ powstają wszystkie komórki zrębowe nerki metanerkowej, w tym komórki śródmiąższowe kory i rdzenia nerki, perycyty, fibroblasty okołonaczyniowe, komórki mezangialne i komórki mięśni gładkich naczyń (64, 65). Zaburzenia na dowolnym etapie tego procesu mogą prowadzić do CAKUT, głównej przyczyny PChN u dzieci (66, 67).

Dojrzały nefron składa się z kłębuszka, który pełni rolę jednostki filtracyjnej, oraz tylnego przedziału sorpcyjnego, który jest podzielony na kanalik proksymalny, pętlę Henlego, kanalik dystalny i przewód zbiorczy (ryc. 2). Bariera filtracyjna kłębuszków (która obejmuje śródbłonek fenestrowany, błonę podstawną kłębuszków nerkowych, wyrostki stopy i przepony szczelinowe podocytów) umożliwia filtrację osocza i małych substancji rozpuszczonych, jednocześnie selektywnie zatrzymując we krwi białka, takie jak albuminy i immunoglobuliny (68, 69). Tymczasem rurowy przedział resorpcji jest odpowiedzialny za utrzymanie homeostazy wody, resorpcję substancji rozpuszczonych (w tym sodu, potasu, wapnia, fosforu, magnezu, glukozy i wielu innych) oraz wydalanie kwasów i innych odpadów.

MiRNA w rozwijającej się nerce

W badaniach na warunkowych myszach transgenicznych miRNA okazały się krytycznymi regulatorami morfogenezy nerek w wielu liniach komórkowych. We wstępnych badaniach oceniających funkcjonalną rolę miRNA w rozwoju nerek wykorzystano warunkową delecję Dicer (70) w różnych liniach nerek. Wiadomo jednak również, że Dicer pełni role niezależne od miRNA (71), co komplikuje interpretację tych modeli. Warunkowa delecja Dicer we wczesnym mezenchymie metanerkowym lub progenitorach nefronów skutkuje zwiększoną apoptozą progenitorów nefronów, podwyższonym poziomem proapoptotycznego białka Bim i przedwczesnym zaprzestaniem nefrogenezy (72–75) (Tabela 1). Co ciekawe, utrata ekspresji Bim w progenitorach nefronów z niedoborem Dicer zmniejsza apoptozę i częściowo przywraca tworzenie nefronów. Zidentyfikowano dwa miRNA ulegające ekspresji w progenitorach nefronów, miR-17 i miR-106, jako supresory ekspresji BIM (76). Łącznie odkrycia te wskazują, że miRNA kontrolują równowagę między przeżyciem a apoptozą w progenitorach nefronów, aby zapewnić tworzenie prawidłowej liczby nefronów podczas nefrogenezy.

Rycina 2. Schematyczna ilustracja etapów rozwoju nerek metanerkowych. Sygnały z zawiązka moczowodu powodują kondensację mezenchymu metanerkowego, tworząc czapeczkę progenitorów nefronów (mezenchym czapeczki) wokół końcówek zawiązków moczowodu. Mezenchym czapeczki przechodzi przemianę mezenchymalno-nabłonkową, tworząc pęcherzyki nerkowe, które rozwijają się kolejno w ciała w kształcie przecinka i litery S. Struktury te łączą się z łodygą zawiązka moczowodu, z której powstaje przewód zbiorczy. Komórki w domenie proksymalnej korpusu w kształcie litery S różnicują się w wyspecjalizowane komórki nabłonkowe dojrzałego ciałka nerkowego (tj. podocyty i komórki torebki Bowmana), podczas gdy komórki w części środkowej i dystalnej różnicują się w segmenty kanalikowe nefronu (kanaliki proksymalne). , pętle Henlego i kanaliki dystalne). Utworzono przy użyciu BioRender.com.

Warunkowa delecja Dicer w linii zawiązków moczowodu powoduje szereg nieprawidłowości silnie przypominających CAKUT, w tym dysplazję nerek i rozwój torbieli przewodu zbiorczego (73, 77, 78). Przedwczesne zakończenie morfogenezy rozgałęzień (w odpowiedzi na zmniejszoną ekspresję Wnt11 i c-Ret w zawiązku moczowodu) jest prawdopodobnie głównym czynnikiem przyczyniającym się do dysplazji nerek (73). Początek tworzenia cyst następuje około E15,5 i wiąże się z defektami w długości pierwotnych rzęsek, zwiększoną apoptotyczną śmiercią komórek i nadmierną proliferacją komórek (73). Ponieważ Dicer odgrywa w komórce ważne, niezależne od miRNA role, zastosowano warunkową delecję Dgcr8 w celu potwierdzenia, że ​​fenotypy obserwowane w modelach warunkowego nokautu Dicer są rzeczywiście wynikiem utraty miRNA. U zwierząt z delecją Dgcr8 w dystalnym nefronie i pochodnymi przewodu zbiorczego rozwija się wodonercze i cysty przewodu zbiorczego (79), fenotyp podobny do CAKUT, który przypomina utratę aktywności Dicer w linii zawiązków moczowodu.

Badania przeprowadzone w dwóch niezależnych grupach wykazały, że ablacja preparatu Dicer z linii zrębu nerki Foxd1+ i jego pochodnych skutkuje szeregiem anomalii nerek, ze spójnymi wynikami dotyczącymi hipoplastycznych nerek, zmniejszonej liczby kłębuszków nerkowych, nieprawidłowego dojrzewania kłębuszków i wadliwych naczyń krwionośnych. wzornictwo (80, 81). Chociaż obie grupy opisały w dużej mierze zgodne fenotypy przy użyciu podobnych modeli mysich, zauważono dwie wyraźne różnice. Nakagawa i in. zaobserwowali brak rdzenia i brodawki wewnętrznej oraz zmniejszenie strefy nefrogennej (80). Dla kontrastu, Phua i in. wykazali ekspansję populacji progenitorów nefronów i zachowaną brodawkę nerkową (81). Nakagawa i in. zaproponowali, że defekty te są związane z zakłóceniami szlaku sygnałowego Wnt, co skutkuje zmianami w migracji i proliferacji komórek zrębowych, w wyniku regulacji w dół miRNA komórek zrębowych, miR-214, miR-199a{{7 }}p i miR-199a-3p (80). Badanie przeprowadzone przez Phua i wsp. zasugerowali, że zmiany w programach apoptotycznych (w tym zwiększona ekspresja genów efektorowych Bim i p53) przyczyniają się do defektów fenotypowych (81). Można sobie wyobrazić, że różnice w tle genetycznym i/lub skuteczność rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być odpowiedzialne za różnice opisane w tych badaniach. Niemniej jednak opisane fenotypy są zgodne ze znaną wieloaspektową rolą zrębu nerki w rozwoju nerek, a mechanizmy leżące u podstaw tych fenotypów są prawdopodobnie złożone, biorąc pod uwagę naturę delecji Dicer. Aby lepiej zdefiniować mechanizmy regulacyjne, potrzebne są dalsze badania dotyczące specyficznych miRNA w różnych subpopulacjach zrębu.

Nowsze prace dotyczyły kwestii funkcji specyficznych miRNA zarówno w rozwijających się progenitorach nerek, jak i nefronów. Wykorzystując model ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, Bantounas i in. wykazali, że hamowanie klastra miR-199a~214 powoduje dysmorficzne kłębuszki, nieprawidłowe kanaliki proksymalne, zmniejszoną ekspresję WT1 i zwiększone śródmiąższowe naczynia włosowate w organoidach nerkopodobnych (82). Co ciekawe, globalna delecja miR-210 reagującego na hipoksję skutkuje specyficznym dla mężczyzn deficytem nefronów (83). Na przykład warunkowa delecja klastra miR-17~92 w progenitorach nefronów i ich pochodnych u myszy upośledza proliferację komórek progenitorowych i zmniejsza liczbę rozwijających się nefronów. W rezultacie u zmutowanych myszy rozwija się białkomocz, zwłóknienie nerek i upośledzona czynność nerek (84). Rozregulowane poziomy docelowego genu miR-17~92, CFTR, są powiązane z wadliwą proliferacją komórek progenitorowych i zmniejszonym wyposażeniem nefronów w tym mysim modelu (85).

Sekwencjonowanie małych RNA (smRNA-Seq) jest coraz częściej wykorzystywane do profilowania wzorców ekspresji miRNA i odkrywania nowych gatunków miRNA. Sekwencja smRNA nefrogennych komórek mezenchymalnych E15.5 pozwoliła zidentyfikować 162 miRNA z adnotacjami, które ulegają różnej ekspresji w tej populacji komórek w porównaniu z całymi nerkami i 49 nowymi gatunkami miRNA (86). Co ciekawe, poziomy miRNA rodziny miR-200 były znacząco obniżone w progenitorach nefronów. Biorąc pod uwagę, że członkowie rodziny miR-200 są kluczowymi regulatorami przejścia mezenchymalno-nabłonkowego w przewodzie zbiorczym (87), spekulujemy, że ich ekspresja może być ściśle regulowana, aby zapewnić normalne różnicowanie nabłonkowe progenitorów nefronów podczas rozwoju nerek.

Funkcja miRNA w dojrzałym nefronie

Oprócz tego, że są potrzebne podczas rozwoju nerek, miRNA regulują liczne procesy biologiczne w głównych liniach komórkowych tworzących dojrzały nefron (69, 88–91). Zgodnie z tym opisano specyficzną dla segmentu ekspresję miRNA wzdłuż nefronu, w tym miR-143 i miR-195a w kłębuszkach, miR-107 i miR{{7} }a w kanaliku bliższym, miR-193 i miR-378a w grubej kończynie wstępującej, miR-874 i miR-155 w kanaliku dalszym krętym oraz miR{{ 12}}c w przewodzie zbiorczym (87). Co więcej, badania funkcjonalne w przedziałach dojrzałego nefronu potwierdzają odmienne role miRNA.

Myszy pozbawione Dicer lub Drosha w podocytach wykazują wyraźny białkomocz, stwardnienie kłębuszków nerkowych i szybki postęp do niewydolności nerek, wtórny do zakłócenia bariery filtracji kłębuszkowej (90–93). Analizy in silico wykazały, że różne transkrypty o zwiększonej ekspresji w zmutowanych kłębuszkach zawierają sekwencje docelowe dla członków rodziny miR-30. Jak wszyscy czterej członkowie rodziny miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d i miR-30c{ {9}}) zwykle ulegają silnej ekspresji w podocytach, te miRNA mogą być odpowiedzialne za nieprawidłowości w podocytach i zaburzenie bariery filtracji kłębuszkowej u zmutowanych myszy (91).

Nieco zaskakujące jest to, że usunięcie Dicer z kanalików bliższych ssaków po urodzeniu nie wpływa na rozwój, histologię ani funkcję nerek, ale chroni przed uszkodzeniem nerek w wyniku niedokrwienia/reperfuzji. Zmutowane myszy wykazują lepszą czynność nerek, zmniejszone uszkodzenie nerek, apoptozę dolnych kanalików i lepsze przeżycie w porównaniu ze swoimi towarzyszami z miotu WT (94). Prawdopodobnie odzwierciedla to „sumę” efektu delecji wielu miRNA w kanaliku proksymalnym, ponieważ inne prace wykazały, że ekspresja specyficznych miRNA działa ochronnie w przypadku uszkodzenia niedokrwiennego/reperfuzyjnego nerek (np. miR-16 i miR-21; ref. 95, 96); podczas gdy inne są szkodliwe (np. miR-182; ref. 97).

Chociaż miRNA wydają się być zbędne dla funkcjonowania kanalików bliższych, są one niezbędne dla nefronów dystalnych i homeostazy przewodu zbiorczego (79, 88, 98). Zbieranie specyficznej dla przewodu inaktywacji Dicer i innych krytycznych genów związanych z biogenezą miRNA (w tym Dgcr8, Ago1, 2, 3 i 4) powoduje niewydolność nerek u dorosłych myszy z powodu postępującego zwłóknienia cewkowo-śródmiąższowego i śródmiąższowego zapalenia (88). Poprzedza to częściowe przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) komórek przewodów zbiorczych i regulacja w dół członków rodziny miR-200, którzy hamują EMT (88). Podobnie ablacja Dicer lub Dgcr8 odpowiednio z dystalnego nefronu i pochodnych zawiązków moczowodu powoduje nieprawidłowości nerek i niewydolność nerek (78, 98), które ostatecznie są związane z obniżeniem poziomu członków rodziny miR-200 (98). Zwiększona ekspresja docelowego genu miR-200 Pkd1 u tych zmutowanych myszy zakłóca tubulogenezę i wytwarza struktury przypominające cystę (98). Te różnice w zapotrzebowaniu na funkcjonalne miRNA w kanalikach proksymalnych i nefronie dystalnym/przewodzie zbiorczym można wyjaśnić segmentowym rozmieszczeniem miRNA wzdłuż długości nefronu i przewodu zbiorczego w nerkach WT (88).

Usunięcie Dicer w komórkach wydzielających reninę w aparacie przykłębuszkowym powoduje deficyt komórek przykłębuszkowych, obniżony poziom reniny w krążeniu, a w konsekwencji obniżenie ciśnienia tętniczego krwi, upośledzoną czynność nerek, pasiasty wzór zwłóknienia śródmiąższowego i nieprawidłowości naczyniowe (89). Zmniejszenie liczby komórek przykłębuszkowych sugeruje zapotrzebowanie na dojrzałe miRNA w utrzymaniu ich fenotypu. Później zidentyfikowano miR-330 i miR-125b-5p jako potencjalnych kandydatów, którzy odpowiednio hamują lub promują fenotyp mięśni gładkich komórek przykłębuszkowych (99).

Inne aktywne obszary badań nad miRNA w ostrym uszkodzeniu nerek (8–10), policystycznej chorobie nerek (11) i przeszczepie nerki (10) zostały kompleksowo omówione w innych niedawnych przeglądach.

MiRNA w chorobach nerek u dzieci W tej części przedstawiamy przegląd roli miRNA w rozwojowych chorobach nerek, w tym guzach CAKUT i Wilmsa. CAKUT należą do najczęstszych form wad rozwojowych urodzeniowych, dotykając około 3–7 na 1000 żywych urodzeń (100). Zakłócenie rozwoju nerek i dolnych dróg moczowych prowadzi do szerokiego spektrum objawów klinicznych obserwowanych w CAKUT, w tym anomalii nerek (tzn. agenezji nerek, hipoplazji i dysplazji nerek oraz wielotorbielowatości nerek dysplastycznych), anomalii moczowodowo-miedniczkowych (tj. niedrożności połączenia moczowodowo-miedniczkowego), podwójny układ zbiorczy oraz anomalie pęcherza i cewki moczowej (101–103). Ta heterogeniczność fenotypowa jest prawdopodobnie spowodowana złożonymi interakcjami między genetycznymi, epigenetycznymi i/lub prenatalnymi czynnikami środowiskowymi, które wpływają na rozwój nerek i dolnych dróg moczowych, co skutkuje CAKUT (101). Większość naszej obecnej wiedzy na temat patogenezy CAKUT pochodzi z modeli mysich i form syndromicznych CAKUT. Badania te doprowadziły do ​​identyfikacji kilku genów CAKUT, z których wiele bierze udział we wczesnym rozwoju nerek, w tym PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 i inne (101, 104, 105). Jednakże pojedyncze mutacje lub warianty liczby kopii w genach kodujących białka nie wyjaśniają większości przypadków CAKUT (~80%) (101, 106).

Jak wspomniano powyżej, wyczerpanie się dojrzałych miRNA z różnych linii komórkowych rozwijającej się nerki w modelach mysich skutkuje nieprawidłowościami nerek imitującymi ludzki CAKUT (73, 74, 78, 79). Ponadto delecje w linii zarodkowej MIR17HG, który koduje klaster miR-17~92, powodują u ludzi zespół Feingolda typu 2 (107). Chociaż fenotyp nerek u pacjentów z zespołem Feingolda typu 2 i mutacjami MIR17HG pozostaje nieokreślony, w przypadkach zespołu Feingolda związanego z mutacjami MYCN zgłaszano 18% częstość występowania CAKUT (108, 109). Łącznie obserwacje te sugerują, że mutacje w miRNA ulegających ekspresji podczas rozwoju nerek mogą powodować CAKUT u ludzi, zwłaszcza że wiele miRNA jest wysoce konserwatywnych u myszy i ludzi.

Aby przetestować tę hipotezę, w jednym badaniu wzięło udział 1248 pacjentów z niesyndromicznym CAKUT z 980 rodzin i szukano mutacji w 96 regionach łodyga-pętla 73 genów miRNA rozwoju nerek (106). W tej kohorcie zidentyfikowano 31 osób z 17 różnymi wariantami pojedynczego nukleotydu wpływającymi na 16 różnych genów miRNA. Stwierdzono, że wśród nich dwa nowe warianty miRNA są potencjalnie patogenne. MIR19B1 (członek klastra miR-17~92) powiązano z obecnością agenezji prawej nerki, a MIR99A z ciężkim odpływem pęcherzowo-moczowodowym i opadaniem nerek. Ta zaskakująco mała liczba potencjalnych wariantów patogenicznych wynika częściowo z ograniczeń tego badania, ponieważ analiza uwzględniała jedynie mutacje w genach miRNA, które uwzględniono w podejściu dotyczącym genu kandydującego i nie wykryła zmian w liczbie kopii ani dużych rearanżacji DNA (106). .

W alternatywnym podejściu segmenty moczowodu od pacjentów z różnymi CAKUT analizowano pod kątem zróżnicowanej ekspresji transkryptu za pomocą mikromacierzy, pod kątem obecności przewidywanych bioinformatycznie docelowych miRNA i dojrzałych miRNA za pomocą qPCR (110). Stosując to wielotorowe podejście, zidentyfikowano siedem miRNA mających potencjalną rolę w CAKUT, a wśród nich wartość has-miR-144 była znacząco zwiększona u pacjentów z CAKUT. Analiza ontologii genów wykazała, że ​​przewidywane geny docelowe has-miR-144 przyczyniają się do procesów biologicznych związanych z rozwojem CAKUT, w tym rozwoju jajowodów (22 geny docelowe), rozwoju układu moczowo-płciowego (18 genów docelowych), rozwoju nerek (14 genów docelowych) oraz rozwój narządów embrionalnych (18 genów docelowych) (110).

Konieczne są dalsze badania, aby zdefiniować mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogennej roli miRNA w CAKUT. Wyniki takich badań będą miały kluczowe znaczenie dla poprawy opieki nad pacjentami z CAKUT i zapobiegania ich progresji do PChN, zapewnienia odpowiedniego poradnictwa genetycznego dla pacjentów i ich rodzin oraz opracowania nowych strategii terapeutycznych.