Naturalna infekcja parwowirusem u dzikich kotów rybackich (Prionailurus viverrinus) ujawnia istniejącą lokalizację wirusa w nerkach

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakcyjny

Protoparwowirus drapieżników-1 (CPPV-1), gatunek wirusa zawierający warianty wirusa panleukopenii kotów (FPV) i parwowirusa psów (CPV), jest szeroko rozpowszechniony wśród domowych i dzikich drapieżników, powodując ogólnoustrojowe śmiertelne choroby. Dzikie koty rybackie (Prionailurus viverrinus), gatunek wrażliwy na całym świecie, zostały znalezione martwe. Badanie pośmiertne zwłok ujawniło zmiany w jelicie, śledzionie iNerkowy. Identyfikacja antygenu CPPV-1 w tych tkankach przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i immunohistochemii (IHC) wsparła zakażenie wirusem. Dodatni wynik PCR i IHC w tkanki nerekujawniła nietypową lokalizację wirusa, podczas gdy hybrydyzacja in situ (ISH) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) z techniką pop-off potwierdziły pierwszy opis lokalizacji wirusa unerki. Pełna charakterystyka genomu i dedukowana analiza aminokwasów otrzymanego CPPV-1 od kotów rybackich ujawniły FPV jako czynnik sprawczy. Wykryte sekwencje FPV wykazały mutacje aminokwasów w I566M i M569R w białku kapsydu. Analizy filogenetyczne i ewolucyjne kompletnych sekwencji kodujących genomu ujawniły, że genomy kota rybackiego CPPV-1 są genetycznie zgrupowane z genomami FPV izolowanymi od kotów domowych w Tajlandii. Od lat 70. wykazano, że genomy te dzielą ewolucję genetyczną z chińskimi szczepami FPV. Badanie to jest pierwszym dowodem na zakażenie CPPV-1 u kotów rybackich i jako pierwsze pokazuje jego lokalizację wnerki. Te odkrycia potwierdzają wielo-żywicielski zakres tego parwowirusa i sugerują, że śmiertelne infekcje CPPV-1 mogą powodować inne wrażliwe dzikie drapieżniki.

Słowa kluczowe: tkanka nerkowa; choroby nerek, nerek, nerek, kanalików nerkowych

Wstęp

Rodzaj Prionailurus, rodzina Felidae, jest klasyfikowany jako grupa cętkowanych, małych dzikich kotów, które pochodzą z Azji [1]. Rodzaj Prionailurus obejmuje cztery formalnie uznane gatunki dzikich kotów, w tym kota lamparta (P. bengalensis), kota z płaską głową (P. planiceps), kota rdzawego (P. rubiginosus) i kota rybaka (P. viverrinus). [2]. Kot rybacki żyje głównie w okolicach bagien i namorzynów. Zamieszkuje wyłącznie Azję Południową i Południowo-Wschodnią, a częściej występuje w Tajlandii [3, 4]. Obecnie populacje kotów rybackich są zagrożone, ponieważ tereny podmokłe, na których żyją, zostały zniszczone w ciągu ostatniej dekady. W rezultacie gatunek ten jest obecnie uważany za wrażliwy i znajduje się na Czerwonej Liście Międzynarodowej Unii Ochrony Przyrody (IUNC) [3]. Z powodu utraty siedlisk kolonie kotów rybackich migrują i sporadycznie żyją na terenach, na których żyją udomowione zwierzęta i ludzie [5]. To zjawisko wspólnego środowiska może prowadzić do zwiększonego rozprzestrzeniania się patogenów między podatnymi zwierzętami dzikimi i domowymi i odwrotnie. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat udokumentowano doniesienia o śmiertelnych ogniskach epidemii u zwierząt dzikich lub domowych, które mogły wynikać z rozprzestrzeniania się patogenu [6–9]. Dlatego dynamika przenoszenia patogenów od tych zwierząt powinna zostać zbadana i wymaga dalszych badań.

CISTANCHE POPRAWI FUNKCJĘ NEREK/NEREK

został uznawany za ważny patogen związany z chorobami śmiertelnymi zarówno w dzikich, jak i domowych rodzinach psowatych i kotowatych [10, 11]. Przypuszcza się, że FPV, powszechny patogen z gatunku Felidae, jest wspólnym przodkiem CPV [12–14]. CPV często infekuje zwierzęta z rodziny psowatych, a coraz więcej dowodów na infekcję w rodzinie kotowatych [9, 15, 16]. Wcześniej wysunięto hipotezę, że FPV i CPV są wirusami ograniczonymi do gospodarza. Jednak kilka odkryć później wskazało, że niektóre zwierzęta z rodziny psowatych mogą odgrywać rolę jako rezerwuar FPV lub odwrotnie [11, 17, 18]. Co więcej, kilka raportów wskazuje, że warianty FPV i CPV (CPV-2a, -2b i -2c) mają wspólnych podatnych gospodarzy. Żywiciele ci to nie tylko zwierzęta domowe, ale także różne gatunki mięsożerne [15, 19, 20], co sugeruje wielożywioły zakres CPPV-1 [11].

W latach 1996-1997 warianty CPV wykryto po raz pierwszy u kotów leopardów i początkowo oznaczono je jako parwowirus leopard cat (LCPV), co sugeruje pierwszy opis CPPV-1 w rodzaju Prionailurus [21, 22]. Niektóre z tych szczepów LCPV okazały się być genetycznie odmienne od wcześniej opisanych CPV-2a i -2b z powodu mutacji aminokwasu G300A w białku kapsydu (VP). Spowodowało to zmianę jego właściwości antygenowych, które są obecnie wykorzystywane jako unikalny punkt mutacji do odróżnienia CPV-2c od innych wariantów CPV [22]. Odkrycie nowego wariantu CPV (obecnie znanego jako CPV-2c) u kotów lampartów wsparło ideę koewolucji CPPV-1 wśród gatunków zwierząt. Później infekcje wariantami FPV i CPV zostały zgłoszone u kotów lampartów [9]. Sugeruje to, że inne gatunki z tego samego rodzaju co kot lampart (rodzaj Prionailurus) mogą być podatne na zakażenie CPPV-1. Do tej pory podatność na zakażenie CPPV-1 innych gatunków z rodzaju Prionailurus jest nadal w dużej mierze nieznana. Rozszyfrowanie, w jaki sposób warianty CPPV-1 ewoluują i jak zachowują się nowo pojawiające się warianty, może pomóc w wyjaśnieniu, jak zapobiec ewentualnej epidemii nowego wariantu. Nawet jeśli nowy wirus zyska szerszy zakres gospodarzy, u nowego, podatnego gospodarza można zaobserwować śmiertelne epidemie lub nietypowe zmiany związane z infekcją. Badanie to opisuje śmiertelną infekcję CPPV-1 u dzikich kotów rybackich (Prionailurus viverrinus). Charakterystyka genetyczna otrzymanego CPPV-1 ujawnia FPV jako czynnik sprawczy. To odkrycie dostarcza pierwszych dowodów na zakażenie FPV u tego gatunku i ujawnia unikalny tropizm komórkowy tego wirusa. Dalsze wyjaśnienie infekcji FPV i jej wariantów u tego gatunku jest konieczne, aby uwzględnić globalną infekcję wielu gatunków wrażliwych.

Materiały i metody

Zwierzęta i rutynowe badanie pośmiertneW czerwcu 2019 r. dwa dzikie koty (P. viverrinus) otrzymały sygn. 1 i 2 znaleziono martwe na przedmieściach prowincji Nakhon Ratchasima w Tajlandii. Później w sierpniu 2019, kolejny kot rybacki, oznaczony nr sprawy. 3, był ratowany z obszaru, w którym znaleziono dwa pierwsze koty rybackie. Ze względu na stopień odwodnienia, sprawa nr. 3 zmarło podczas skierowania do szpitala dla zwierząt. Te trzy koty rybackie zostały poddane dochodzeniu pośmiertnemu w ramach rutynowego procesu. Niestety próbki wolno żyjących udomowionych zwierząt lub dzikich gatunków żyjących na tym samym obszarze nie były dostępne; w związku z tym nie zostały uwzględnione w tym badaniu. U wszystkich kotów łowiących wykonano rutynową sekcję zwłok. Selektywne narządy życiowe, w tym płuca, wątroba, serce, śledziona inerkapobrano od wszystkich kotów łowiących, natomiast jelito i węzeł chłonny krezkowy pobrano dodatkowo od kota łowiącego nr 3. Wszystkie wyselekcjonowane tkanki zostały przekazane do badania histologicznego i indywidualnie pobrane do dalszych badań molekularnych. Do celów histologicznych tkanki zanurzano w 10% (obj./obj.) obojętnej buforowanej formalinie na co najmniej 24 godziny i rutynowo poddawano obróbce. Następnie barwiono hematoksyliną i eozyną

(H&E) stosując standardowe procedury przed dochodzeniem przez patologa weterynaryjnego certyfikowanego przez ACVP (TK). Próbki świeżej tkanki uzyskane od trzech kotów rybackich przechowywano w temperaturze –80˚C do badań molekularnych. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami po zatwierdzeniu Komitetu Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Chulalongkorn (nr 1931036).

Ogólne wirusologiczne testy molekularnePróbki świeżych tkanek, w tym serce, płuca, wątroba, śledziona inerkawszystkich kotów rybackich plus dodatkowe tkanki węzłów chłonnych jelitowych i krezkowych kota rybackiego nr. 3, poddano ekstrakcji wirusowego kwasu nukleinowego przez indywidualną homogenizację z 1 procentowym (obj./obj.) roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Następnie całkowity wirusowy kwas nukleinowy ekstrahowano przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji wirusowego kwasu nukleinowego II (Geneaid, Taipei, Tajwan) zgodnie z sugestią producenta. Wyekstrahowane kwasy nukleinowe następnie kwalifikowano i określano ilościowo przez ich stosunek absorbancji A260/A280 przy użyciu metody spektrofotometrycznej (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Wszystkie wyekstrahowane kwasy nukleinowe poddano następnie wirusowemu badaniu molekularnemu przy użyciu analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z kilkoma panelami testowymi PCR rodziny panwirusów, w tym wykrywaniem herpeswirusa [23], paramyksowirusa [24], pneumowirusa [25], kaliciwirusa [26], wirus grypy [27], bocawirus [26, 28], parwowirus [29] i koronawirus [30, 31]. Protokoły PCR, odczynniki, warunki cykli oraz kontrole dodatnie/ujemne stosowane w reakcjach są opisane w pliku S1. Specyficzna detekcja PCR genu dehydrogenazy - 3-gliceraldehydu - 3-fosforanu (GAPDH) kotów została wykorzystana jako kontrola wewnętrzna, jak opisano wcześniej [32]. Następnie pozytywne amplikony PCR wizualizowano przy użyciu platformy do elektroforezy kapilarnej QIAxcel (Qiagen, Hilden, Niemcy), jak opisano wcześniej [33]. Pozytywne amplikony z każdego testu PCR oczyszczono i poddano dwukierunkowemu sekwencjonowaniu Sangera (Macrogen Inc, Seul, Korea Południowa). Ze względu na umiarkowaną autolizę tkanek nie było możliwe przeprowadzenie badań bakteriologicznych u tych łowiących kotów.

Wykrywanie CPPV in situ-1 przy użyciu immunohistochemii (IHC), hybrydyzacji in situ (ISH) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

Wstępne wirusologiczne badania przesiewowe wykazały pozytywne amplikony panparwowirusowej PCR, a wyniki sekwencjonowania wykazały również potencjalne sekwencje DNA CPPV-1. Wyniki te skłoniły nas do dalszego potwierdzenia obecności CPPV-1 i zlokalizowania dystrybucji CPPV-1 w tkankach kotów rybackich. Tkanki zatopione w parafinie utrwalone w formalinie (FFPE), w tym płuca, wątroba, serce, śledziona,nerkai jelita poddano detekcji CPPV-1 IHC przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko psiemu parwowirusowi (ab59832, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) z systemem wykrywania peroksydazy chrzanowej (HRP) (polimer EnVision, Dako, Glostrup, Dania) . Pokrótce, skrawki FFPE pocięto do grubości 4-μm, a następnie odparafinowano i ponownie uwodniono. Szkiełka poddano następnie wstępnej obróbce, zablokowano endogenną peroksydazę i poddano obróbce jak opisano wcześniej [11]. Skrawki tkanki jelit kota zakażonego FPV i psa zakażonego CPV użyto jako kontroli pozytywnej, podczas gdy identyczne skrawki inkubowano z oczyszczonymi IgG kozimi i króliczymi (IHC uniwersalny odczynnik kontroli negatywnej, kod ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA). Dotyczącenerkowymartwica kanalików obecna w obszarach, w których zaobserwowano dodatnie sygnały CPPV-1 IHC,nerkawycinki wszystkich kotów rybackich zostały poddane specjalnemu wybarwieniu kwasem nadjodowym Schiffa (PAS), w celu wykazania architektury komórkowejnerkatkanki.

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

Ponadto FFPEnerkasekcje kotów rybackich nr. 1 i 3 poddano analizie ISH i TEM w celu potwierdzenia wyniku dodatniego barwienia CPPV-1 IHC i ultrastrukturalnego wykazania cząstek wirusa wtkanki nerek, odpowiednio. Dla ISH skonstruowano sondę DNA CPPV-1 obejmującą 393 pz [34] genu kapsydu CPPV-1 przy użyciu zestawu PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Bazylea, Szwajcaria), zgodnie z sugestie producenta. Reakcję i warunki cykli termicznych przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [34], z wyjątkiem zastosowania oligonukleotydów znakowanych digoksygeniną (DIG). Skonstruowaną sondę hybrydyzacyjną uwidoczniono i potwierdzono przez rozdział wielkości w 1,5% (wag./obj.) elektroforezie w żelu agarozowym. ISH z chromogennym DNA wykonano jak opisano wcześniej [26] z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, po odparafinowaniu, ponownym uwodnieniu, a następnie wypłukaniu w PBS, szkiełka FFPE o grubości 4-μm poddano trawieniu proteolitycznemu, utrwaleniu i wstępnej hybrydyzacji. Szkiełka następnie hybrydyzowano z sondą ISH 25 ng/μl w 42°C przez noc. Sygnały hybrydyzacji wizualizowano przez sprzężenie z 100 µl fragmentów Fab anty-DIG-AP (Roche, Bazylea, Szwajcaria) (1:200 w 1X roztworze blokującym) w połączeniu z Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Dania) . Szkiełka następnie wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Uważano, że czerwone osady w korelacji morfologii komórek są pozytywne dla ISH. W przypadku kontroli negatywnych zastosowano sondy wirusa tilapia lake (TiLV) [35] zamiast sondy CPPV-1. Próbki TEM przygotowano zgodnie z technikami pop-off z modyfikacjami [36–38] i wybarwiono metalami ciężkimi, jak opisano wcześniej [39, 40]. Ultrastrukturę badano za pomocą TEM (HT7800; Hitachi, Tokio, Japonia) przy 80 kV

Pełna charakterystyka genetyczna kota rybackiego CPPV-1Ponieważ wyniki wirusologicznej PCR i skriningu IHC były zgodne, a wyniki częściowych sekwencji genomu VP-2 uzyskanych z panparwowirusowej PCR sugerowały podobieństwo genetyczne między przypadkami nr. 1 i 2, ale nie w przypadku nr 3, scharakteryzowaliśmy dalej sekwencję CPPV-1 pełnej długości z tych kotów rybackich (przypadek nr 1 i 3) i sklasyfikowaliśmy pochodzenie CPPV-1 za pomocą zestaw zdegenerowanych par starterów specyficznych dla FPV i CPV pozyskany z poprzedniej publikacji [26]. W skrócie, wyekstrahowane kwasy nukleinowe otrzymane ze śledziony inerkidwóch kotów rybackich plus dodatkowa tkanka jelitowa kota rybackiego nr. 3, amplifikowano indywidualnie przy użyciu GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) i specyficznych starterów (S1 File). Warunki PCR zostały opisane wcześniej [26]. Docelowe amplikony uwidoczniono przy użyciu 2% (wag./obj.) elektroforezy w żelu agarozowym i dalej oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji z żelu Monarch DNA Gel (New England Biolab, Frankfurt, Niemcy) przed komercyjnym sekwencjonowaniem Sangera. Pełne sekwencje genomu izolatów CPPV-1 uzyskane od dwóch kotów rybackich zostały zdeponowane w GenBank (numery dostępu MW145540-MW145541).

Analizy filogenetyczne, rekombinacyjne i ewolucyjne CPPV kota rybackiego-1 Sekwencje genomu pełnej długości szczepu CPPV kota rybackiego-1 zostały dopasowane z opublikowanymi kompletnymi sekwencjami CPPV-1 uzyskanymi od różnych gatunków żywicieli , dostępny w GenBank przy użyciu MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) i oprogramowania MEGA7 (http://www.megasoftware.net). Dopasowania sekwencji poddano następnie filogenetycznej konstrukcji drzewa. Drzewo filogenetyczne utworzono metodą największej wiarygodności (ML) z modelem Hasegawy–Kishino–Yano z rozkładem gamma (HKY plus G), który został wyselekcjonowany za pomocą algorytmu znajdź-najlepiej dopasowanego modelu w MEGA7 według Bayesowskiego kryterium informacyjnego . Drzewo zostało załadowane z 1 000 powtórzeniami. Podobieństwo sekwencji parami między genomami CPPV-1 obliczono przy użyciu modelu maksymalnego prawdopodobieństwa złożonego, a ich dystans ewolucyjny przeanalizowano w MEGA7. Wyjściowe tożsamości par nukleotydów zostały wygenerowane i zwizualizowane w formacie Microsoft Excel (plik S2). Wyjściową sekwencję dopasowania CPPV-1 zastosowano następnie jako matrycę do analizy rekombinacji genetycznej przy użyciu dwóch statystycznie niezależnych pakietów oprogramowania. Pokrótce, dopasowanie pozwoliło zidentyfikować potencjalne szczepy rekombinacyjne przy użyciu zintegrowanego oprogramowania Recombination Detection Program 4 (RDP4) Pakiet V. Beta 4.94 i sprawdzono to krzyżowo z wykresem podobieństwa i analizą ładowania początkowego w pakiecie oprogramowania SimPlot V. 3.5.1. Ustawienia programów i interpretację wyników przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [26, 41].

W celu analizy ewolucyjnej CPPV kota rybackiego{{0}} pobrano zestaw danych składający się z 224 kompletnych sekwencji genomu zawierających 26 sekwencji FPV-, 6 MEV- i 192 CPV, wszystkie pochodzące z 18 krajów w latach 1979-2019 z bazy GenBank. Analizę ewolucyjną przeprowadzono z 2 potencjalnymi sekwencjami CPPV-1 uzyskanymi od kotów rybackich przy użyciu modelu łańcucha Bayesa Markowa Monte Carlo (BMCMC) zaimplementowanego w programie BEAST V. 2.4.8 [42]. Przeprowadzono jModelTest [43] w celu zidentyfikowania najlepiej dopasowanego modelu substytucji nukleotydów dla wielu sekwencji dopasowania. Wdrożono najlepiej dopasowane modele substytucji w modelach lognormalnych zrelaksowanych i ścisłych modeli zegarowych przy stałych rozmiarach populacji, jak a priori, aby uwzględnić zróżnicowane tempo ewolucji między liniami. Koalescencyjne drzewo panoramy bayesowskiej wcześniejsze i empiryczne częstotliwości bazowe zostały uzyskane w oparciu o model zegara najlepiej dopasowanego i uruchomione dla 100 milionów łańcuchów, próbkując co 10. 000generację, przy czym pierwsze 10 procent odrzucono jako wypalenie. Zbieżność parametrów potwierdzono obliczając efektywną wielkość próby za pomocą programu TRACER V. 1.7.0 [44]. Drzewa maksymalnej wiarygodności kladu zostały opisane za pomocą TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Drzewo filogenetyczne z oszacowaną rozbieżnością, zmienną osią czasu, prawdopodobieństwem a posteriori i 95 procentową najwyższą gęstością a posteriori (HPD) zostało wygenerowane i wyświetlone za pomocą FigTree V. 1.4.3 [45].

Retrospektywne badanie antygenu CPPV-1 u dzikich zwierząt mięsożernychW celu zbadania roli CPPV-1 związanej z zachorowalnością i śmiertelnością z nieznanymi przyczynami u dzikich drapieżników w odległej i niedawnej przeszłości, uwzględniono 305 selektywnych świeżych próbek do ekstrakcji genomowej i identyfikacji ukierunkowanej na CPPV{{2} } gen kapsydu, jak opisano powyżej. Próbki te pozyskiwano od 2013 r. w postaci wymazów kałowych lub treści jelitowej. Pozyskano je od 136 zwierząt z ogrodów zoologicznych z 27 różnych gatunków mięsożernych (tabela S1). Wyniki Wyniki pośmiertne i lokalizacja tkanek kota rybackiego CPPV-1 Wszystkie koty rybackie poddane sekcji zwłok były umiarkowanie wychudzone z różnym stopniem odwodnienia, podczas gdy 2 z 3 kotów rybackich (przypadek nr 1 i 2) wykazywały umiarkowaną autolizę. Wyróżnia się śledziona inerkibyły zatłoczone u wszystkich kotów rybackich. Kot rybacki nr 3 miał makroskopowe zmiany nieżytowego zapalenia jelit, które zawierały wodnisto-brązowo-żółtawą zawartość w ich światłach i przekrwieniu węzłów chłonnych krezkowych. Histologicznie płuco kota rybackiego nr. 3 wykazały silne przekrwienie z naciekiem komórek jednojądrzastych w pęcherzykach płucnych. Wątroba wykazywała łagodne okołowrotne zapalenie wątroby, charakteryzujące się naciekiem komórek jednojądrzastych w triadach wrotnych wątroby. U wszystkich łowiących kotów zaobserwowano podobny stopień przekrwienia śledziony z niewielką liczbą pęcherzyków limfatycznych śledziony. Pęcherzyki limfoidalne zostały zubożone, a pozostałe pęcherzyki limfoidalne w zapadniętej architekturze śledziony ze zwiększoną liczbą wydatnych beleczek śledzionowych (ryc. 1A). Były rozproszone resztki karyorektyczne limfocytów z

Ryc. 1. Zakażenie CPPV-1 u kotów rybackich. Pokazowe zdjęcia H&E (A, C) i CPPV-1 IHC (B, D) z łowiących kotów. (A) Nr kat. wędkarski 1. Rozproszona zatkana śledziona z niewielką liczbą pęcherzyków limfatycznych. Środek jednego z pozostałych pęcherzyków limfatycznych zawierał eozynofilowy materiał włóknisty (fibryna) zmieszany z rozsianymi szczątkami kariorektycznymi limfocytów (limfocytoliza) (wstawka). Niewiele liczby tych limfocytów zawierało bazofilowe ciałka inkluzyjne wewnątrzjądrowe o wielkości 5–7 μm, które oddzielały chromatynę jądrową (strzałka). (B) Nr kat. wędkarski 3. Skrócenie kosmków ze sporadycznie rozszerzonymi kryptami, które zawierały eozynofilowe substancje białkowe i wyłożone wyraźnie osłabionymi lub martwiczymi komórkami nabłonkowymi krypt (wstawka). Wiele krypt komórek nabłonkowych było pyknotycznych i kariorektycznych, a rzadkie komórki zawierały podobne bazofilowe ciałka inkluzyjne wewnątrzjądrowe (strzałki). (C) Nr kat. wędkarski 1. Immunoreaktywność CPPV-1 była często obserwowana w cytoplazmie komórek jednojądrzastych w obszarze śledzionowego pęcherzyka limfatycznego. (D) Nr kat. wędkarski 3. Sygnały CPPV-1 IHC wykrywano w sposób rozproszony, a sygnały immunoreaktywności były wyraźnie zlokalizowane w cytoplazmie komórek nabłonka kryptalnego (wstawka). Słupki wskazują 25 μm dla (A) i 120 μm dla (B–D).

nagromadzenie eozynofilowych materiałów włóknistych w centrum takiego pęcherzyka. Niewielka liczba tych limfocytów zawiera bazofilowe ciałka inkluzyjne wewnątrzjądrowe o wielkości 5–7 μm, które obrzeżają chromatynę jądrową. Skrócenie kosmków jelitowych z zapadnięciem się architektury śluzówki wystąpiło w odcinku jelitowym kota rybackiego nr. 3 (rys. 1B). Niektóre krypty były poszerzone i zawierały eozynofilowy materiał białkowy i były wyłożone wyraźnie osłabionymi lub martwiczymi komórkami nabłonkowymi krypt. Wiele kryptalnych komórek nabłonkowych było pyknotycznych i kariorektycznych, a rzadkie komórki zawierały podobne bazofilowe ciałka inkluzyjne wewnątrzjądrowe. CPPV-1 IHC zastosowano do wykazania obecności wirusa w tkankach i do opisania patologicznej roli CPPV-1 w zmianach obserwowanych w rutynowych badaniach pośmiertnych. Znajdujące się w śledzionie komórki jednojądrzaste wykazały pozytywną intensywną immunoreaktywność CPPV-1 u wszystkich kotów rybackich (ryc. 1C). Immunoreaktywność była również obserwowana w większości cytoplazmy kryptalnych komórek nabłonka i była zgodna ze zmianami jelitowymi kota rybackiego nr. 3 (ryc. 1D). Warto zauważyć, że różne stopniekanaliki nerkowewakuolacja i wieloogniskowenerkowykrwotoki były widoczne u wszystkich kotów rybackich (ryc. 2A). NiektórenerkowyKomórki nabłonka kanalikowego były hipereozynofilowe z piknozą jądrową, podczas gdy rzadkie wakuolizowane komórki nabłonka kanalikowego wykazały pęcherzykowate jądra z marginesującą chromatyną jądrową (ryc. 2B). Dotyczącenerkazmian, przeprowadziliśmy dalej barwienie PAS, aby wykazać architekturę komórkowątkanka nerkowai wykluczyć niedotlenienie systemowe jako możliwą przyczynę tej zmiany. Barwienie PAS wykazałokanaliki nerkowebłony podstawne były nienaruszone (ryc. 2B, wstawka). W obrębienerkaskrawki, immunoznakowanie CPPV-1 było silne i często obserwowane w cytoplazmiekanaliki nerkowekomórki nabłonkowe (ryc. 2C) i komórki urotelialne wmiedniczka nerkowawe wszystkich przypadkach. Nie zaobserwowano dowodów reakcji immunogennej w kontrolach negatywnych (S1 Fig.). Nietypowa lokalizacja CPPV-1 wtkanki nerekujawnione przez IHC sugerowały, że powinniśmy przeprowadzić dodatkowe badania w celu potwierdzenia obecności i lokalizacji CPPV-1 wnerkaprzy użyciu ISH i TEM z techniką pop-off. Immunoreaktywność CPPV-1 ISH była dodatnia u wszystkich kotów rybackich i była rozproszona w jądrzenerkowykomórki nabłonka kanalików, w których obserwowano zmiany kanalikowe (ryc. 2D). W kontrolach negatywnych nie zaobserwowano reakcji (ryc. S1). Zgodnie z wynikami pozytywnych sygnałów immunologicznych ISH zlokalizowanych w jądrzenerkowyZaobserwowano komórki nabłonkowe, liczne małe, gęste elektronowo cząstki wirusowe, szacowane na około 19–22 nm średnicy. Były one skupione w jądrach tychkanaliki nerkowei komórki urotelialne (ryc. 3).

Wykrywanie CPPV kota rybackiego-1 i analiza genomowaPrzede wszystkim na wyekstrahowanych próbkach wirusowego kwasu nukleinowego przetestowano panele pan-rodziny PCR specyficzne dla różnych wirusów, w tym herpeswirusa, paramyksowirusa, pneumowirusa, kaliciwirusa, wirusa grypy, bocawirusa, koronawirusa i parwowirusa. Ujawniło to pozytywne wyniki tylko dla panparwowirusa PCR w jelicie, węźle chłonnym inerkapróbki trzech kotów rybackich. Odwrotnie, inne pan-PCR dla innych wykrytych wirusów były negatywne we wszystkich testowanych próbkach tkanek. Na podstawie wcześniej uzyskanych wyników dodatnich wyników PCR dla panparwowirusa u wszystkich kotów rybackich, dalej scharakteryzowaliśmy kodujące sekwencje genomu u dwóch kotów rybackich przy użyciu kilku par starterów w wyekstrahowane próbki kwasu nukleinowego uzyskane z jelita (przypadek nr 1) oraznerka(sprawa nr 3). Wykryto 4462 i 4430 par zasad kompletnych genomów kodujących dwóch szczepów kotów rybackich CPPV-1 i oznaczono je jako szczep 19ZP004-TH/2019 (sprawa nr 1, nr dostępu MW145540) i 19ZP{ {12}}TH/2019 (sprawa nr 3, nr akcesji MW145541), odpowiednio. Po analizie genetycznej pełne genomy kodujące ujawniły podobne genetycznie wyniki wśród szczepów CPPV-1 uzyskanych od kotów rybackich, wykazując, że te CPPV kotów rybackich-1 były FPV. Wywnioskowane porównanie aminokwasów między wariantami CPPV-1 i FPV kotów rybackich opisano w tabeli 1. Warto zauważyć, że FPV kota rybackiego ujawnił unikalne mutacje aminokwasów I566M i M569R w białku strukturalnym (VP1 i 2) , których nie wykryto w poprzednich wariantach CPPV-1.

Ryc. 2. Zakażenie CPPV-1 u kotów rybackich. Pokazowe H&E (A), barwienie PAS (B), CPPV-1 IHC (C) i hybrydyzacja in situ (ISH) (D) fotomikrografienerkaod kotów łowiących ryby. (A, B) Kot nr 3 wędkarski. (A) Wieloogniskowynerkowykrwotok zkanaliki nerkowewakuolacja. Niewiele komórek nabłonka kanalikowego było hipereozynofilowych z jądrami pyknotycznymi (wstawka, strzałki). (B)Cewki nerkowekomórki nabłonkowe wykazywały wakuolę cytoplazmatyczną, a jądra rzadkich komórek nabłonkowych są pęcherzykowe z marginesującą chromatyną jądrową. Barwienie PAS uwydatniło nienaruszoną błonę podstawną (wstawka). (C) Nr kat. wędkarski 2. Immunoreaktywność CPPV-1 IHC (ciemnobrązowy kolor) była rozproszona wkanaliki nerkowei często wykrywane w cytoplazmiekanaliki nerkowenabłonek (wstawka). (D) Kot nr 1 wędkarski. CPPV-1-immunoreaktywność ISH (czerwono-różowy kolor) obserwowano obficie wkanaliki nerkowe(gwiazdki) i zlokalizowane w jądrachkanaliki nerkowenabłonki (wstawka, strzałki). Słupki wskazują 50 μm dla (A, C) i 120 μm dla (B, D).

Analiza filogenetyczna i ewolucyjnaW celu porównania związku genetycznego między wykrytym CPPV kota rybackiego-1 a innymi wcześniej opublikowanymi genomami CPPV-1 przeprowadzono analizę filogenetyczną opartą na pełnej sekwencji kodującej genomu. Drzewo filogenetyczne ML wykazało, że większość FPV, MEV i CPV tworzy bardzo wyraźny klad wśród grup (ryc. 4). Dwa genomy CPPV-1 od badanych kotów rybackich (oznaczone czerwonymi trójkątami) zgrupowano razem z tą samą linią wcześniej opublikowanych sekwencji FPV uzyskanych od różnych żywicieli, potwierdzając, że uzyskana

Rys 3. Cząsteczki wirusa CPPV-1 w jądrzekanaliki nerkowekomórki nabłonkowe. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) z wykorzystaniem techniki pop-off. Ultrastrukturalna demonstracja skupiania się cząstek o dużej gęstości elektronowej (strzałki). Wielkość cząstek dwudziestościennych wynosiła 19–22 nm, znajdujących się w jądrzekanaliki nerkowekomórki nabłonkowe (wstawka). Skaluj paski, jak pokazano na rysunku.

CPPV dla kotów wędkarskich-1 to FPV. Wykryte genomy były zgrupowane razem i najbliżej spokrewnione z genomem FPV wykrytym u kotów domowych w Tajlandii (nr dostępu MN127780). Aby dokładniej wyjaśnić proces ewolucyjny wykrycia CPPV kota rybackiego-1, przeprowadzono kilka detekcji rekombinacji i analiz ewolucyjnych na zbiorze danych obejmującym 224 sekwencje pełnego genomu CPPV-1. Analiza rekombinacji wykazała, że ​​w sekwencjach CPPV-1 kota rybackiego nie wykryto żadnych zdarzeń rekombinacji. Drzewo ewolucyjne tych danych wykazywało dwa główne odrębne oddzielone klady (ryc. 5). Jeden klad obejmował FPV i MEV, a inny klad zawierał wszystkie sekwencje CPV. Całkowity wskaźnik ewolucji oszacowano na 1,08 × 10-4 podstawień/miejsce/rok (95% HPD: 1,95-2,87 × 10-4). Drzewo ewolucyjne wykazało, że sekwencje FPV kotów rybackich były skupione w tej samej linii FPV, co wyizolowane z Tajlandii. Dzielili ewolucję genetyczną z genomami FPV wykrytymi u kotów domowych w Chinach i mogą mieć to samo pochodzenie od około 1970 roku.

Dyskusja

Krążenie wariantów CPPV-1, które obejmują CPV i FPV, zidentyfikowano zarówno u domowych, jak i dzikich drapieżników. Podczas gdy śmiertelne zakażenie CPPV-1 u psów i kotów domowych jest powszechne, zakażenie to sporadycznie obserwuje się u dzikich drapieżników [46]. Kilka badań wykazało, że wiele dzikich drapieżników jest podatnych na infekcję CPPV-1, w tym dzikie kotowate, norki, wydry, skunksy, szopy pracze, lisy, wilki, kojoty, cywety i kuny [11, 19]. Zwłaszcza w przypadku rodzaju Prionailurus tylko koty lamparta zostały zakażone wariantami CPPV-1 [9]. W tym badaniu opisujemy naturalną infekcję FPV, członka CPPV-1, u dzikich kotów rybackich (Prionailurus viverrinus). Jest to pierwszy raport z opisem odrębnego rozmieszczenia wirusów i tropizmu wtkanki nerekco potwierdzono przez detekcję antygenową przy użyciu analizy ultrastruktury PCR, IHC, ISH i TEM.

Zaobserwowano międzygatunkowe przenoszenie wariantów CPPV-1 między drapieżnikami domowymi i dzikimi, a niektóre śmiertelne epidemie CPPV-1 są związane z rozprzestrzenianiem się patogenu między siedliskami [9, 11]. Ze względu na obecną utratę siedlisk dzikich dzikich kolonii migrują i dzielą siedliska ze zwierzętami domowymi, co doprowadziło do zwiększonego rozprzestrzeniania się patogenów między podatnymi zwierzętami. W tym badaniu odkryliśmy, że genomy kota rybackiego CPPV-1 mają wspólny wzór ewolucyjny ze szczepami FPV wykrytymi w

Ryc. 4. Topologia filogenetyczna ujawniająca genetyczny związek sekwencji kodujących pełnej długości między CPPV-1 kota rybackiego a innymi wariantami CPPV-1. Drzewo filogenetyczne pokazało, że sekwencje CPPV -1 kota rybackiego (wskazane przez czerwone trójkąty) były zgrupowane razem z genomami FPV z genomem najbardziej spokrewnionym z genomem FPV wykrytym u kota tajskiego (MN127780). Wskazano numery dostępu GenBank wcześniej opisanych sekwencji CPPV-1 stosowanych w tej analizie.

koty domowe w Tajlandii. Wyniki te pokazują podobny wzorzec ewolucyjny do szczepów FPV od wspólnych przodków izolowanych od kotów domowych w Chinach od lat 70. XX wieku. Wynik ten może sugerować możliwy dowód przenoszenia międzygatunkowego między kotami domowymi a kotami rybackimi lub koewolucję wariantów CPPV-1. Jednak ze względu na ograniczenie próbek pobranych od zwierząt wolno żyjących w tych samych siedliskach i niewielką liczbę badanych kotów rybackich, główny zbiornik CPPV-1 w tym badaniu nie mógł zostać zidentyfikowany i konieczne są dalsze badania . Chociaż kilka badań wykazało, że różne reszty aminokwasowe w genie kapsydu są związane zarówno ze zdolnością do infekowania nowych gospodarzy, jak i antygenowością CPPV-1 [18, 47], mutacja pojedynczego aminokwasu w pozycji 300 białko kapsydu (VP2) zostało opisane jako kluczowy wyznacznik dla wielu zakresów gospodarzy [48]. W tym badaniu wariant CPPV-1 uzyskany od kotów rybackich ujawnił te same wzorce aminokwasowe, co w sekwencjach FPV, z obecnością alaniny (A) jako kluczowej determinanty aminokwasowej w pozycji 300 kapsydu. białko kapsydu kota rybackiego z CPPV-1 ujawniło aminokwasy asparaginy (N) i alaniny (A) znajdujące się odpowiednio w pozycjach 564 i 568 (które są uważane za krytyczne dla replikacji FPV u gospodarza kota), miały 2 unikalne mutacje aminokwasów w pozycjach I566M i M569R. Te mutacje mogą odróżnić tego wirusa od wcześniej opisanych wariantów CPPV-1. Wcześniejsza analiza rekonstrukcji przodków wykazała, że ​​FPV może zarażać różnych drapieżników z niewielkimi zmianami w genie VP2 [49]. Dlatego też parwowirus podobny do FPV został wstępnie nazwany jako potencjalnie nowy wirus wykryty u kotów rybackich, co może wspierać pierwszą identyfikację tego wirusa u tego gatunku. Jednak niewielka liczba badanych kotów rybackich w porównaniu z niewielką liczbą innych sekwencji może nie dać ostatecznej interpretacji. Wymaga to dalszych badań, aby można było wyciągnąć bardziej konkretne wnioski.

Lokalizacje CPPV -1 kota rybackiego obserwowano w różnych tkankach, w tym w komórkach nabłonka jelitowego i komórkach limfoidalnych, gdzie najczęstsza lokalizacja tkankowa zakażenia CPPV-1 występuje u innych gatunków [20, 26, 50, 51 ]. Co ciekawe, ponieważ wstępne badanie wykrywania genomu wirusa za pomocą PCR i lokalizacji wirusa za pomocą IHC ujawniło odrębną lokalizację wirusa wtkanki nerek, przeprowadziliśmy barwienie PAS, aby zademonstrować architekturę komórkowątkanka nerekoraz aby wykluczyć niedotlenienie układowe jako możliwą przyczynę martwicy kanalików nerkowych. Barwienie PAS wykazało, że większość błon podstawnych kanalików była nienaruszona, co sugeruje, że zmiana ta może nie wynikać z niedotlenienia układowego [52]. Jednak inne przyczyny, takie jak martwica kanalików wywołanych toksynami, mogą powodować tę zmianę. Tak więc rola infekcji parwowirusem podobnym do FPV jest związana z:nerkazmiany nadal wymagają dalszych badań. Ponadto podjęliśmy próbę dalszego wyjaśnienia istniejącej lokalizacji wirusa wtkanka nerkowastosując ISH i TEM z techniką pop-off [37] w obszarach, w których wykryto immunoreaktywność CPPV-1 IHC. Cząstki o dużej gęstości elektronowej zaobserwowano w jądrzekanaliki nerkowekomórki nabłonkowe i komórki nabłonkowe, wspierające pozytywną immunoreaktywność in situ CPPV-1 wtkanka nerkowa. Koty zakażone FPV wydalają wirusa głównie z kałem, ale opisano obecność aktywnego wirusa w moczu [53, 54]. Ostatnie badania wykazały, że infekcja parwowirusem odgrywa rolę w:niewydolność nerek[55]. Jednak lokalizacja FPV i odpowiednika CPV wtkanka nerkowanie był wcześniej badany. Ponadto mysznerkaparwowirus (MKPV) okazał się wirusem nefrotropowym, wykazując powinowactwo do infekowania i lokalizacji wkanaliki nerkowekomórki nabłonkowe, w wyniku czegochoroby nerek [56, 57].

Na podstawie naszej wiedzy lokalizacja CPPV-1 wnerkinie został wcześniej opisany. Sugeruje to nowy opis unikalnej lokalizacji wirusa w tym gatunku lub nawet jeśli można ją znaleźć u kotów zakażonych FPV. To odkrycie może wspierać poprzednie badania, w których stwierdzono FPV w moczu. Unikalne zmiany patologiczne mogą być subiektywne i mogą być obserwowane jako infekcja u osobników. W związku z tym badanie na dużą skalę CPPV kota rybackiego-1 ułatwi ostateczną interpretację. Ponadto okazy, które zostały złożone głównie z martwych zwierząt i zostały już poddane autolizie pośmiertnej, nie nadają się do dalszego pobierania narządów od tych zwierząt. W związku z tym nie byliśmy w stanie określić lokalizacji wirusa w innych narządach. Przydatnym badaniem byłoby wyjaśnienie nietypowej lokalizacji wirusa CPPV kota rybackiego-1.

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

CPPV-1 został zidentyfikowany u różnych dzikich drapieżników i wiąże się z śmiertelnymi epidemiami. Negatywne dowody retrospektywnego wykrywania CPPV-1 w próbkach dzikich zwierząt w tym badaniu mogą wynikać z braku bliskiego kontaktu wśród podatnych zwierząt lub, z drugiej strony, przedłużonego przechowywania próbek, które wpływa na stabilność materiału genomowego. Nowatorska identyfikacja CPPV-1 związanego ze śmiertelną infekcją kotów rybackich w tym badaniu budzi obawy dotyczące nowej, potencjalnie zjadliwej choroby u tego wrażliwego zwierzęcia. Dlatego dalsze badania nad przenoszeniem CPPV-1 u kotów rybackich są niezbędne, aby zapobiec utracie innych podatnych gatunków zwierząt. W związku z tym należy położyć nacisk na strategie zapobiegania w celu opanowania infekcji CPPV-1, nie tylko u tego gatunku, ale także u wolno żyjących zwierząt domowych, które mogą służyć jako potencjalni żywiciele dla tego wirusa.