Potencjał neuroprotekcyjny izotiocyjanianów w modelu neuroinfammacji in vitro

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Millella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Otrzymano: 10 lipca 2020 r. / Przyjęto do druku: 25 października 2020 r. / Opublikowano online: 16 listopada 2020 r.

© Autorzy 2020

Funkcja proszku ziołowego Cistanche: ma bardzo dobrydziałanie neuroprotekcyjne

Abstrakcyjny

Wykazano, że izotiocyjaniany (ITC) obecne jako prekursory glukozynolanów w warzywach kapustnychprzeciwzapalny, działanie przeciwutleniające i przeciwrakowe. Tutaj porównaliśmy wpływ trzech różnych ITC na produkcję ROS i ekspresję metaloproteinazy macierzy (MMP)-2 i -9, które reprezentują ważne czynniki patogenetyczne różnych chorób neurologicznych. Pierwotne hodowle astrocytów szczura aktywowano LPS i jednocześnie traktowano różnymi dawkami izotiocyjanianu allilu (AITC), 2-izotiocyjanianu fenetylu (PEITC) i 2-sulforafanu (SFN). Wyniki pokazały, że SFN i PEITC były w stanie przeciwdziałać produkcji ROS indukowanej przez H2O2. Analiza zymograficzna supernatantów hodowli komórkowych wykazała, że ​​PEITC i SFN były najskuteczniejszymi inhibitorami MMP-9, podczas gdy tylko SFN znacząco hamował aktywność MMP-2. Analiza PCR wykazała, że ​​wszystkie użyte ITC znacząco hamowały ekspresję zarówno MMP-2, jak i MMP-9. Badanie szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) wykazało, że ITC modulują transkrypcję MMP poprzez hamowanie aktywności kinazy białkowej regulowanej pozakomórkowo (ERK). Wyniki tego badania sugerują, że ITC mogą być obiecującymi środkami nutraceutycznymi do zapobiegania i leczenia uzupełniającego chorób neurologicznych związanych z udziałem MMP.

Słowa kluczowePrzeciwutleniacz · Przeciwzapalny · Izotiocyjanian · Metaloproteinazy macierzy · Choroby neurodegeneracyjne

Wstęp

Zapalenie układu nerwowego to złożona reakcja na uszkodzenie mózgu, obejmująca kaskadę zdarzeń biochemicznych prowadzących do aktywacji komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Nieprawidłowa aktywacja astrocytów osłabia ich neuroprotekcyjną rolę, prowadząc do uwalniania mediatorów zapalnych, takich jak reaktywne formy tlenu (ROS), tlenek azotu (NO), cytokiny, chemokiny i metaloproteinazy macierzy

(MMP).

MMP to duża rodzina obojętnych endopeptydaz zależnych od Zn2 plus, których głównym celem są składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takie jak fibronektyna, kolagen, elastyna i laminina (Latronico i Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Wydział Nauk Biologicznych, Biotechnologii i Biofarmaceutyki, Uniwersytet w Bari "Aldo Moro",

Bari, Włochy

Wydział Nauk, Uniwersytet Basilicata, Potenza,

Włochy

W OUN MMP są zaangażowane w różne odpowiedzi fizjologiczne, takie jak morfogeneza, obrót i przebudowa ECM, embriogeneza i gojenie ran; jednak, gdy MMPs wymykają się mechanizmom regulacyjnym, stają się szkodliwe (Rosenberg 2009; Agrawal i in. 2008).

W związku z tym wiadomo, że zmiany w ekspresji i aktywności MMP są kluczowymi zdarzeniami patogenetycznymi w kilku zaburzeniach neurologicznych (Latronico i Liuzzi 2017; Mastroianni i Liuzzi 2007; Brkic i wsp. 2015). Dowody eksperymentalne sugerują, że wśród MMP żelatynazy A (MMP-2) i B (MMP-9) są szczególnie zaangażowane w zapalenie układu nerwowego, ponieważ ich regulacja w górę może naruszyć integralność bariery krew-mózg (BBB). Prowadzi to do zwiększonej rekrutacji i infiltracji immunologicznych komórek krwi obwodowej do miąższu mózgu, utrwalając proces zapalny, który jest przyczyną postępującej utraty neuronów i upośledzenia funkcji neuronów (Rivest 2009). Kilka badań in vitro i in vivo wykazało, że wytwarzanie ROS jest jednym z czynników związanych z regulacją w górę ekspresji MMP-9 w komórkach mózgowych poprzez mechanizmy zależne od szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) (Hsieh i Jang 2013).

Na podstawie tych dowodów jest jasne, że regulacja w dół czynników neurotoksycznych, prowadząca do zmniejszenia odpowiedzi neurozapalnych, może stanowić skuteczną strategię terapeutyczną zapobiegającą wystąpieniu lub łagodząc postęp chorób mózgu.

W ostatnich latach zainteresowanie biomedyczne w dziedzinie neurologii coraz bardziej koncentruje się na badaniach nad naturalnymi związkami zdolnymi do modulowania procesów związanych z odpowiedziami neurozapalnymi. W tym zakresie kilka badań wykazało, że związki fitochemiczne, takie jak polifenole, izotiocyjaniany (ITC) i inne, mają potencjał neuroprotekcyjny, który wynika również z ich zdolności do hamowania ekspresji MMP i przeciwdziałania produkcji ROS (Dinkova-Kostova i Kostov 2012; Liuzzi i wsp. 2007, 2011).

Izotiocyjaniany są metabolitami wytwarzanymi przez kilka roślin należących do rodziny Brassicaceae jako system obrony przed atakiem patogenów (Bones i Rossiter 2006). Pochodzą z enzymatycznej degradacji glukozynolanów (GSL) przez enzym mirozynazę. ITC są obecne w powszechnie spożywanych warzywach kapustnych, takich jak brokuły, brukselka, kapusta, rzepa, chrzan, kalarepa, musztarda, rzodkiewka, rzeżucha i jarmuż. Ich ilość w żywności jest bardzo zmienna i zależy od przetwarzania i przygotowania żywności.

Ostatnio wykazano, że ITC mają szereg efektów terapeutycznych, w tym działanie przeciwutleniające, przeciwbakteryjne, przeciwzapalne i chemoprewencyjne (Dufour i wsp. 2015; Marzocco i wsp. 2015).

Aktywność ochronna ITC odbywa się poprzez modulację różnych ścieżek sygnałowych zaangażowanych w detoksykację, zapalenie, apoptozę i regulację cyklu komórkowego. Kilka dowodów wskazuje, że właściwości przeciwnowotworowe i przeciwzapalne ITC można przypisać głównie ich zdolności do aktywacji szlaku czynnika 2 związanego z jądrowym czynnikiem erytroidalnym 2-(Nrf2). Nrf2 jest wrażliwym na redoks czynnikiem transkrypcyjnym, który w obecności czynników elektrofilowych i warunków stresu oksydacyjnego przemieszcza się do jądra, gdzie wiąże elementy odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE), indukując ekspresję genów cytoochronnych zaangażowanych w detoksykację i modulację warunków oksydacyjnych i procesy zapalne (Heiss i wsp. 2001). W związku z tym doniesiono, że ITC są zdolne do zwiększania zdolności antyoksydacyjnych komórek ludzkich poprzez indukowanie ekspresji enzymów detoksykujących fazy II i przez zwiększenie produkcji GSH (Wagner i wsp. 2010). Ponadto doniesiono o istnieniu zależności między Nrf2 a szlakiem czynnika jądrowego (NF)-κB, który prowadzi do modulacji stanu zapalnego (Sturm i Wagner 2017; Lee i Johnson 2004). W związku z tym różne eksperymentalne modele neurozapalenia in vitro i in vivo wykazały, że ITC są w stanie znacząco zmniejszyć translokację NF-κB, a w konsekwencji zahamować prozapalne cytokiny i MMP (Lee i wsp. 2015; Subedi i wsp. 2017).

W tym artykule zbadaliśmy wpływ trzech ITC, tj. izotiocyjanianu allilu (AITC), 2-izotiocyjanianu fenetylu (PEITC) i 2-sulforafanu (SFN) na uwalnianie MMP-2 i -9 jak również na produkcję ROS przez astrocyty aktywowane LPS. Nasze wyniki wykazały, że PEITC, SFN i AITC są w stanie hamować in vitro ekspresję MMP-9 i MMP-2 w astrocytach aktywowanych LPS i przeciwdziałać wytwarzaniu ROS indukowanemu przez H2O2. Ponadto wykazaliśmy, że ITC modulują nadekspresję MMP za pomocą mechanizmów związanych z hamowaniem aktywności pozakomórkowej regulowanej kinazy białkowej (ERK). Wyniki te sugerują, że dieta bogata w warzywa krzyżowe może mieć potencjalne korzyści w zapobieganiu i uzupełniającemu leczeniu chorób neurologicznych.

Materiały i metody

Chemikalia i odczynniki

Zmodyfikowaną przez Dulbecco pożywkę Eagle'a (DMEM), płodową surowicę bydlęcą (FBS), penicylinę i streptomycynę dostarczyła firma GIBCO (Paisley, Szkocja). Żelatyna, DNaza 1, poli-L-lizyna

(PLL), trypsyna, lipopolisacharyd (LPS), błękit trypanowy i 3-(4,5-dimetylotiazol-2-il)-2.5-bromek difenylotetrazoliowy (MTT ), izotiocyjanian allilu (AITC) [kod. 377 430, czystość 95 procent (HPLC)], 2-izotiocyjanian fenetylu (PEITC) [cod. 253,731, czystość 99 procent)], 2-Sulforafan (SFN) [cod. S6317, czystość Większa lub równa 95 procent (HPLC)] dostarczono z Sigma (St. Louis, MO, USA). Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) zakupiono z Calbiochem. Białka standardowe i R-250 Coomassie Brilliant Blue pochodziły z Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Przeciwciała przeciw glejowemu fibrylarnemu białku kwasowemu (GFAP) (RRID: AB_2294571) zakupiono od firmy Serotec (Oxford, UK). Przeciwciała przeciwko kinazom białkowym regulowanym pozakomórkowo (ERK) 1/2 i fosforylowanej ERK 1/2 (p-ERK 1/2) pochodziły z Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membrany Hybond-P PVDF, ulepszony system analizy chemiluminescencji (ECL) Western Blotting i przeciwciała drugorzędowe anty-mysie HRP pochodziły z firmy GE

Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze (Little Chalfont, Buckinghamshire,

Wielka Brytania). Pary starterów specyficzne dla MMP-2, MMP-9 i 18S rRNA pochodziły z Sigma Genosys (Cambs, Wielka Brytania). Minizestaw RNeasy i zestaw QuantiTect Reverse Transscription zakupiono w Qiagen (Valencia, CA, USA). Odczynniki Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix do PCR zakupiono od Lucigen Corporation (Middleton, WI, USA).

Oświadczenie etyczne

Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zaleceniami NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals oraz za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie w Bari we Włoszech (numer zezwolenia: 23-98- A).

Przygotowanie kultur astrocytów

Astrocyty przygotowano z tkanek kory nowej {{0}}jednodniowych szczurów Wistar (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Włochy). Do przygotowania astrocytów wykorzystano 6 miotów po 12 młodych, każdej z płci. Zwierzęta uśmiercono przez wystawienie na działanie dwutlenku węgla (CO2) i uśmiercono przez szybką dekapitację. Tkanki kory nowej wycięto i zastosowano do oczyszczania pierwotnych hodowli komórek glejowych zgodnie z metodą opisaną przez Latronico i in. (2018). Pokrótce, po sekcji, mózgi szczurów były pozbawione opon mózgowo-rdzeniowych i naczyń krwionośnych, mechanicznie rozdrabniane i trawione 00,25% trypsyną w obecności 00,01% DNazy. Po odwirowaniu i ocenie żywotności komórek, komórki umieszczono w kolbach powlekanych PLL (75 cm2) przy gęstości 1,5 × 107 komórek/kolbę w DMEM, 10% FBS, 100 IU ml -1 penicyliny, 100 µg ml -1 streptomycyny , i utrzymywany w temperaturze 37 stopni w 5% CO2. Po 7 dniach kolby wytrząsano w celu usunięcia oligodendrocytów i mikrogleju. Czystość astrocytów otrzymanych przez trypsynizację (0,25 procent trypsyny/0,02 procent EDTA) oceniano przez immunobarwienie na GFAP.

Leczenie astrocytów aktywowanych LPS za pomocą izotiocyjanianu allilu, izotiocyjanianu fenetylu lub 2-sulforafanu

Zlewne astrocyty, wysiane na 96-studzienkowych płytkach, stymulowano 10 µg ml -1 LPS i jednocześnie traktowano różnymi stężeniami izotiocyjanianu allilu (AITC), 2-izotiocyjanianu fenetylu (PEITC) lub 2-sulforafanu (SFN) w DMEM bez surowicy. Astrocyty w wolnych od surowicy DMEM i astrocytach aktywowanych LPS stanowiły odpowiednio kontrole negatywną i pozytywną. Ponadto, ponieważ roztwory podstawowe AITC (100 µM), PEITC (67 µM) i SFN (56,4 µM) wykonano w DMSO, krzywa dawka-odpowiedź dla DMSO, rozcieńczonego w pożywce hodowlanej w tym samym stężeniu rozpuszczalnika obecnym w analizowane próbki przeprowadzono w celu oszacowania toksyczności związku. Po 20 godzinach inkubacji w 37°C, 5% CO2 supernatanty zebrano i przechowywano w -20 stopniu do użycia, podczas gdy komórki poddano testowi MTT w celu oceny żywotności komórek.

Test żywotności komórek MTT

Cytotoksyczność AITC, PEITC i SFN na astrocytach wykryto za pomocą MTT [{{0}}(4,5-dimetylotiazol-2-yl)- 2,{{5 }} bromek difenylotetrazoliowy]. Test ten opiera się na redukcji MTT przez mitochondrialną dehydrogenazę bursztynianową w żywych komórkach do nierozpuszczalnego niebieskiego produktu formazanu, który można zmierzyć spektrofotometrycznie. W skrócie, po traktowaniu przez 20 godzin AITC, PEITC lub SFN, pożywkę hodowlaną usunięto i komórki załadowano 0,5 mg mL-1 MTT. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37°C usunięto 5% pożywkę CO2 i kryształy formazanu w komórkach rozpuszczono w 90% etanolu. Po wytrząsaniu płytek przez 15 min w celu uzyskania całkowitej solubilizacji kryształów, ilość produktu formazanu oznaczano metodą absorbancji optycznej przy 560 nm z referencyjną długością fali 690 nm. Żywotność komórek wyrażono jako procent kontroli (CTRL), reprezentowany przez nietraktowane komórki, który ustalono na 100%. Dla każdego związku otrzymano krzywą dawka-odpowiedź żywotności komórek.

Wykrywanie reaktywnych form tlenu

Wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) przeprowadzono przez załadowanie astrocytów 10 µM dioctanu 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w DMEM bez czerwieni fenolowej w temperaturze 37 stopni przez 30 min. Następnie DCFH-DA usunięto ze studzienek i komórki traktowano przez 1 h AITC (400 μM), PEITC (10 μM) lub SFN (25 μM) w DMEM bez czerwieni fenolowej w obecności H2O2 w końcowym stężeniu 100 μM . Komórki traktowane tylko DCFH-DA lub H2O2 stanowiły odpowiednio kontrolę negatywną (CTRL) i pozytywną (H2O2). Po inkubacji komórki przepłukano PBS i poddano lizie

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5%, pH 7,5,

następnie odwirowano przy 10,000 xg, 4 stopnie przez 10 min. Zebrano supernatanty i przeprowadzono ich analizę spektrofluorymetryczną przy 525 nm przy wzbudzeniu przy 485 nm. Wyniki znormalizowano do całkowitej zawartości białka, a produkcję ROS wyrażono jako względny procent intensywności fotoluminescencji (PL) w porównaniu z kontrolą pozytywną.

Wykrywanie żelatynaz

Aktywność żelatynazy w supernatantach komórkowych (SN) wykryto za pomocą analizy zymograficznej, jak opisali Latronico i in. (2013). W skrócie, ilość SN odpowiadającą około 10 µg wszystkich białek rozpuszczono w 30 µl buforu do próbek Laemmli bez -merkaptoetanolu. Próbki analizowano w 7,5% żelu poliakryloamidowym skopolimeryzowanym z 0,1% (wag./obj.) żelatyny. Po przebiegu elektroforetycznym żele przepłukano dwukrotnie 2,5-procentowym Tritonem X-100/10 mM CaCl2 w 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni w 1% Tritonie X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Żele wybarwiono brylantowym błękitem Coomassie R-250 i odbarwiono w metanolu/kwasie octowym/H2O (4:1:5 obj./obj.). Aktywność żelatynazy uwidoczniono jako wyraźne pasmo trawienia na niebieskim tle żelu i oznaczono ilościowo za pomocą komputerowej densytometrycznej analizy obrazu przy użyciu oprogramowania Image Lab™ (Bio-Rad Laboratories). Żelatynaza

aktywność wyrażono jako gęstość optyczną (OD) × mm2, reprezentującą obszar skanowania pod krzywymi, który uwzględnia zarówno jasność, jak i szerokość strefy lizy substratu. Dane wyrażono stosując następujące równanie: procent inhibicji=[100 – (OD próbka/OD kontrola pozytywna) × 100].

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT‑PCR)

Astrocyty, wysiane na 6-studzienkowych płytkach, aktywowano LPS (10 µg mL−1) i jednocześnie traktowano ITC w maksymalnym nietoksycznym stężeniu. Po 20 godzinach inkubacji całkowity RNA wyekstrahowano z astrocytów przy użyciu minizestawu Qiagen RNeasy zgodnie z instrukcjami producenta. Komplementarny DNA (cDNA) zsyntetyzowano z 500 ng RNA przy użyciu zestawu QuantiTect Reverse Transcription zgodnie z instrukcjami producenta. W sumie 25 ng produktów odwrotnej transkrypcji użyto do amplifikacji fragmentu 591 bp przy użyciu specyficznych starterów (sensowny 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antysensowny 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) dla szczurzej sekwencji MMP-2 i fragmentu 541 bp przy użyciu specyficznych starterów (sensowne 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; antysensowne 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) dla sekwencji szczurzej MMP-9. Równolegle przeprowadzono amplifikację fragmentu 308 pz szczurzego 18S rRNA (sensowny 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antysensowny 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), względnie niezmienny wewnętrzny gen odniesienia . Zestawy starterów, już zwalidowane w innych badaniach (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) specyficznie rozpoznają tylko geny będące przedmiotem zainteresowania, na co wskazuje amplifikacja pojedynczego prążka o oczekiwanej wielkości PCR produkty. Amplifikację PCR przeprowadzono przez 25 cykli , z których każdy składał się z denaturacji w 94 stopniu , przyłączania w 59 stopniach i wydłużania w 72 stopniach . Po amplifikacji produkty analizowano w 1,5% żelach agarozowych. Po analizie densytometrycznej żeli, amplifikację docelowych genów znormalizowano do ekspresji 18S rRNA, a wyniki wyrażono jako procent hamowania w porównaniu z kontrolą pozytywną, jak podano dla ilościowego oznaczenia żelatynazy.

Wykrywanie fosforylacji ERK 1/2 za pomocą analizy Western blot

ERK 1/2 wykryto za pomocą analizy immunoblot, jak opisano w Latronico i in. (2018). Krótko mówiąc, konfluentna podstawowa

astrocyty wysiane w {{0}}płytkach dołkowych, pozostawione w stanie spoczynku w pożywce bez surowicy przez 24 h, były wstępnie traktowane przez 1 h AITC (400 μM), PEITC (10 μM), lub SFN (25 μM) w DMEM bez czerwieni fenolowej. Po stymulacji przez 2 godziny za pomocą 10 μg ml−1 LPS, komórki poddano lizie 20 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM pirofosforanem sodu, 1 mM glicerofosforanem 1 procent Triton X-100, 1 mM fuorek fenylometylosulfonylu, 20 ug/ml aprotyniny, 1 mM EGTA, 1 mM fluorek Na, 1 mM Na3V04, pH 7,5. Sześćdziesiąt ug wszystkich białek z każdej próbki rozdzielono w 10 procentowej elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym, a następnie białka poddano immunoblottingowi na membranach z difluorku winylidenu. Po zablokowaniu przez noc w 4°C 0,05% Tween 20, 1% mleka, 1% albuminy surowicy bydlęcej w 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), membrany badano przez noc w 4°C monoklonalnym anty-p- Przeciwciało ERK 1/2 (1:500). Następnie membrany przemyto trzykrotnie 0,05% Tween 20 w soli fizjologicznej buforowanej Tris, sondowano drugorzędowym przeciwciałem przeciw peroksydazie chrzanowej myszy (1:20, 000) przez 2-h w 24 stopniach i wykrywano o wzmocnionej chemiluminescencji. Aby ocenić całkowitą ilość ERK, błony usunięto i inkubowano z przeciwciałem specyficznym dla niefosforylowanej ERK 1/2 (1:500). Intensywność prążków określono ilościowo za pomocą skanowania densytometrycznego blotów, a poziomy fosforylacji ERK 1/2 znormalizowano do niefosforylowanego ERK 1/2 i wyrażono jako procent w porównaniu z kontrolą pozytywną (astrocyty potraktowane LPS), zgodnie z następujące równanie:

procent pERK 1/2=(próbka OD/kontrola pozytywna OD) × 100.

Analiza statystyczna

Analizę danych przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Dane wyrażono jako wartości średnie ± SD. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Dunnetta wielokrotnego porównania.

Wyniki

Wpływ związków izotiocyjanianowych na żywotność astrocytów

Przeprowadzono wstępne doświadczenia w celu oceny cytotoksyczności AITC, PEITC lub SFN. W tym celu oczyszczone astrocyty traktowano przez 20 godzin związkami ITC w stężeniach w zakresie od 5 do 400 µM lub DMSO rozcieńczonym w pożywce hodowlanej, jak opisano w części dotyczącej metody. Jak pokazano na Rys. 1, DMSO nie był toksyczny we wszystkich stosowanych stężeniach, które odpowiadają badanym roztworom ITC. Wśród badanych ITC, AITC

Rys. 1 Żywotność komórek astrocytów traktowanych związkami izotiocyjanianu. Zlewne pierwotne astrocyty traktowano przez 20 godzin izotiocyjanianem allilu (AITC), 2-izotiocyjanianem fenetylu (PEITC) lub 2-sulforafanem (SFN) we wskazanych stężeniach, a następnie poddano testowi MTT. Ponadto, ponieważ jest on w roztworach podstawowych rozpuszczonych w dimetylosulfotlenku (DMSO), w każdym eksperymencie przeprowadzono krzywą odpowiedzi na dawkę dla DMSO, rozcieńczonego w pożywce hodowlanej przy tym samym stężeniu rozpuszczalnika (w procentach) obecnym w próbkach ITC, aby uzyskać wiarygodne oszacowanie toksyczności ITC. Kontrola (CTRL) została

pachnące z nietraktowanych astrocytów w DMEM bez surowicy. Wykresy przedstawiają krzywe dawka-odpowiedź dotyczące żywotności komórek, wyrażone jako procent przeżycia komórek w porównaniu z kontrolą. Jako maksymalne nietoksyczne stężenia wybrano dawki związków, które określały żywotność komórek powyżej 60 procent. Wartości są średnią ± SD z n=3 eksperymentów przeprowadzonych na różnych populacjach komórek. Mikrofotografie przedstawiają reprezentatywne wyniki morfologii komórek obserwowane pod mikroskopem z kontrastem fazowym (powiększenie 50x) po traktowaniu różnymi związkami

był mniej toksyczny dla astrocytów. W szczególności AITC nie był toksyczny dla komórek do 400 µM, podczas gdy PEITC i SFN były toksyczne w stężeniach odpowiednio powyżej 10 i 25 µM. Obserwacja mikroskopowa potwierdziła wyniki testu MTT wykazujące, że przy toksycznych stężeniach PEITC i SFN liczba astrocytów była zmniejszona, a te, które pozostały, wykazywały zmiany cytotoksyczne w swojej cytoplazmie.

Ochronny wpływ związków ITC na produkcję ROS w astrocytach poddanych działaniu nadtlenku wodoru

Aby ocenić ochronny wpływ ITC na stres oksydacyjny, astrocyty wstępnie potraktowano PEITC, AITC i SFN w maksymalnym nietoksycznym stężeniu, a następnie stymulowano H2O2. Wewnątrzkomórkowe wytwarzanie ROS, indukowane przez H2O2, badano za pomocą DCFH-DA. Jak pokazano na rys. 2, ekspozycja na H2O2 wzmocniony sygnał fluorescencyjny w

Rys. 2 Wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) w astrocytach traktowanych ITC. Obecność ROS oznaczano mierząc zmiany sygnału fluorescencyjnego 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFA), jak opisano w rozdziale Materiały i Metody. Astrocyty, wysiane na 6-studzienkowych płytkach, wstępnie traktowano przez 30 min DCFA, a następnie traktowano przez 1 h 10 μM PEITC, 400 μM AITC lub 25 μM SFN w obecności H2O2 w końcowym stężeniu 100 μM . Astrocyty traktowane samym DCFA (CTRL) lub 100 μM H2O2 stanowiły odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną. Sygnał fluorescencyjny wykryty w lizatach komórkowych mierzono fluorometrem przy 525 nm przy wzbudzeniu przy 485 nm. Wytwarzanie ROS wyrażono jako procent (procent) intensywności fotoluminescencji (PL) w porównaniu z kontrolą pozytywną. Wartości są średnią ± SD z n=3 eksperymentów przeprowadzonych na różnych populacjach komórek. Statystycznie istotny spadek w porównaniu z H2O2 zaznaczono gwiazdkami (jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test post hoc Dunneta; *p <>

astrocyty w porównaniu z kontrolą (CTRL). Jak wynika ze zmniejszenia intensywności fluorescencji DCF, wstępne traktowanie astrocytów związkami ITC przeciwdziałało generowaniu ROS indukowanemu przez H2O2. Wśród testowanych ITC tylko PEITC i SFN były w stanie znacząco zmniejszyć produkcję ROS odpowiednio o około 20 i 24 procent w porównaniu z kontrolą pozytywną (H2O2).

Związki izotiocyjanianowe hamują poziomy MMP‑2 i MMP‑9 w astrocytach aktywowanych LPS

Wpływ związków ITC na poziomy MMP-2 i MMP-9 oceniano na astrocytach aktywowanych LPS, o którym wiadomo, że indukuje ekspresję żelatynaz (Gottschall i Deb 1996) i jednocześnie leczonych AITC, PEITC lub SFN w zakresie stężeń, które nie były toksyczne dla komórek. Jak pokazano na Fig. 3a, na żelu obecne były dwa wyraźne prążki trawienia o masie 72 i 92 kDa, odpowiadające odpowiednio MMP-2 i MMP-9. Aktywacja astrocytów LPS zwiększała poziomy MMP-2 i indukowała syntezę MMP-9. Leczenie AITC (ryc. 3b), PEITC (ryc. 3c) lub SFN (ryc. 3d) określało zależne od dawki

zmniejszenie poziomów MMP-9, które różniły się w zależności od użytego związku. W szczególności, wśród stosowanych ITC, SFN był najskuteczniejszy w hamowaniu MMP-9, ponieważ określał 70% inhibicji przy dawce 10 μM i 100% inhibicji przy dawce 25 μM. Ponadto tylko SFN w maksymalnym nietoksycznym stężeniu była w stanie znacząco hamować MMP-2 (Fig. 2d).

Związki izotiocyjanianowe hamują ekspresję genów MMP‑2 i MMP‑9 w astrocytach aktywowanych LPS

Aby określić, czy badane związki ITC były zdolne do hamowania ekspresji MMP-2 i MMP-9, przeprowadzono RT-PCR na astrocytach aktywowanych LPS traktowanych maksymalnym nietoksycznym stężeniem ITC. Jak pokazano na reprezentatywnych żelach na Fig. 4a, traktowanie astrocytów aktywowanych LPS poszczególnymi ITC było w stanie przeciwdziałać zwiększonej ekspresji mRNA MMP-2 i MMP-9. Jak pokazano na Fig. 4b, ilościowa analiza wyników wykazała, że ​​przy maksymalnym nietoksycznym stężeniu, związki ITC wykazywały statystycznie istotne hamowanie ekspresji MMP-2 i MMP-9 w porównaniu do kontroli pozytywnej (LPS). W szczególności PEITC i SFN wywierają taki sam procent hamowania MMP-2 (85 procent) i MMP-9 (100 procent), podczas gdy AITC był mniej skuteczny niż PEITC i SFN w hamowaniu MMP{{17} } (65 procent ) i MMP-9 (90 procent ).

ERK 1/2 bierze udział w hamowaniu ekspresji MMP przez ITC

Ponieważ ERK 1/2 jest głównym szlakiem transdukcji sygnałowej zaangażowanym w regulację ekspresji MMP-2 i MMP-9 w astrocytach aktywowanych LPS (Lee et al. 2003), wpływ związków ITC na testowano aktywację pozakomórkowych regulowanych kinaz białkowych (ERK) 1/2.

Jak pokazano na Fig. 5, LPS indukował statystycznie istotny wzrost poziomów fosforylowanej ERK 1/2 (p-ERK), któremu przeciwdziałało wstępne traktowanie związkami ITC.

Dyskusja

Powszechnie uważa się, że główne strategie obrony przed wieloma chorobami polegają głównie na unikaniu czynników ryzyka i przyjmowaniu prawidłowego stylu życia. Istnieje wiele dowodów naukowych potwierdzających hipotezę, że niektóre naturalne metabolity, zwykle wytwarzane przez różne rodzaje owoców i warzyw, są w stanie modulować zjawiska patologiczne, takie jak rak, choroby neurologiczne i inne choroby wieloczynnikowe. W tym scenariuszu izotiocyjaniany (ITC) wzbudziły duże zainteresowanie ze względu na ich działanie przeciwgrzybicze, przeciwbakteryjne,

Rys. 3 Wpływ związków izotiocyjanianowych na poziomy MMP-2 i MMP-9 w astrocytach aktywowanych LPS. W a przedstawiono reprezentatywny żel zymograficzny analizy supernatantów hodowli z astrocytów aktywowanych LPS (10 ug ml-1) i jednocześnie traktowanych przez 20 godzin AITC, PEITC lub SFN we wskazanych stężeniach (μM). Kontrole ujemne i dodatnie uzyskano z niestymulowanych i nietraktowanych astrocytów w pożywce bez surowicy (CTRL) i LPS-

odpowiednio aktywowane komórki (LPS). Histogramy b–d reprezentują wyniki (średnia ± SD) n {{0}} eksperymentów przeprowadzonych na różnych populacjach komórek, wyrażone jako procent hamowania MMP w porównaniu z LPS, obliczony po densytometrii skaningowej i komputerowej analizie żeli . Statystycznie istotny spadek w porównaniu z LPS zaznaczono gwiazdkami (jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test post hoc Dunneta; *p < 00,05,="" **p=""><>

biologiczne właściwości przeciwrakowe, antymutagenne, przeciwutleniające i przeciwzapalne (Dufour i wsp. 2015; Marzocco i wsp. 2015; Vig i wsp., 2009; Talalay i Fahey 2001). Izotiocyjaniany powstają w wyniku enzymatycznej degradacji glukozynolanów (GSL), które są metabolitami wtórnymi obecnymi w 15 rodzinach botanicznych rzędu Capparales i bardzo licznie występują w rodzinie Brassicaceae (Fahey i wsp. 2001). GSL są hydrolizowane przez mirozynazę (-tioglukozydoglukohydrolaza e; EC 3.2.3.147) w różnych składnikach, takich jak ITC, azotyny, tiocyjaniany, epitionitryle, SFGate, glukoza i oksazolidyny (Li i Kushad 2005). Chociaż ITC były szeroko badane w dziedzinie chemioterapii (Grundemann i Huber 2018), przeprowadzono niewiele badań dotyczących ich potencjału terapeutycznego w chorobach neurologicznych, pomimo wykazania zdolności SFN i AITC do przekraczania BBB i gromadzenia się w miąższu mózgu (Clarke i in. 2011; Jazwa i in. 2011; Zhang 2010). W tym artykule porównaliśmy efekty trzech ITC,

obecne w kilku powszechnie spożywanych warzywach krzyżowych, na wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i ekspresję metaloproteinazy macierzy (MMP) w modelu in vitro neurozapalenia reprezentowanego przez astrocyty aktywowane lipopolisacharydem (LPS) lub traktowane H2O2. Astrocyty, najliczniejszy typ komórek glejowych OUN, odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy mózgu i są cechami charakterystycznymi różnych chorób neurologicznych (Cekanaviciute i Buckwalter 2016; Colombo i Farina 2016). Uważa się je za kluczowe regulatory wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, a ich reakcja na szkodliwe czynniki, takie jak stres oksydacyjny, może nasilać reakcje zapalne i uszkodzenia tkanek lub sprzyjać naprawie tkanek. Powszechnie wiadomo, że aktywowane astrocyty wytwarzają czynniki neurotoksyczne, takie jak MMP, które odgrywają kluczową rolę w promowaniu zapalenia nerwów i postępującej utraty neuronów w chorobach neurologicznych (Hsieh i Yang 2013). Dlatego modulacja

Rys. 4 Wpływ związków ITC na ekspresję MMP-2 i MMP-9 w astrocytach aktywowanych LPS. Astrocyty, wysiane na 6-studzienkowych płytkach, aktywowano LPS (10 µg mL-1) i jednocześnie traktowano przez 20 godzin AITC (400 µM), PEITC (10 µM) lub SFN (25 µM), a następnie poddano RT-PCR. Reprezentatywne żele agarozowe wyrażające ekspresję MMP-2 i MMP-9 przedstawiono w (a). Histogramy w (b) przedstawiają wyniki (średnia ± SD) n=3 eksperymentów przeprowadzonych na różnych komórkach

zdarzenia, które występują po aktywacji astrocytów, mogą złagodzić odpowiedź zapalną i uszkodzenie neuronów.

Wyniki tego badania wykazały, że wśród badanych ITC AITC była mniej toksyczna, ponieważ nie powodowała żadnego zmniejszenia żywotności komórek we wszystkich stosowanych stężeniach. W przeciwieństwie do tego, co zaobserwowali inni autorzy na różnych liniach komórek glejowych, PEITC i SFN wykazywały toksyczność komórkową odpowiednio w stężeniach większych niż 10 i 25 µM (Lee i wsp. 2015; Eren i wsp. 2018; Su i wsp. 2015).

W aktualnej literaturze naukowej istnieje wiele kontrowersyjnych danych dotyczących mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wpływu ITC na żywotność komórek. W związku z tym większość badań sugeruje, że ITC hamują apoptozę indukującą wzrost komórek, zatrzymanie cyklu komórkowego, wytwarzanie ROS w komórkach nowotworowych, ale nie w normalnych (Fofaria i wsp. 2015; Qin i al. 2018; Sestili i Fimognari 2015). Odkryliśmy, że SFN i PEITC, ale nie AITC, pełnią rolę ochronną przed stresem oksydacyjnym w astrocytach, rzeczywiście przy maksymalnych nietoksycznych stężeniach były w stanie przeciwdziałać wytwarzaniu ROS indukowanemu ekspozycją na H2O2. OUN jest szczególnie podatny na stres oksydacyjny ze względu na wysokie zużycie tlenu, słabe systemy antyoksydacyjne oraz wysoką zawartość biomakrocząsteczek podatnych na utlenianie. Uważa się, że wytwarzanie ROS i uszkodzenia oksydacyjne są zaangażowane w patogenezę zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i stwardnienie rozsiane (MS) (Lee et al. 2015). Dlatego, chociaż w naszych eksperymentach in vitro SFN i PEITC w umiarkowanym stopniu przeciwdziałały wytwarzaniu ROS, możemy przypuszczać, że in vivo przedłużone podawanie ITC może prowadzić do bardziej znaczącego zmniejszenia ROS, co z czasem może skutkować znaczącym dla populacji wyrażonych jako procent inhibicji MMP w porównaniu z kontrolą dodatnią (LPS), obliczone po skaningowej densytometrii i komputerowej analizie żeli. Statystycznie istotny spadek ekspresji MMP-2 i MMP-9 w porównaniu z LPS zaznaczono gwiazdkami (jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test post hoc Dunneta; *p <>

profilaktyka i modulacja chorób mózgu. ROS działa jako krytyczna cząsteczka sygnalizacyjna, która wyzwala kaskadę odpowiedzi zapalnej w OUN. Pod tym względem dobrze wiadomo, że ROS regulują ekspresję wielu genów zaangażowanych w zapalenie układu nerwowego poprzez aktywację prozapalnych czynników transkrypcyjnych, takich jak czynnik jądrowy-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana i wsp. 2019). W tym scenariuszu ważną rolę odgrywają MMPs, których ekspresja jest podwyższona przez ROS poprzez aktywację NF-κB (Yan i Boyd 2007).

Ponieważ dysregulacja MMP przyczynia się do patogenezy wielu chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych, ich hamowanie stanowi ważną strategię terapeutyczną. Z tego powodu w ostatnim dziesięcioleciu coraz większe zainteresowanie koncentrowało się na potencjale leków i naturalnych związków w hamowaniu MMP. Liczne badania in vitro wykazały, że działanie przeciwzapalne i antyoksydacyjne kilku leków i związków bioaktywnych obecnych w warzywach i organizmach morskich jest związane z ich zdolnością do hamowania ekspresji MMP (Latronico i wsp. 2016, 2018; Di Bari i wsp. 2015). W tym badaniu wykazaliśmy, że spośród testowanych ITC, SFN i PEITC były najskuteczniejsze w hamowaniu poziomów i ekspresji MMP-2 i MMP-9 w astrocytach aktywowanych LPS. W innych badaniach in vivo i in vitro donoszono o hamowaniu MMP przez ITC. W szczególności Li i in. (2013) wykazali, że SFN jest w stanie łagodzić uszkodzenie BBB poprzez hamowanie ekspresji MMP-9 w modelu in vivo eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Inni autorzy stwierdzili, że SFN jest w stanie osłabić ekspresję MMP-9 po uszkodzeniu rdzenia kręgowego u myszy (Mao i wsp. 2010a). Ponadto badania in vitro wykazały, że tłumienie przez ITC migracji komórek i

Fig. 5 Kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym 1/2 (ERK 1/2) bierze udział w hamowaniu ekspresji MMP przez związki ITC. Reprezentatywne filmy autoradiograficzne z analizy Western blot lizatów z astrocytów wstępnie traktowanych przez 1 godzinę AITC (400 μM), PEITC (10 μM) lub SFN (25 μM), a następnie aktywowanych przez 2 godziny LPS (10 μg mL{{ 13}}). Nietraktowane i niestymulowane komórki stanowią kontrolę ujemną (CTRL). Histogram w (b) przedstawia inwazję poziomów pERK1/2 w komórkach glejaka C6 związaną z hamowaniem ekspresji MMP-9 za pośrednictwem NF-κB (Lee et al. 2015).

Mechanizmy molekularne, dzięki którym ITC hamują MMP są niejasne i nie ma badań oceniających właściwości przeciwutleniające i przeciwzapalne ITC w pierwotnych hodowlach astrocytów. Kilka badań potwierdza hipotezę, że hamujący wpływ ITC jest konsekwencją ich zdolności do blokowania NF-κB przez szlak sygnałowy Nrf2. Pod tym względem badanie in vivo wykazało, że myszy z nokautem Nrf2 były bardziej podatne na odpowiedź zapalną rdzenia kręgowego, w której pośredniczy NF-κB oraz na zwiększoną ekspresję genów zależnych od NFκB, w tym MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Chociaż szlaki NF-κB i Nrf2 mogą ze sobą współgrać, wykazaliśmy, że regulacja NF-κB zachodzi również poprzez modulację mechanizmów molekularnych, które są niezależne od Nrf2. Rzeczywiście, odkryliśmy, że AITC, PEITC i SFN hamowały aktywację ERK1/2, która odgrywa kluczową rolę w kaskadzie zdarzeń transdukcji sygnału, które ostatecznie regulują transkrypcję genu MMP.

Jednak dowody eksperymentalne, że SFN w maksymalnym nietoksycznym stężeniu całkowicie hamowały zarówno ekspresję MMP-9, jak i poziomy, podczas gdy AITC i PEITC hamowały w maksymalnym stopniu ekspresję MMP-9, ale tylko obniżały MMP{{3} } do około 50 procent, może sugerować, że związki te modulują transkrypcję MMP-9 za pomocą różnych mechanizmów działania. W związku z tym doniesiono, że SFN, oprócz hamowania wywołanej przez LPS aktywacji NF-κB, zakłóca wiązanie LPS do receptora TLR4 (Koo i wsp. 2013). Hamujący wpływ SFN na TLR4 może zapobiegać aktywacji astrocytów przez LPS, a to może skutkować wcześniejszym hamowaniem ekspresji MMP-9 z wynikającym z tego brakiem produkcji MMP-9.

uzyskany po skanowaniu densytometrycznym filmów autoradiograficznych i normalizacji do niefosforylowanego ERK 1/2. Dane reprezentują średnie ± SD z n=3 eksperymentów przeprowadzonych na różnych populacjach komórek. Gwiazdki reprezentują wartości statystycznie różne od kontroli pozytywnej (astrocyty aktywowane LPS), która została ustawiona na 100 procent (jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie test post hoc wielokrotnych porównań Dunnetta; *p <>

Wnioski

Podsumowując, nasze dane wskazują, że leczenie astrocytów ITC zmniejsza powstawanie ROS i hamuje uwalnianie MMP-2 i MMP-9, dostarczając nowych informacji na temat przeciwutleniających i przeciwzapalnych właściwości ITC na komórkach glejowych. komórki. Wyniki te sugerują, że ITC mogą być obiecującymi środkami nutraceutycznymi w opracowywaniu interwencji związanych z odżywianiem nerwowym, opartych na stosowaniu zdrowej żywności, w profilaktyce i uzupełniającym leczeniu chorób neurologicznych.

Finansowanie Finansowanie otwartego dostępu zapewniane przez Università Degli Studi di Bari Aldo Moro w ramach umowy CRUI-CARE.

Zgodność ze standardami etycznymi

Konflikt interesów Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Otwarty dostęp Ten artykuł jest objęty licencją Creative Commons Uznanie autorstwa 4.0 Międzynarodowej licencji, która zezwala na używanie, udostępnianie, adaptację, dystrybucję i powielanie w dowolnym medium lub formacie, pod warunkiem, że podałeś odpowiednie informacje o oryginalnym autorze (s) i źródło, podać link do licencji Creative Commons i wskazać, czy dokonano zmian. Obrazy lub inne materiały stron trzecich w tym artykule są objęte licencją Creative Commons tego artykułu, chyba że zaznaczono inaczej w limicie kredytowym do materiału. Jeśli materiał nie jest objęty licencją Creative Commons artykułu, a Twoje zamierzone użycie nie jest dozwolone przez przepisy ustawowe lub przekracza dozwolone użycie, musisz uzyskać pozwolenie bezpośrednio od właściciela praw autorskich. Aby wyświetlić kopię tej licencji, odwiedź http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.