Część 1 Zapobiegawcze działanie glikozydów fenyloetanolowych z Cistanche Tubulosa na zwłóknienie wątroby wywołane albuminą surowicy bydlęcej u szczurów

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakcyjny

Tło:Cistanche tubulosa to tradycyjny chiński lek ziołowy, który jest szeroko stosowany do regulacji odporności.Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche(CPhG) z tej rośliny są przede wszystkim skutecznymi materiałami. Celem tego badania była ocena zapobiegawczego i terapeutycznego wpływu CPhG na indukowane BSA zwłóknienie wątroby u szczurów i powiązane mechanizmy molekularne obejmujące komórki gwiaździste wątroby. Jako kontrolę pozytywną zastosowano Biejiarangan (BJRG), inny tradycyjny chiński lek ziołowy. Metody: W doświadczeniach in vivo 75 szczurów SD zostało losowo podzielonych na 6 grup: normalne (traktowane wodą destylowaną), model (traktowane BSA), pozytywny lek (traktowane BSA plus BJRG 60{{29} } mg/kg/dzień) i grupy leczone BSA plus CPhG (125, 250 i 500 mg/kg/dzień). Wskaźniki wątroby i śledziony, poziomy w surowicy aminotransferazy asparaginianowej (AST), aminotransferazy alaninowej (ALT), kwasu heksadecenowego (HA), lamininy (LN), prokolagenu typu III (PCIII), kolagenu typu IV (IV-C), hydroksyproliny ( Hyp) i transformujący czynnik wzrostu 1 (TGF- 1) mierzono w wątrobach szczurów. Stopnie histopatologiczne dla zwłóknienia wątroby oceniano dla każdej grupy stosując barwienie H&E i trichromem Massona. Ekspresję TGF- 1, kolagenu I (Col-I) i kolagenu III (Col-III) określono metodą barwienia immunohistochemicznego. Efekty te dalej oceniano in vitro przez określenie poziomów ekspresji NF-κB p65 i Col-I za pomocą ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresję białka Col-1 zbadano również metodą western blotting. Wyniki: Wszystkie grupy dawek (125, 250 i 500 mg/kg/dobę) CPhG znacząco obniżyły wskaźnik wątrobowy i śledziony, obniżyły poziomy ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C w surowicy, Zawartość TGF- 1 (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" i="" p="">< 0,01)="" oraz="" zawartość="" hyp.="" cphg="" również="" znacznie="" łagodziły="" obrzęk="" komórek="" wątroby="" i="" skutecznie="" zapobiegały="" martwicy="" hepatocytów="" i="" infiltracji="" komórek="" zapalnych.="" wyniki="" immunohistochemiczne="" wykazały,="" że="" cphgs="" znacząco="" zmniejszały="" ekspresję="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" i="" p="">< 0,01),="" col-i="" i="" col-iii.="" efekty="" in="" vitro="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" i="" 25="" ug/ml)="" na="" hsc-t6="" wykazały,="" że="" cphg="" znacząco="" zmniejszały="" ekspresję="" mrna="" nf-κb="" p65="" i="" col-i,="" a="" cphg="" również="" obniżały="" ekspresję="" białka="" col-i.="" wnioski:="" cphg="" mają="" istotne="" działanie="" przeciw="" zwłóknieniu="" wątroby="" i="" mogą="" być="" stosowane="" jako="" środki="" chroniące="" wątrobę="" w="" leczeniu="" zwłóknienia="">

Słowa kluczowe: Zwłóknienie wątroby, Cistanche tubulosa, Glikozyd fenyloetanolowy, Chemokine BSA, Profilaktyka i terapia.

Tło

Zwłóknienie wątroby jest odpowiedzią gojenia się ran na ciężkie uszkodzenie wątroby, które występuje w patogenezie przewlekłego zapalenia wątroby wywołanego różnymi czynnikami. Czynnikami tymi są infekcja wirusowa, nadużywanie alkoholu, cholestaza oraz choroby metaboliczne i autoimmunologiczne [1–3]. Postępująca akumulacja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i zmniejszona przebudowa zaburzają prawidłową architekturę wątroby, powodując zwłóknienie wątroby [4]. Zwłóknienie wątroby ma kluczowe znaczenie w przewlekłej chorobie wątroby i często rozwija się w nieodwracalną marskość i karcynogenezę. Obecnie nie ma metod ani skutecznych leków do leczenia zwłóknienia wątroby. Dlatego pilnie należy znaleźć lek przeciw zwłóknieniu wątroby, który łagodzi progresję uszkodzenia wątroby do zwłóknienia i raka.Cistanche tubulosaW (z rodziny Orobanchaceae) jest pasożytniczą rośliną powszechnie uprawianą w południowym regionie Xinjiang w Chinach [5]. Ludzie zwykle używają go do ożywienia nerek, odżywienia krwi, rozluźnienia jelit i opóźnienia starzenia. Jest oficjalnie wymieniony w Farmakopei Chińskiej [6]. C. tubulosa zawiera różnorodne składniki aktywne. Obejmują oneGlikozydy fenyloetanolowe z cistanche(CPhG), irydoidy i polisacharydy. Jako jeden z wielu aktywnych składników wC. tubulosaCPhGs wykazywały przekonujące działanie przeciwutleniające, przeciwzmęczeniowe, neuroprotekcyjne i przeciwzapalne zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro [7]. W ostatnich latach pojawiły się doniesienia, że ​​CPhG (Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche) mają działanie hepatoprotekcyjne. Potencjalne mechanizmy leżące u podstaw tych efektów to wychwytywanie wolnych rodników, ochrona błon wątrobowych, immunoregulacja, hamowanie apoptozy, hamowanie ekspresji HBsAg i HBeAg oraz hamowanie replikacji DNA HBV i inne [8–11]. Jednak niewiele badań w literaturze odnosi się do działania grafiki przeciw zwłóknieniu wątroby. Dlatego to badanie miało na celu zbadanie działania GPhC przeciw zwłóknieniu wątroby przy użyciu modelu zwłóknienia wątroby wywołanego albuminą surowicy bydlęcej (BSA) u szczurów. Pokrewne mechanizmy molekularne badano w komórkach HSC-T6.

Metody

Chemikalia i odczynniki

Zestaw hydroksyproliny (hydroliza alkaliczna) (partia: 20140616) zakupiono z Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Chiny). Zestawy szczurzego TGF- 1 kanapkowego ELISA (seria: 238240615) zakupiono od Lianke Biotech Co., Ltd. (Chiny). Królicze przeciwciało anty-kolagen I (seria: 140619), królicze przeciwciało anty-kolagen III (seria: 980788 W) i królicze przeciwciało anty-TGF- 1 (seria: 140619) zostały dostarczone przez Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Chiny). Zamknięte z normalną surowicą owczą (płyn roboczy) (Seria: WP141214), PV-6000 (Seria: WK141225) i zestaw DAB (Seria: K136621D) zakupiono od Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Chiny). . Wykrywanie przeciwciał pierwszorzędowych przeprowadzono przy użyciu 2. roztworu przeciwciał (Sprzężone Alk-Phos, Przeciw-królik) i 2. Roztworu przeciwciał (Sprzężone Alk-Phos, Przeciw-mysz) (seria: 272387) zakupionego od Invitrogen Company (USA) ). Albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (partia: SLBG8239V) zakupiono z Sigma (USA). Przed użyciem BSA przygotowano w stężeniu 18 g/l w soli fizjologicznej, bakterie usunięto przez filtrację, a BSA przechowywano w 4 stopniach. Niekompletny adiuwant Freunda zawierający 1 g lipidów z owczej sierści (seria: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Chiny) zmieszano z 2 g płynnej parafiny (seria: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Chiny), sterylizowany w autoklawie parowym i przechowywany w temperaturze 4 st. Pozytywny lek BJRG otrzymano w postaci tabletek Biejiarangan z Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Chiny). Zapasy leków BJRG przygotowano przez rozpuszczenie Tabletki BJRG w wodzie destylowanej w stężeniu 600 mg/kg.

Materiały roślinne

C. tubulosa(rodzina Orobanchaceae) została zakupiona z regionu Minfeng w Xinjiang w Chinach. Materiał został uwierzytelniony przez badacza Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica w Xinjiangu. Próbki kuponów zostały zdeponowane w Instytucie Materia Medica w Xinjiang.

Przygotowanie CPhG(Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche)

Suszone i pokrojone w plasterki kłączaC. tubulosa(6,0 kg) kolejno trzykrotnie wyekstrahowano pod chłodnicą zwrotną 70% etanolem i rozpuszczalnik usunięto, otrzymując ekstrakt etanolowy. Ekstrakty etanolowe oczyszczono przy użyciu żywicy AB-8, otrzymując glikozydy fenyloetanolowe (CPhG). Roztwory podstawowe CPhG stosowane dla różnych grup dawek w badaniach na zwierzętach (odpowiednio 500 mg/kg, 250 mg/kg i 125 mg/kg) rozpuszczono w 0,5% (5 g/l) karboksymetylocelulozie (sól sodowa).

Kwantyfikacja CPhG(Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche)

Zawartość dwóch składników (echinakozydu i akteozydu) w CPhG oznaczono metodą HPLC, stosując wcześniej opisaną metodę (Zhang i wsp. 2004) [12]. HPLC przeprowadzono przy użyciu Shimadzu LC-10HPLC wyposażonego w detektor UV. Kolumną HPLC była kolumna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). Izokratyczna faza ruchoma składała się z metanol-acetonitryl-1% kwasu octowego (15:10:75, v/v/v). Elucję prowadzono przez 40 min, a szybkość przepływu utrzymywano na poziomie 0,6 ml/min. Temperaturę kolumny utrzymywano na stałym poziomie 30 stopni . Detekcja UV była przy 334 nm.

Zwierzęta i linia komórkowa HSC-T6

[Grade SPF], zdrowe dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (SD) (180-220 g) zakupiono z Xinjiang Medical University Animal Center, numer licencji: SCXK (nowy) 2011-0004. Szczury karmiono karmą wolną od specyficznych patogenów (SPF). Wszystkie procedury związane z eksperymentami na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego Xinjiang. Szczury trzymano w klatkach w kontrolowanych warunkach środowiskowych (25 stopni i 12-godzinny cykl światło/ciemność) i miały swobodny dostęp do standardowej karmy dla szczurów i wody z kranu. Szczury aklimatyzowano przed leczeniem. Linia unieśmiertelnionych komórek gwiaździstych wątroby szczura, HSC-T6, została uzyskana z Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Chiny). Komórki HSC-T6 hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (wysoka glukoza) (DMEM, Pekin, Chiny) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Gibco, Ameryka Południowa), 100 IU/ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny (Pekin , Chiny) w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni z 5% CO2.

Uszkodzenie i leczenie wątroby wywołane przez BSA

Siedemdziesiąt pięć szczurów SD podzielono losowo na sześć grup: normalne (traktowane wodą destylowaną), model (traktowane BSA), pozytywny lek (traktowane BSA plus BJRG 600 mg/kg/dzień) i traktowane BSA plus CPhG(Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/dzień) grup. W grupach leczonych BSA plus CPhG (125, 250, 5{00} mg/kg/dzień) było 13 szczurów w każdej grupie, a druga grupa miała 12 szczurów w każdej grupie. Model uszkodzenia wątroby indukowanego BSA dzieli się na sensytyzację pierwotną, po której następuje atak immunologiczny) [13]. Poza normalną grupą, innym grupom podawano wielokrotne podskórne wstrzyknięcia 0,5 ml (9 mg/ml) niekompletnego adiuwantu BSA Freunda w 1. dniu, 15., 22., 29. i 36. dniu z powodu uczulenia pierwotnego. Siedem dni po piątym wstrzyknięciu pobrano krew ze splotu żył siatkówki szczura i zbadano na obecność przeciwciał przeciwko albuminie surowicy. Przeciwciało BSA w surowicy szczura wykryto metodą podwójnej dyfuzji agarowej. Wstrzyknięcie ataku przeprowadzono przez podawanie 0,4 ml BSA w soli fizjologicznej przez żyłę ogonową szczurom z dodatnim przeciwciałem BSA dwa razy w tygodniu dziesięć razy. Stężenia i czasy wstrzyknięć wynosiły 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10,00 g/l w dniu 46, dniu 50, dniu 53, dniu 57, dniu 60, dniu 64, dniu 67, dniu 71, dniu 74 i dniu 78, odpowiednio. W grupie normalnej zamiast BSA zastosowano normalną sól fizjologiczną do pierwotnych (uczulających) i wtórnych (atak) wstrzyknięć immunologicznych, a inne stany były takie same jak w grupie modelowej. Normalnej grupie podawano doustnie wodę destylowaną w dawce 10 ml/kg/dzień. Grupie modelowej podawano doustnie 10 ml/kg/dzień 0,5% roztworu CMC-Na. Grupie z dodatnim lekiem podawano doustnie 600 mg/kg/dzień BJRG. Potraktowane BSA plus CPhG (125,

250 i 500 mg/kg/dzień) grupom podawano doustnie 125, 250 i 500 mg/kg/dzień CPhGs(Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche), odpowiednio. Codzienne podawanie szczurom kontynuowano przez dwa tygodnie po ostatniej iniekcji. Po okresie doświadczalnym szczury głodzono przez 12 godzin przed 10% wodzianem chloralu, a następnie natychmiast uśmiercano. Próbki surowicy pobrano od każdego szczura i natychmiast użyto. Wątróbki pobierano w dwóch celach: (1) konserwacja w ciekłym azocie do zestawów Hyp oraz (2) utrwalanie w 10% formaldehydzie do badań histologicznych i immunohistochemicznych. Cały czas trwania badań na zwierzętach wynosił 93 dni.

Wskaźniki wątroby i śledziony

Wątrobę i śledzionę wycięto przez laparotomię i przepłukano roztworem soli fizjologicznej o 4°C. Po wchłonięciu nadmiaru wody za pomocą bibuły filtracyjnej zważono wątrobę i śledzionę, aby obliczyć odpowiednie wskaźniki: Względna masa narządu=masa narządu (g)/osobnicza masa ciała (g) × 100 procent [14].

Eksperymenty komórkowe

Komórki HSC-T6 wysiano na płytkę 96-studzienkową. Początkowo komórki hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS przez 48 godzin. Następnie pożywkę zastąpiono DMEM bez FBS, aby zagłodzić komórki przez 12 godzin. Komórki następnie hodowano w DMEM, który zawierał 5,0 ng/ml TGF- 1 (bez FBS) przez 24 godziny. Wreszcie, różne stężenia CPhG(Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche)(100ug/ml, 50ug/ml i 25ug/ml), akteozyd (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) oraz echinakozyd (500ug/ml, 250ug/ml i 125ug/ml) przeprowadzono na płytce w czterech powtórzeniach studzienek i inkubowano przez 48 godzin.

Analiza PCR w czasie rzeczywistym

Poziom ekspresji mRNA NF-κB, p65 i kolagenu I określono metodą PCR w czasie rzeczywistym. Aby określić ekspresję mRNA w komórkach HSC-T6, komórki (4 × 105 komórek) wysiano na sześciostudzienkowych płytkach z 3 ml DMEM z 10% FBS i inkubowano przez noc w temperaturze 37 stopni i 5% CO2, po czym podłoże do hodowli komórkowej zmieniono na DMEM bez surowicy. Następnie CPhGs(Glikozydy fenyloetanolowe z cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), akteozyd (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) i echinakozyd (500 ug/ml 250 ug/ml i 125 ug/ml). Po 48 godzinach inkubacji z CPhG lub kompozycjami monomerycznymi, całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen, USA) i energicznie mieszano z chloroformem przez 15 sekund. Po umieszczeniu w temperaturze pokojowej przez 3 min, lizat odwirowano przy 12 000 x g przez 15 min w 4 stopniach. RNA w fazie wodnej wytrącono izopropanolem, a górną fazę wodną przeniesiono do nowej probówki do mikrowirówki. RNA wytrącono przez dodanie 0,75% etanolu, po czym probówkę do mikrowirowania i wirowanie przy 12,000 x gw 4 stopniach przez nie więcej niż 5 min. Supernatant usunięto i RNA suszono w temperaturze pokojowej przez 5-10 min. Specyficzne zestawy starterów (Sangon, Szanghaj, Chiny), które zastosowano do amplifikacji szczurzej aktyny [GenBank: NM_031144.3], Kolagenu I [GenBank: NM_ 053304.1] i NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] geny zostały zaprojektowane przy użyciu Batch Primer 3. Startery forward (fw) i reverse (rv) były następujące: Kolagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -aktyna (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Wyniki znormalizowano do mRNA genu metabolizmu podstawowego -aktyny jako kontroli wewnętrznej i przedstawiono jako względne poziomy mRNA. Reakcje przeprowadzono z 8 µl iQ SYBR Green Supermix, 1 µl pary starterów 10 pM, 8,5 µl wody destylowanej i 2,5 µl cDNA. Każdą reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono w następujących warunkach: 95 stopni przez 3 min, następnie 40 cykli po 10 s w 95 stopni, 30 s w 55 stopni i 10 s w 55 – 95 stopni w celu wydłużenia, a następnie pojedynczy pomiar fluorescencji . Ostateczne wyniki opisano wartościami względnymi (2-ΔΔCt). Obliczenia i analizy zostały przeprowadzone przez System Detekcyjny iQ5 Real-Time PCR.

Analiza Western blot

Poziomy ekspresji białka kolagenu I (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania, nr art.: ab34710) określono metodą Western blot [z -aktyną (partia: 60008-1-lg; Proteintech, Chiny) jako kontrolą gospodarowania. Ekstrakty całych komórek przygotowano przy użyciu buforu do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (Thermo Scientific, USA) z 1% koktajlem inhibitorów proteazy Halt (Thermo Scientific, USA) i 1% koktajlem inhibitorów fosfatazy Halt (Thermo Scientific, USA). Stężenie białka mierzono i określano ilościowo metodą Bradforda [18]. Białko (10-50 ug) rozdzielono na 10% żelu SDS-PAGE i przeniesiono na membrany PVDF (Millipore, USA). Błony zablokowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej 5% BSA, a przeciwciała pierwszorzędowe (przeciwciało anty-Colla gen I, rozcieńczenie 1:200 lub mysie mAb-aktyny, rozcieńczenie 1:5000) inkubowano w temperaturze 4 stopni przez noc. Odpowiednie Alk-Fos. sprzężone przeciwciała drugorzędowe inkubowano w temperaturze pokojowej. Na koniec membrany przemyto trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej 1 × Tris–HCl z dodatkiem 0,1% Tween 20, a sygnały skanowano i wizualizowano za pomocą systemu obrazowania GEL DOC XR (Bio-Rad). Analizę densytometryczną przeprowadzono na białkach będących przedmiotem zainteresowania i znormalizowano do -aktyny za pomocą oprogramowania GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -aktynę zastosowano jako kontrolę wewnętrzną.

Analiza statystyczna

Do weryfikacji normalności zastosowano test normalności Shapiro-Wilka oraz test jednorodności wariancji Levene'a, a You i in. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Strona 4 z 13jednorodność wariancji. Analiza wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya została wykorzystana do zidentyfikowania różnic statystycznych w jednorodnych danych o rozkładzie normalnym. Do analizy danych o nierozkładzie normalnym lub niejednorodnych wykorzystano test nieparametryczny Kruskala-Wallisa. Wyniki wyrażono jako średnią ± SD. Istotność ustalono na P < 0.05.="" wszystkie="" dane="" analizowano="" za="" pomocą="" oprogramowania="" spss="" 16.0="" (uniwersytet="" medyczny="">

Wyniki

Ilościowe oznaczanie CPhGs

CPhG w C. tubulosa zawierają dwa glikozydy alkoholu fenyloetylowego, echinakozyd i akteozyd, a ich zawartość w CPhG określono metodą analizy HPLC (ryc. 1) na 42,71 ± 0,42% i 14,27 ± {7 }}.18 procent odpowiednio.

Wskaźniki wątroby i śledziony

Jak pokazano w Tabeli 1, wskaźniki wątroby i śledziony w grupie modelowej były istotnie podwyższone [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" wskaźniki="" wątroby="" i="" śledziony="" dla="" pozytywnego="" leku="" bjrg="" i="" cphgs="" w="" różnych="" grupach="" dawek="" były="" znacznie="" zmniejszone="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" wątroba="0.005;" pspleen="00,017," pspleen="00,027," pspleen="00,024," pspleen="00,070," odpowiednio].="" wskaźniki="" wątroby="" i="" śledziony="" były="" niższe="" niż="" w="" grupie="">

Wpływ CPhG na aktywność ALT, AST i markery zwłóknienia wątroby

W niniejszym badaniu poziomy enzymów wątrobowych AST i ALT w surowicy były znacząco podwyższone w grupie modelowej, odzwierciedlając uszkodzenie komórek wątroby u szczurów z włóknieniem wątroby wywołanym przez BSA. Jednak eksperymenty.

wykazali, że leczenie BJRG (600 mg/kg) i CPhG (125, 250 i 5{{10}}0 mg/kg) znacząco zmniejszyła AST [PAST < 0.0{{6{0}}1,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001="" odpowiednio]="" i="" alt="" [odpowiednio="" palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255]" u="" szczurów="" ze="" zwłóknieniem="" wątroby="" .="" (tabela="" 2).="" poziomy="" ha,="" ln,="" pc="" i="" iv-c="" u="" szczurów="" modelowych="" były="" istotnie="" podwyższone="" [odpowiednio="" pha=""><0,001, pln=""><0,001, ppciii="00,002," piv-c=""><0,001]. w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową,="" poziomy="" ha="" [odpowiednio="" pha="00,009," pha="00,007," pha="00,009," pha="00,023]," ln="" [odpowiednio="" pln="00,011," p="" ln="00,004," p="" ln="00,026," p="" ln="00,069]," pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}0,006,="" p="" pciii="00,067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," odpowiednio]="" i="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001]="" u="" szczurów="" były="" znacznie="" zmniejszone="" przez="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" i="" cphg="" w="" różnych="" grupach="" dawek="" (125,="" 250="" i="" 500="" mg/kg)="" (tabela="" 3).="" zawartość="" hyp="" i="" tgf-="" 1="" zawartość="" kolagenu="" wykryto="" również="" przez="" pomiar="" poziomów="" hyp="" w="" tkance="" wątroby.="" jak="" pokazano="" w="" tabeli="" 4,="" średnia="" wartość="">poziom w grupie modelowej był znacznie wyższy niż w grupie prawidłowej, ale był znacznie obniżony w grupie BJRG i grupach z różnymi dawkami CPhGs. Stężenie TGF w wątrobie{{0}} w grupie modelowej u szczurów było znacznie zwiększone [P < 0.001].="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową,="" poziomy="" tgf-="" 1="" pozytywnego="" leku="" i="" różnych="" grup="" dawek="" cphgs="" były="" znacznie="" obniżone="" [p="" tgf-="" 1="">< 00,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" odpowiednio="" p="" tgf-="" 1=""><0,001, ptgf-="" 1=""><0,001]. wyniki="" podsumowano="" w="" tabeli="">

Badanie histopatologiczne

Obserwacje normalnych skrawków tkanki wątroby wybarwionych H&E i trichromem Massona wykazują wyraźne zraziki wątrobowe i sinusoidy wątrobowe. Struktura tkanki wątroby u szczurów modelowych była zaburzona, a tkanka wątroby i sinusoidy wątroby zostały zastąpione dużą ilością tkanki łącznej. Jednak w grupie leczonej wykryto bardziej prawidłową cytoarchitekturę i mniej tkanki łącznej niż w grupie modelowej.

Barwienie H&E

W grupie prawidłowej obserwowano integralność strukturalną zrazików wątrobowych bez nieprawidłowych obszarów wrotnych i sinusoid wątrobowych. Sznury wątrobowe były ułożone w uporządkowany sposób, z rdzeniem okrągłym i przezroczystym. Jądra znajdują się w centrum komórki, z obfitą cytoplazmą. Jedynie obszar portalu ma niewielką ilość tkanki włóknistej (ryc. 2a). W grupie modelowej struktura zrazikowa została poważnie uszkodzona. Komórki wątroby wykazywały łagodną wodnistą degenerację, głównie zwyrodnienie balonowe i/lub zwyrodnienie tłuszczowe. Zaobserwowano również powstawanie nacieku komórek zapalnych, rozległy przerost tkanki włóknistej, powstawanie dużej liczby przegrody włóknistej, rozszczepionych zrazików i znaczną proliferację komórek wątroby. Obserwacje te potwierdziły powodzenie ustanowienia szczurzego modelu zwierzęcego uszkodzenia immunologicznego zwłóknienia wątroby (Fig. 2b). W porównaniu z grupą modelową zaobserwowano zmniejszenie nacieku komórek zapalnych w różnych CPhG. Zaobserwowano również mniejszą martwicę i stłuszczenie komórek wątrobowych oraz złagodzenie zwłóknienia. CPhG znacząco łagodziły patologię zwłóknienia wątroby u szczurów indukowanego BSA, łagodziły obrzęk komórek wątroby i skutecznie zapobiegały martwicy hepatocytów i infiltracji komórek zapalnych, co sugeruje, że CPhG wywierają ochronny wpływ na indukowane BSA zwłóknienie wątroby szczura. (Rys. 2c–f). Barwienie trichromianem Massona W grupie prawidłowej tkanka wątroby była prawidłowa. Obszar wrotny wątroby wykazywał niewielką liczbę niebieskich włókien kolagenowych, a tkanka wątroby miała prawidłową strukturę (ryc. 3a). W porównaniu z tkanką wątroby z normalnej grupy, tkanka włóknista proliferowana przez centralny płatek i rozszerzona do miąższu wątroby. Rozciągnięte i połączone włókna kolagenowe

otoczył cały płatek i otoczył żyłę centralną. Efekty te, wraz ze zwłóknieniem hepatocytów, strukturalnym uszkodzeniem zrazików, zwłóknieniem okołowrotnym i tworzeniem się rzekomych zrazików (ryc. 3b) dostarczyły dowodów na to, że model został ustalony. W porównaniu z grupą modelową, włókna kolagenowe w grupie pozytywnej kontroli leku były łagodnie rozciągnięte na zewnątrz od obwodowego obszaru portalu (ryc. 3c). W porównaniu z grupą modelową, włókna kolagenowe w różnych grupach dawek CPhGs były znacznie zmniejszone, proliferacja włókien została zahamowana, a proliferacja tkanki włóknistej w miąższu wątroby znacznie się zmniejszyła. Wyniki te sugerowały, że CPhG chroniły szczury przed zwłóknieniem wątroby wywołanym przez BSA (ryc. 3d-f).

Barwienie immunohistochemiczne

Co ważne, ekspresja kolagenu typu I i kolagenu typu III odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju zwłóknienia wątroby, a ich wytwarzanie i odkładanie w tkance wątroby może służyć jako ważny wyznacznik skuteczności przeciw zwłóknieniu wątroby. Wyniki podsumowano w Tabeli 5

Kolagen typu I

Normalna grupa eksprymowała kolagen typu I głównie w naczyniach krwionośnych i okolicy wrotnej. W grupie modelowej zwłóknienie naczyń kolagenu typu I o wysokiej ekspresji w obszarach wrotnych. W przestrzeni Dissego zaobserwowano smugi lub nierównomierne rozmieszczenie kolagenu typu I. Włókniste przegrody otoczone kolagenem tworzą pseudolobule. W tych eksperymentach utworzyło się mniej przegród włóknistych dla BJRJ (600 mg/kg) i różnych grup dawek CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) [PCol I=00,002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 i P Col I=00.044]. Wyniki półilościowe wykazały, że ekspresja ich kolagenu typu I była istotnie niższa w porównaniu z grupą modelową (ryc. 4).

Kolagen typu III

Kolagen typu III był słabo wyrażany w grupie prawidłowej, a obszary obwodowe otaczające żyły wrotne i wątrobowe wykazywały niewielką ilość drobnych żółtych włókien zamiast ciągłych włókien (ryc. 5a). W grupie modelowej włókna kolagenowe wykazywały szerokie i grube kordy, wskazujące na silną ekspresję, zlokalizowane głównie w obszarze wrotnym i tkance włóknistej (ryc. 5b). Włókna kolagenowe BJRJ (600 mg/kg) i różne grupy dawek CPhG (125, 250 i 500 mg/kg) były nitkowate i rozmieszczone wokół żyły centralnej i obszarów wrotnych. W porównaniu z grupą modelową włókna kolagenowe były znacznie zmniejszone, barwienie było blade i cienkie, a barwienie immunohistochemiczne było słabo pozytywne (ryc. 5c–f). Te wyniki półilościowe pokazują, że komórki z dodatnią ekspresją w grupach dodatnich i z różnymi dawkami [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 i P Col III=00,037 odpowiednio] różniły się od tych w grupie modelowej.

TGF- 1

Wystąpiła niewielka ekspresja TGIF{{0}} w normalnych komórkach wątroby szczura. Ekspresja była ograniczona do niewielkiej liczby komórek śródmiąższowych (ryc. 6a). W grupie modelowej ekspresja TGF- 1 była szeroko rozłożona w obszarze wrotnym, przestrzeniach włóknistych, komórkach gwiaździstych wątroby, komórkach zapalnych, ścianie zatok i cytoplazmie. Określony obszar portalu wykazywał silnie pozytywną ekspresję z brązowo-żółtym zabarwieniem (ryc. 6b). Wystąpiła niewielka ekspresja w obszarze wrotnym i przegrodach włóknistych BJRJ (600 mg/kg) i różnych grupach dawek CPhG (125, 250 i 500 mg/kg). Zakres pozytywnego barwienia w tych grupach był znacznie zmniejszony w porównaniu z grupą modelową. Barwienie komórek śródmiąższowych w przegrodzie włóknistej i cytoplazmie komórek zapalnych uległo zmniejszeniu (ryc. 6c–f). Wyniki półilościowe wykazały, że BJRJ i różne grupy dawek CPhG [PTGF- 1=00,001, PTGF- 1 <0,001, ptgf-="" 1="00,009," ptgf-="" 1="0" 0,004]="" były="" istotne="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową.="" jak="" wspomniano="" wcześniej="" w="" artykule,="" tgf-="" 1="" jest="" ważną="" cytokiną="" w="" patofizjologii="">

zwłóknienie, stymulując produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej [19]. Wykazaliśmy, że poziom TGF- 1 wzrósł w grupie modelowej w sposób zgodny z nasileniem zwłóknienia wątroby. Poziomy ekspresji TGF- 1 w wątrobie były zgodne z poziomami TGF- 1 w surowicy. Wskazuje to, że CPhG mogą znacząco zmniejszać zwłóknienie wątroby z powodu ekspresji TGF- 1 poprzez udział w syntezie i degradacji ECM. Ekspresja kolagenu typu I, kolagenu typu III i TGF- 1 może wykryć patologiczny proces zwłóknienia wątroby. Ich poziomy ekspresji w grupach leczonych były znacznie zmniejszone i pokazały, że CPhG mogą poprawić aktywność kolagenazy, utrzymując dynamiczną równowagę syntezy i degradacji ECM wątroby, opóźniając w ten sposób i zapobiegając powstawaniu zwłóknienia wątroby.