Tubulozyd B z Cistanche Salsa ratuje komórki neuronalne PC12 przed apoptozą indukowaną jonami 1-metylo-4-fenylopirydyniowymi i stresem oksydacyjnym

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstrakcyjny:

Neuroprotekcyjnewpływ tubulozydu B z cistanche, jeden z fenyletanoidów wyizolowanych z Chińczykówziołolecznictwo salsa Cistanche, zbadano apoptozę indukowaną 1-metylo-4-jonem fenylopirydyniowym (MPP plus ) i stres oksydacyjny w komórkach neuronalnych PC12. Komórki PC12 traktowane MPP przeszły apoptotyczną śmierć, jak określono za pomocą testu MTF, cytometrii przepływowej i elektroforezy w żelu agarozowym DNA; wewnątrzkomórkową akumulację reaktywnych form tlenu (ROS) mierzono za pomocą barwienia DCFH-DA za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (LSCM). Jednoczesne traktowanie tuhulozydem B znacząco osłabiało cytotoksyczność indukowaną MPP＋, fragmentację DNA i wewnątrzkomórkową akumulację ROS. Wyniki te silnie wskazują, że tubulozyd B zapobiega apoptozie indukowanej MPP i stresowi oksydacyjnemu. Tubulozyd B może być stosowany jakoprzeciw chorobie Parkinsonaagentów.

Wstęp

Patologicznie, sporadyczna choroba Parkinsona (PD) charakteryzuje się zazwyczaj utratą neuronów katecholaminergicznych, zwłaszcza neuronów dopaminergicznych istoty czarnej pars compacta (SNc), oraz obecnością charakterystycznej intraneurony| inkluzje zwane ciałami Lewy'ego w dotkniętych obszarach mózgu. Pomimo różnych czynników zaangażowanych w patogenezę PD, mechanizmy zaangażowane w inicjację i progresję PD pozostają niepewne. Mimo że przyczyna PD pozostaje wyjaśniona, kilka linii dowodów silnie sugeruje udział stresu oksydacyjnego, co ostatecznie prowadzi do śmierci neuronów lub apoptozy przez nadmierne wytwarzanie wolnych rodników [1], [2], [3]. Fakt, że czarny układ dopaminergiczny może wytwarzać wysokie poziomy wolnych rodników i ma stosunkowo niski poziom systemu obrony antyoksydacyjnej dodatkowo wspiera tę hipotezę. Zarówno badania in vivo, jak i in vitro wykazały neurotoksyczność MPP＋, w której pośredniczy stres oksydacyjny, aktywnego metabolitu l-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) na neurony dopaminergiczne [4 ], [5]. Zaangażowanie wolnych rodników nadmiernie wytwarzanych przez stres oksydacyjny jako bezpośredniej przyczyny zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak PD, sugeruje kluczową rolę przeciwutleniaczy. Tubulozyd B (rys. 1) był jednym ze związków fenyloetanoidowych wyizolowanych z łodygSalsa Cistanche. Wcześniejsze badania wykazały, że wiele fenyletanoidów, w tym tubulozyd B, wykazywało silne działanie wymiatające wolne rodniki[6], [7].

Biorąc pod uwagę te odkrycia, zbadaliśmy w niniejszym badaniu wpływ tubunzydu B na neurotoksyczność indukowaną przez MPP plus in vitro, wykorzystując linię komórkową guza chromochłonnego nerwu współczulnego PC12, która była z powodzeniem stosowana przez lata do badania funkcji neuronów [8], [9].

przeciw chorobie Parkinsona:cistanche

Materiały i metody

Materiały

Tubulozyd B zSalsa Cistanchezostał uprzejmie dostarczony przez dr Li Lei (Departament Produktów Naturalnych, Szkoła Nauk Farmaceutycznych, Uniwersytet Pekiński, Pekin, Chiny). Czystość związku według analizy HPLC wynosiła ponad 98 procent. Zmodyfikowaną pożywkę Eagle'a Dulbecco (DMEM), surowicę końską i płodową surowicę cielęcą zakupiono od GIBCO BRL, jon 1-metylo-fenylopirydyniowy (MPP plus), poli-L-lizyna, 3-(4, 5 -dimetylotiazol-2 -yl)-2,5- difenylotetrazoliowy bromek (MTT), jodek propidyny (PI), RNaza A, proteinaza K i dioctan 2;7'-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) zakupiono od Sigma.

Hodowlę komórkową

Komórki PCI2 utrzymywano w DMEM uzupełnionej 10% surowicą końską, 5% płodową surowicą cielęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny. Komórki hodowano w nawilżanym inkubatorze napowietrzanym 95% powietrzem i 5% CO2 w 37°C. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono 24-48 godz. po wysianiu komórek. Komórki rutynowo zbierano przez trypsynizację 0,25 procent, gdy komórki zbliżały się do etapu subkonfluencji i umieszczano w 25-centymetrowych kolbach hodowlanych podzielonych w stosunku 1:8.

Analiza żywotności komórek

Żywotność komórek określono przy użyciu zmodyfikowanego testu MTT, jak opisano wcześniej [10]. W skrócie, komórki PC12 wysiano na płytkach 96-dołkowych z gęstością 1 × 104 komórek na dołek. Hodowle hodowano przez 48 godzin, a następnie zmieniono pożywkę na zawierającą różne stężenia tubulzydu B lub MPP＋. Po inkubacji przez 48 godzin i 72 godziny, roztwór MTr (5 mg/ml w DMEM) dodano do płytek ze studzienkami 96- i komórki pozostawiono do inkubacji przez 4 godziny w temperaturze 37 stopni. Po usunięciu pożywki komórki i kryształy barwnika rozpuszczono przez dodanie 200 μl DMSO i zmierzono absorpcję przy 570 nm (540 nm jako odniesienie) za pomocą czytnika mikropłytek model 550 (Bio-Rad). Żywotność komórek analizowano również metodą wykluczania błękitem trypanu. Komórki zebrano, delikatnie odwirowano i wybarwiono 0,6% roztworem błękitu trypanu na 3 deszcze. Odsetek komórek bezbarwnych oceniano następnie w dziesięciu losowo wybranych polach mikroskopowych. Jako lek dodatni zastosowano 100 ng／ml czynnika wzrostu naskórka (EGF).

Wykrywanie apoptozy metodą cytometrii przepływowej

Komórki apoptotyczne wykrywano metodą cytometrii przepływowej z użyciem jodku propidyny (PI) [11]. W skrócie, około 1 x 106 komórek inkubowanych z badanymi substancjami zebrano przez odwirowanie i przemyto raz PBS. Komórki utrwalano 70 procentowym etanolem przez 24 godziny w stopniu - 20 i płukano raz PBS. Komórki następnie ponownie zawieszono w 300 μl PBS zawierającego 0,5 mg/ml RNazy i 0,5 mg/ml PI. Po dalszej inkubacji przez 30 min w ciemności przeprowadzono cytometrię przepływową za pomocą FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Niemcy).

Zastosowaliśmy protokół Moore'a [12], w którym wyizolowano tylko fragmentaryczne DNA, a eksperymenty znormalizowano przy użyciu równej liczby kultur z każdej grupy testowej. W skrócie, 3 × 106 neuronów z każdej z traktowanych próbek przemyto zrównoważonym roztworem soli Hanka (1000g przez 10 min), a osady utworzone na dnie probówki zhomogenizowano z 1 ml buforu do lizy (10 mM Tris przy pH 7,4,5 mM EDTA, 1 procent Triton X-100) przez 20 min na lodzie. Po odwirowaniu przy 11,000 g przez 20 deszczu w 4 stopniach, supernatanty zawierające pofragmentowane DNA usunięto i trawiono 20 mg/ml RNazy A w 37 stopniach przez 1 godzinę i 0,1 mg/ml proteinazy K w 56 stopniach przez dodatkową 1 godz. Pofragmentowany DNA wyekstrahowano przy użyciu fenolu i chloroformu i odwirowano przy 10,000g przez 1 deszcz w 4°C. Fazę wodną przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa, zmieszano z 2 objętościami lodowatego etanolu, a następnie umieścić w -20 stopniu na co najmniej 1 godzinę w celu wytrącenia DNA. Po odwirowaniu w 15,000g przez 20 min w 4 stopniach, supernatanty usunięto, a osady DNA przemyto raz 80-procentowym etanolem (15 000 g przez 15 min w 4 stopniach), wysuszono na powietrzu i rozpuszczono w 20 μl TE bufor o pH 7,6. Całą próbkę poddano następnie elektroforezie w 1,5 procentowym żelu agarozowym przez 1 godzinę przy 85 V. Żel zbadano i sfotografowano za pomocą systemu dokumentacji żelowej Ultra Violet Products (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Pomiar wewnątrzkomórkowego tworzenia ROS

Tworzenie wewnątrzkomórkowych nadtlenków wykrywano za pomocą współogniskowego skaningowego mikroskopu laserowego z użyciem niefluorescencyjnego związku, dioctanu 2"7"-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) [13], który jest estryfikowany w komórkach przez endogenne esterazy do zjonizowanego wolnego kwasu, 2 ;7"-dichlorofluoresceina. 2",7-Dichlorofiuorescyna jest zdolna do utleniania się do fluorescencyjnej 2"7"-dichlorofluoresceiny (DCF) przez hydroprzeciwutleniacze. Komórki inkubowano z 10 µM DCFH-DA przez 30 min w 37°C. Hodowle przemyto dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka i zobrazowano w tym samym podłożu. Obrazowanie wykonano za pomocą współogniskowego skaningowego mikroskopu laserowego, DCF wzbudzano przy 488 nm, a filtrem emisyjnym był filtr barierowy 510 nm. Aby zapewnić prawidłowe porównanie, do wszystkich obserwacji zastosowano te same parametry akwizycji. Ustalono optymalną pozycję pionową w środku komórek, a następnie szybko przeskanowano pole. Ponieważ oświetlenie przy długości fali wzbudzenia 488 nm powodowało zwiększoną fluorescencję z powodu utlenienia tego barwnika, każde pole wystawiono na działanie światła dokładnie w tym samym czasie. Wartości wyjściowe z niestymulowanych komórek wykorzystano jako wartości kontrolne do porównania z komórkami traktowanymi MPP w obecności lub nieobecności tubulozydu B. Po skanowaniu, średnią względną intensywność fluorescencji w ciałach komórek neuronalnych 15-20 na pole mikroskopu określono ilościowo w czterech oddzielne kultury na warunki leczenia.

cistanche

Analiza statystyczna

Wszystkie otrzymane wartości wyrażono jako średnie ±SD. Istotność statystyczną różnic między grupami określono za pomocą testu t-Studenta; Obliczone wartości p mniejsze niż 0.05 uznano za statystycznie istotne.

Wyniki

Jak pokazano na ryc. 2, MPP plus powodował zależny od dawki spadek żywotności komórek PCI2. W przeciwieństwie do tego, EGF, dobrze znany czynnik neurotroficzny, wytwarzał znaczącą ochronę żywotności komórek przy 100 ng/ml, efekty cytotoksyczne wywołane przez MPP＋ były również osłabiane w obecności tubulozydu B (5, 10, 50 lub 100 ug-ml-1 ), chociaż o mniejszej sile działania niż lek referencyjny (ryc. 3)． Tubulozyd B w tych stężeniach wykazywał działanie cytoochronne w sposób zależny od dawki, a sam związek nie powodował żadnej widocznej cytotoksyczności (dane nie pokazane)． Elektroforeza żelowa ekstraktu DNA z komórek PCI 2 traktowanych 200 µM MPP plus przez 48 h wykazała drabinkę DNA． klasyczny znak rozpoznawczy apoptozy, tubulozyd B, w dawkach 10 i 100 μg·ml-1wywoływał tworzenie drabinki DNA (Ryc.4)．Ryc.5 przedstawia typowe histogramy analizy apoptotycznej śmierci komórek wywołanej przez MPP＋ w komórkach PC12 w obecności lub przy braku tubulozydu B．Ocena ilościowa profilu cyklu komórkowego za pomocą PI wykazała liczbę komórek o charakterystyce subdiploidalnej (region M1) wskazujących na apoptotyczną fragmentację DNA． W komórkach nietraktowanych apoptotyczna frakcja subdiploidalna była minimalna do 5．94％z całkowitej liczby 10000 komórek (Ryc. 5 A)． Po 48 h ekspozycji na MPP＋ odsetek apoptozy wzrósł do 43．02;j;(Ryc.5B)． Po dodaniu do hodowli komórkowej tubulozyd B hamował apoptozę wywołaną MPP＋w sposób zależny od dawki． Przy stężeniu 10 μg·ml-1ochrona przez tubulozyd B nie była statystycznie istotna, ale przy 50 i 1 00ug·ml-1, odpowiednio o 45％ i 63％, zaobserwowano, co spowodowało wzrost odsetka komórek przeżywających (ryc. 5D, E)．

Akumulację wewnątrzkomórkowych ROS można wykryć przy użyciu komórek DCFH-DA．PC12 traktowanych 200 uM MPP＋ przez 48 h, wykazywały intensywną fluorescencję wewnątrz komórki po wybarwieniu barwnikiem DCFH-DA (Ryc. 6)． Jednoczesne leczenie tubulozydem B (w dawkach 10 i 100 µg·ml) hamowało wytwarzanie ROS indukowane przez MPP＋一 (zmniejszony odsetek wynosił odpowiednio 24．52％i 55．63％)．

Dyskusja

Patogeneza PD obejmuje silny stres oksydacyjny, obniżony poziom antyoksydantów i defekty mitochondrialne． wszystkie znane z indukowania apoptozy w kilku układach komórkowych． W szczególności wykazano, że wolne rodniki wywołują aktywną śmierć komórek w neuronach[14]． MPTP wywołuje nieodwracalny i ciężki zespół podobny do choroby Parkinsona, który powoduje selektywną degenerację nigrostriatalnych neuronów dopaminergicznych u ludzi． Ta neurotoksyna została wykorzystana do stworzenia zwierzęcych modeli PD[15]．MPTP jest przekształcany przez monoaminooksydazę B w MPP＋, który gromadzi się w mitochondriach． gdzie hamuje kompleks mitochondrialny I i te dni mitochondrialne． funkcja powoduje apoptozę[16]．Dlatego też MPP plus indukowana neurotoksyczność w neuronach dopaminergicznych była szeroko stosowana jako etiologiczny model PD do skriningu środków neuroprotekcyjnych．

W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że wywołana przez MPP plus śmierć komórkowa poprzez stres oksydacyjny w komórkach PC12 została zmniejszona przez tubulozyd B. Ponadto wykazaliśmy, że tubulozyd B również chronił w sposób zależny od dawki przed wywołanym przez MPP plus stopniowaniem DNA oraz apoptozę, mierzoną za pomocą elektroforezy w żelu DNA i analizy cytometrii przepływowej. Ponadto jednoczesne leczenie wyższymi stężeniami tubulozydu B hamowało wytwarzanie ROS indukowane przez MPP. Tak więc tubulozyd B wykazał wielofunkcyjne działanie neuroprotekcyjne. Kilka mechanizmów, osobno lub w połączeniu, może być zaangażowanych w działanie tubulozydu B. Efekt przeciwutleniający jest możliwym mechanizmem neuroprotekcji, w której pośredniczy tubulozyd B. Xiong Q odkrył, że tubulozyd B wykazywał silną aktywność wymiatania wolnych rodników na rodniku 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylu, a oksydaza ksantyny]ksantynowa generowała anionorodnik ponadtlenkowy [6].

Ostatnio doniesiono, że kilka fenyletanoidów posiada właściwości wymiatania wolnych rodników i chronią uszkodzenia toksyczne wywołane stresem oksydacyjnym. ROS wytwarzane przez MPP plus takie jak nadtlenek wodoru, anion ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy łatwo uszkadzają cząsteczki biologiczne, co może ostatecznie prowadzić do apoptotycznej lub nekrotycznej śmierci komórki. Tak więc tubulozyd B może mieć bezpośrednie działanie wymiatające w stosunku do ROS. Chociaż nasze dane nie ustalają dokładnego miejsca, w którym tubulozyd B działa w celu zahamowania akumulacji ROS, sugerują, że mechanizm neuroprotekcyjny obejmuje stymulację szlaków antyoksydacyjnych. Badanie struktury molekularnej tubulozydu B wskazuje również, że ma on silną zdolność wymiatania wolnych rodników (komunikacja osobista).

Inne mechanizmy również mogą mieć znaczenie. Na przykład tubulozyd B może mieć zdolność przeciwdziałania toksyczności MPP＋ poprzez hamowanie otwierania porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów i dysfunkcji. Ponadto należy również rozważyć, czy tubulozyd B ma bezpośredni wpływ promujący wzrost na komórki neuronalne. Dokładny mechanizm neuroprotekcyjnego działania tubulozydu B pozostaje niejasny. Wymagane są dodatkowe badania w celu wyjaśnienia pełnego obrazu jego działania neuroprotekcyjnego.

Podsumowując, tubulosyd B z ekstraktu z salsy Cistanche ma ewidentny wpływ ochronny na apoptozę wywołaną MPP plus i stres oksydacyjny. Jego działanie neuroprotekcyjne przeciwko toksyczności MPP ＋ może być ważne i sugerować, że może mieć potencjał terapeutyczny w zapobieganiu i leczeniu PD.

leczenie PD: cistanche

Bibliografia

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Hamowanie tlenku azotu przez fenyloetanoidy w aktywowanych makrofagach. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Utworzenie noradrenergicznej linii klonalnej komórek guza chromochłonnego nadnerczy, które odpowiadają na czynnik wzrostu nerwów. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Wolne rodniki i peroksydacja lipidów nie pośredniczą w śmierci komórek nerwowych indukowanej przez amyloid. Mózg Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Kinetyczna charakterystyka toksyczności tlenku azotu dla komórek PC12: wpływ czasu półtrwania uwalniania NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Szybka i prosta metoda pomiaru apoptozy tymocytów za pomocą barwienia jodkiem propidyny i cytometrii przepływowej. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Infekcja wewnątrzkomórkowa przez Leishmania do nova hamuje apoptozę makrofagów. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. Podstawowy FGF osłabia stres oksydacyjny wywołany peptydem amyloidowym, dysfunkcję mitochondriów i upośledzenie aktywności Na ＋-K ＋-ATPazy w neuronach hipokampa. Badania mózgu 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Upośledzenie mitochondriów jako wczesne zdarzenie w procesie apoptozy wywołanej niedoborem glutationu w komórkach neuronalnych: znaczenie dla choroby Parkinsona. Biochem Pharmaco 11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Przewlekły parkinsonizm u ludzi z powodu produktu syntezy analogu meperydyny. Nauka 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Badania nad toksycznością jonu 1-meetylo-4-fenylopirydyniowego (MPP ＋) przeciwko mitochondriom mózgu myszy.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110