Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknij tutaj, aby przejść do części 1!

Pls kliknij tutaj, aby przejść do części 3

Cistanche może poprawić pamięć

Biorąc pod uwagę te wyniki, zbadaliśmy następnie, czy podwyższona ekspresja hipokampa miR-466f-3p u myszy podczas uczenia przestrzennego ipamięćformacja wpłynęła również na morfologię neuronów in vivo. Co istotne, odkryliśmy, że średnia gęstość kręgosłupa neuronów hipokampa u myszy GLN była wyższa niż u myszy PLN, co ujawniło zapłodnienie Golgiego piramidy

Rysunek 3. Wpływ zmian poziomu ekspresji miR-466f-3p hipokampa na wydajność MWM myszy

(A) Eksperymentalna oś czasu zadania MWM, analiza ekspresji lub pomiar elektrofizjologiczny mózgów myszy po wstrzyknięciu lentiwirusa.

(B) Lewe panele: ekspresja dsRed w hipokampie myszy. Reprezentatywne obrazy IF o niskim i wysokim powiększeniu hipokampu myszy zakażonych rekombinowanymi lentiwirusami z ekspresją tylko dsRed jako kontroli (lewa kolumna obrazów) lub miR-466f-3p plus dsRed (prawa kolumna obrazów). Obramowane obszary dwóch górnych obrazów są powiększone i pokazane poniżej. Skala, 100 mm. Kropkowane linie wskazują granice DG. Jądra wybarwiono DAPI. GCL, warstwa komórek ziarnistych; ML, warstwa molekularna. Prawy histogram, względne poziomy ekspresji miR-466f-3p w mysim hipokampie zakażonym lentiwirusem będącym kontrolą ekspresyjną lub miR-466f-3p, jak oznaczono metodą RT-qPCR ( n=16 na grupę).

(C) Wydajność MWM myszy zakażonych różnymi rekombinowanymi lentiwirusami, zapakowanymi przy użyciu pięciu różnych plazmidów wyrażających tylko dsRed, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p i gąbki miR/SCR, odpowiednio, do ich hipokampa (odpowiednio n=13, 26, 16, 19 i 11 na grupę). Lewy panel: latencja ucieczki podczas treningu. Prawy panel: indywidualne opóźnienie ucieczki w 6. sesji.

Dane pokazane w (B) są przedstawione jako średnia ± SD, a dane pokazane w (C) są przedstawione jako średnia ± SEM. Istotność statystyczną oceniano za pomocą niesparowanego testu t (B), dwuczynnikowej ANOVA z porównaniem post hoc Bonferroniego (C, lewy panel) lub jednoczynnikowej ANOVA z testem post hoc Tukeya (C, prawy panel). Różnice statystyczne: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" i="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f-3p="" w="" porównaniu="" z="" innymi;="" #mir-gąbka="" kontra="">

neurony w hipokampie myszy GLN i PLN (ryc. S3). Odkrycia te pokazują, że regulacja w górę hipokampa miR-466f-3p sprzyja odrostowi neurytów i tworzeniu kolców dendrytycznych, co jest podobne do indukcji gęstości kolców obserwowanej w hipokampie myszy GLN w porównaniu z myszami PLN.

miR-466f-3p pozytywnie moduluje uczenie przestrzenne myszy ipamięćwydajność, a także plastyczność synaptyczna

Aby zbadać, czy miR-466f-3p pozytywnie reguluje uczenie przestrzenne myszy ipamięćAby utworzyć nadekspresję miRNA w hipokampie myszy, zastosowaliśmy podejście do infekcji rekombinowanym lentiwirusem. Myszy analizowano 7 dni po wstrzyknięciu lentiwirusa do DG (Figura 3A). Reprezentatywne obrazy poziomów ekspresji miR-466f-3p w stawie biodrowym były rzeczywiście podwyższone w grupie z nadekspresją miR-466f-3p w porównaniu z grupą kontrolną (prawy histogram na rysunku 3B). Stwierdziliśmy, że myszy z hipokampową nadekspresją miR-466f- 3p i poddane zadaniu MWM wykazywały opóźnienia ucieczki 88 ± 5 s w pierwszej sesji i 19 ± 1 s w szóstej sesji (czerwone linia kropkowana, Figura 3C), które były lepsze niż dla myszy kontrolnych wektora (linia czarna) lub myszy kontrolnych zmutowanych (linia czerwone kółko) i podobne do latencji ucieczki myszy GLN opisanych na Figurze 1A. Równolegle zbadaliśmy wpływ utraty funkcji miR-466f-3p na uczenie przestrzenne ipamięćpoprzez hamowanie miR-466f-3p za pomocą gąbki miR. Warto zauważyć, że wydajność MWM myszy, u których hipokamp miR-466f-3p został uwięziony przez gąbkę miR, była podobna do wydajności myszy PLN, tj. nie nauczyły się one znajdować platformy nawet przez ostatnia sesja (ciągła zielona kwadratowa linia,

Rysunek 3C). Co więcej, myszy, którym wstrzyknięto lentiwirus, nie wydawały się zaburzać plastyczności homeostazy, ponieważ niektóre myszy w każdej grupie nauczyły się lub przynajmniej były w trakcie uczenia się podczas ostatniej sesji (ryc. 3C, prawy histogram).

Biorąc pod uwagę, że nadekspresja miR-466f-3p w hipokampie myszy poprawiła ich zdolność uczenia się ipamięćmożliwości, przeanalizowaliśmy porównawczą elektrofizjologię hodowanych neuronów hipokampa wyrażających różne poziomy miR-466f-3p. Miniaturowy pobudzający prąd postsynaptyczny (mEPSC) z neuronów hipokampa DIV14 z nadekspresją miR-466f-3p lub mut-miR-466f-3p, gąbki miR lub kontroli był nagrany za pomocą patch clamp całych komórek. Podczas gdy nie było znaczących różnic w amplitudzie mEPSC, wzroście Tau lub zaniku Tau wśród czterech zestawów próbek, częstotliwość mEPSC neuronów z nadekspresją miR-466f-3p była znacznie wyższa w porównaniu z inne grupy (Figura 4A), wskazując, że postsynaptyczne receptory glutaminergiczne były silniej aktywowane po nadekspresji miR-466f- 3p.

Następnie zmierzyliśmy długoterminowe wzmocnienie (LTP), aby bezpośrednio określić rolę miR-466f-3p w plastyczności synaptycznej in vivo. Wstrzyknęliśmy do hipokampu myszy rekombinowany lentiwirus, jak opisano na rysunku 3, a następnie wywołaliśmy LTP w plasterkach hipokampa przez stymulację tężcową (trzy ciągi stymulacji o wysokiej częstotliwości [3xHFS]) szlaku obocznego Schaffera. Odkryliśmy, że nasz protokół indukował LTP we wszystkich grupach, czego dowodem jest utrzymujący się wzrost pola pobudzających potencjałów postsynaptycznych (fEPSP) w regionie rogówki amonu 1 (CA1) (ryc. 4B, lewy panel). LTP było silniejsze w przekrojach z nadekspresją miR-466f-3p (188% ± 2 procent linii bazowej po 40-50 minutach po stymulacji, średnia ± SEM) w porównaniu z mutantem (169% ± 1 procent wartości wyjściowej), gąbka SCR (173 procent ± 3 procent wartości wyjściowej) i skrawki zakażone wirusem kontrolnym (159 procent ± 2 procent wartości wyjściowej), jako hamowanie miR-466f-3p przez Gąbka miR zmniejszyła LTP (128 procent ± 1 procent linii podstawowej) w stosunku do kontroli (Figura 4B, prawy panel). Zmierzyliśmy również LTP grup GLN i PLN po treningu. Odpowiednie dane ujawniły również istotne różnice w nachyleniu fEPSP w regionie CA1 między grupami GLN i PLN (ryc. 4C). Zatem podwyższony poziom miR-466f-3p zwiększa LTP i plastyczność synaptyczną, co z kolei może promować uczenie się ipamięćzdolność myszy. Łącznie dane przedstawione na rysunkach 2, 3 i 4 pokazują, że miR-466f-3p odgrywa krytyczną pozytywną rolę w uczeniu się przestrzennym ipamięćformacji, prawdopodobnie poprzez zwiększenie tworzenia się kręgosłupa, LTP i siłę plastyczności synaptycznej.

mRNA Mef2a jest celem regulacyjnym miR-466f-3p

Przeprowadziliśmy analizę bioinformatyczną, aby zidentyfikować potencjalne docelowe mRNA regulowane przez wiązanie miR-466f-3p z ich 30 UTR. Wśród zidentyfikowanych przez nas kandydatów był mRNA Mef2a kodujący MEF2A. Co ciekawe, wcześniej stwierdzono, że ekspresja MEF2A była regulowana w dół po treningu MWM, a nadekspresja tego czynnika wywierała negatywny wpływ na wydajność myszy (Cole et al., 2012). Dlatego zastosowaliśmy test reporterowy lucyferazy, aby zbadać, czy miR-466f-3p reguluje translację mRNA Mef2a poprzez wiązanie z jego 30 UTR. Wprowadziliśmy sekwencje UTR typu dzikiego lub zmutowane Mef2a 30 poniżej cDNA lucyferazy (Luc) kierowanego przez promotor SV40-w wyniku czego otrzymano plazmid reporterowy psiCHECK2-MEF2A 30 UTR lub psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Figura 5A). Jak pokazano na lewym histogramie Figury 5B, koekspresja miR-466f-3p osłabiała ekspresję lucyferazy kierowaną przez Mef2a 30 UTR. Efekt ten wydawał się zależny od interakcji między miR-466f-3p i Mef2a 30 UTR, ponieważ mutacja przewidywanego miejsca wiązania miR-466f-3p na Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) lub region zarodkowy miR-466f-3p (50-AUACACA-30) rozpoznanie Mef2a 30 UTR znosiło hamujący wpływ miR-466f-3p na aktywność lucyferazy (Figura 5B, środkowy histogram). Co więcej, koekspresja gąbki miR, ale nie gąbki CR, również eliminowała efekt represyjny miR-466f-3p na aktywność lucyferazy (Figura 5B, prawy histogram). Warto zauważyć, że ani nadekspresja miR-466f-3p ani gąbki miR nie miały żadnego wpływu na poziomy mRNA Mef2a w pierwotnych neuronach hipokampa (ryc. 5C), ale odpowiednio zmniejszyły lub zwiększyły poziom białka MEF2A (Figura 5D). Odkryliśmy również, że nadekspresja odpowiednio miR-466f-3p lub miR-gąbki obniżała lub zwiększała poziom mRNA regulowanego przez aktywność białka związanego z cytoszkieletem (Arc) w pierwotnych neuronach hipokampa (ryc. 5C) , który był znanym celem dalszego łańcucha, pozytywnie regulowanym przez MEF2A (Flavell i in., 2006)

Przeprowadziliśmy również hybrydyzację fluorescencyjną in situ (FISH) w celu wykrycia miR-466f-3p i połączyliśmy ją ze znakowaniem IF MEF2A w pierwotnych neuronach hipokampa DIV14 bez lub z leczeniem forskoliną. Wiadomo, że forskolina indukuje chemiczne LTP i aktywuje cyklazę adenylylową, podnosząc w ten sposób wewnątrzkomórkowy poziom cAMP. Zaobserwowaliśmy kolokalizację jądrową MEF2A z miR-466f- 3p, co ilustrują reprezentatywne obrazy na Ryc. 5E. Jednak po stymulacji forskoliną sygnał miR-466f-3p wzrósł zarówno w somie, jak i w dendrytach, podczas gdy sygnał MEF2A w

jądro zmniejszyło się, jak pokazano na podstawie wzajemnych zmian intensywności sygnałów odpowiednio MEF2A i Fast Red poszczególnych komórek neuronalnych (Figura 5E). Podsumowując, dane na Figurach 5A-5E wskazują, że miR-466f-3p ujemnie reguluje ekspresję białka MEF2A, wiążąc się z 30 UTR mRNA Mef2a iw konsekwencji hamując jego translację.

Zgodnie z powyższymi wynikami, stwierdziliśmy, że poziomy białka MEF2A w hipokampie były obniżone u myszy GLN po treningu MWM, ale nie u myszy PLN (Rysunek 5F). Ponadto względne poziomy MEF2A u poszczególnych myszy GLN (kropki) i myszy PLN (kwadraty) były odwrotnie skorelowane z poziomami miR-466f-3p (R=0.60, Rysunek 5G). Zatem heterogeniczne wzorce przestrzennego uczenia się ipamięćzdolność jest modulowana przez stochastyczne wzrosty miR- 466f-3p hipokampa u poszczególnych myszy i wynikające z tego spadki MEF2A po stymulacji aktywności neuronalnej.

Stochastyczna aktywacja hipokampa CREB i wynikająca z tego transkrypcyjna regulacja w górę klastra miR- 466-669 podczas treningu MWM

Zbadaliśmy mechanizmy, dzięki którym miR-466f-3p w hipokampie myszy może być stochastycznie podwyższony przez zadanie MWM. Istnieją trzy prekursory miRNA kodujące miR-466f-3p, z których wszystkie należą do specyficznego dla gryzonia klastra miR-466-669 zlokalizowanego w intronie 10 jego genu gospodarza, mSfmbt2 (Inoue et al. ., 2017) (Rysunek 6A). Co ciekawe, w przeciwieństwie do miR-466f-3p, nie było znaczącej różnicy w poziomach ekspresji mSfmbt2 między grupami GLN i PLN (Rysunek 6B), co sugeruje, że klaster miR-466-669 może kodować oddzielny transkrypt zamiast być częścią pierwotnego transkryptu mSfmbt2. W związku z tym zaprojektowaliśmy kilka zestawów starterów do identyfikacji przypuszczalnego pierwotnego transkryptu klastra miR-466-669 za pomocą RT-qPCR. Jak przedstawiono na figurze 6A, długi fragment PCR (plus 282 do 2381), wraz z serią nakładających się prążków qPCR, mianowicie A (plus 282 do 115), B (131 do 406), C (388 do 686), D (od 662 do 1028), E (od 1004 do 1299), F (od 1242 do 1629), G (od 1605 do 2029) i H (od 2005 do 2381) wykryto w hipokampie myszy, ale nie w części I (od 2306 do 2776). ) (dane nie pokazane). Dane te potwierdzają, że klaster miR-466-669 kodował długi transkrypt w pobliżu około 2388 pz w górę od pierwszego prekursora miRNA (tj. pre-mir-466m, oznaczonego plus 1 na Figurze 6A). Co ciekawe, podobnie do tego, co odkryliśmy dla miR-466f-3p, średni poziom tego transkryptu w hipokampie myszy GLN był wyższy niż dla myszy PLN (Figura 6C). W ten sposób ulepszone uczenie się ipamięćZdolność myszy GLN wynika z aktywacji transkrypcyjnej klastra miR-466-669.

Aktywacja jądrowego CREB przez fosforylację podczas zadań MWM lub w innych formach uczenia się jest krytycznym krokiem do przekształcenia krótkoterminowego w długoterminowypamięć(Lisman i in., 2018; Rogerson i in., 2014). Dlatego zbadaliśmy, czy różne poziomy miR-466f-3p wśród poszczególnych myszy, które przeszły zadanie MWM, mogą być skorelowane ze stanem aktywacji CREB. Aby zbadać tę ideę, najpierw zbadaliśmy poziomy fosforylacji hipokampa CREB u poszczególnych myszy. Jak pokazano na Figurze 6D, aktywacja CREB (przez fosforylację w reszcie S-133) była wzmocniona u myszy GLN w porównaniu z myszami PLN i HC. Potwierdziliśmy również, że miR-466f-3p był rzeczywiście koeksprymowany z pCREB w neuronach przez wykonanie miRNA ISH w połączeniu z barwieniem IF pCREB i MAP2 w pierwotnych neuronach hipokampa (Figura S2A). Ponadto pierwotne poziomy transkryptów klastra miR- 466-669 były dodatnio skorelowane z pCREB u myszy GLN (R=0.52), podczas gdy były ujemnie skorelowane z pCREB u myszy PLN (R=0 0,71) (Rysunek 6E). Sprawdziliśmy korelację między poziomami innego aktywnego czynnika, kinazy regulowanej sygnałem pozakomórkowym (pERK), a pierwotnymi poziomami transkryptu klastra miR-466-669. Odkryliśmy, że oba typy wytrenowanych myszy MWM wykazywały pozytywne korelacje między sygnałem klastra miR-466-669 a pERK (odpowiednio R=0.59 i 0,48; Ryc. S4A) i nie było różnicy w pERK/ Ekspresja tERK między tymi dwiema grupami (Rysunek S4B). Aby dokładniej wyjaśnić wpływ aktywacji CREB na podwyższenie regulacji transkrypcji klastra-466-669, a w konsekwencji,

indukcjamiR-466f-3p, zastosowaliśmy specyficzny inhibitor CREB,666- 15 (Xie et al., 2015), w połączeniu z leczeniem forskoliną pierwotnych neuronów hipokampa DIV14. Wiadomo, że forskolina aktywuje fosforylację CREB (Malhotra i wsp., 2015). Odkryliśmy, że wstępne traktowanie pierwotnych neuronów hipokampa 666-15 blokowało aktywację CREB indukowaną przez forskolinę (ryc. 6F) i zmniejszało poziomy miR-466f-3p i miR-466-669 transkrypt (Figury 6G i 6H). Równocześnie poziomy mRNA znanych genów docelowych pCREB nurr1 i homer1a (Bridi i wsp., 2017; Jensen i wsp., 2017) również uległy obniżeniu po leczeniu 666-15 (Figura 6H). Podsumowując, Figura 6 pokazuje, że stochastyczna aktywacja CREB w hipokampie subpopulacji myszy wsobnych poddanych zadaniu MWM indukuje transkrypcję klastra miR-466-669, a w konsekwencji indukcję miR-466f{23 }}p, zwiększając w ten sposób ich przestrzenne uczenie się ipamięćzdolność do lepszego wykonywania zadania.

DYSKUSJA

Zbadaliśmy możliwą rolę miRNA w modulowaniu różnych zdolności uczenia się przestrzennego ipamięćwśród myszy wsobnych C57BL/6J. Sugerujemy, że stochastyczna aktywacja CREB i wynikająca z niej regulacja w górę miR-466f-3p hipokampa przyczynia się do większego uczenia się przestrzennego ipamięćzdolności podgrupy naszych myszy testowych, prawdopodobnie z powodu miR-466f-3p pośredniczącego w hamowaniu translacji mRNA Mef2a, który kodujepamięćregulator ujemny MEF2A. Nasze odkrycia dostarczają scenariusza demonstrującego funkcjonalną i ewolucyjną rolę określonego miRNA w regulacji procesów poznawczych poprzez stochastyczną indukcję osi CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A przez bodźce środowiskowe.

Zadanie MWM było szeroko stosowane do badania różnych możliwości uczenia się przestrzennego ipamięćdla gryzoni. W normalnych warunkach gryzonie używają dalszych wskazówek do orientacji, co pozwala im uczyć się i zapamiętywać położenie ukrytej platformy w zadaniu. Większość naszych testowanych myszy C57BL/6J wsobnych (62%) wykazywała normalny wzorzec opóźnienia ucieczki, znajdując platformę w ciągu 30 s przez sesje 3-6 (Figura 1A, GLN). Natomiast grupa myszy (38 proc.) nie nauczyła się zadania nawet do 6 sesji (PLN). Warto zauważyć, że poddaliśmy myszy również dwóm innym testom rozpoznawania. Pierwszym był test rozpoznawania nowego obiektu (NOR), który jest pojedynczą próbą opartą na wrodzonej eksploracji bez wzmocnienia lub stresu w celu motywowania zachowania (Leger i in., 2013). Korelacja między zadaniami NOR i MWM pod względem wydajności myszy jest słaba (R {{1{{20}}}.13), co jest podobne do korelacji między wydajnościami NOR a poziomami ekspresji w hipokampie miR-466f-3p (R=0.01; dane nie pokazane). Test NOR nie wykazał również różnic we wskaźniku dyskryminacji między grupami MWM GLN i PLN (0,36 ± 0,25 vs 0,29 ± 0,18; Rysunek S1B). Inne uczenie przestrzenne ipamięć-zastosowane przez nas zadanie zależne to labirynt Barnesa (BM), który jest podobny do MWM. Opiera się na założeniu, że gryzonie umieszczone w nieprzyjemnym środowisku powinny poznać i zapamiętać położenie skrzynki ewakuacyjnej znajdującej się pod powierzchnią platformy. Jak pokazano na Figurze S1C, stwierdziliśmy, że wydajność myszy w próbach sondy BM jest również dodatnio skorelowana z poziomami ekspresji miR-466f-3p w hipokampie. Zatem indukcja osi CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A w hipokampie podczas uczenia się ipamięćformacja jest przestrzennie zależna od kontekstu.