Część 2 Mutacje ERCC1 utrudniają naprawę uszkodzeń DNA i powodują zaburzenia czynności wątroby i nerek u pacjentów

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Kliknij tutaj, aby przejść do części 1

Część 2

Kliknij, aby przejść do Cistanche NZ na chorobę nerek

Dyskusja

Nowy przypadek bi-alleliERCC1mutacje Tylko dwie osoby z bi-allelemERCC1do tej pory odnotowano mutacje, z których obie wykazywały cechy podobne do CS. Najciężej dotknięty osobnik (165TOR) miał wariant nonsensowny (Q158X) i wariant missense F231L w motywie (HhH)2 ERCC1 (ryc. S5 F), wykazywał opóźnienie wzrostu, niepowodzenie rozwojowe i przykurcze i zmarł po pierwszy rok życia z powodu zapalenia płuc (Jaspers i in., 2007). Drugi dotknięty chorobą osobnik (CS20LO) miał przykurcze, małogłowie i hipertonię, był homozygotyczny pod względem wariantu missense F231L i zmarł w drugim roku życia (Kashiyama i wsp., 2013).

Zgłaszamy dwoje rodzeństwa z bi-allelemERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) i allel zerowy z powodu delecji wewnątrzgenowej odziedziczonej po matce. Całe pozostałe białko ERCC1 eksprymowane w komórkach od tych pacjentów niesie podstawienie aminokwasu R156W, które przerywa mostek solny między dodatnio naładowaną resztą R156 a przeciwną, ujemnie naładowaną resztą D129 zlokalizowaną tuż poniżej kieszeni wiążącej XPA w domenie centralnejERCC1. Wpływ tej substytucji jest dwojaki: (1) silnie zmniejsza ogólną stabilność ERCC1 i jego partnera wiążącego XPF oraz (2) specyficznie wpływa na interakcję z XPA (ryc. 9).

Zmniejszone poziomy białka jądrowego ERCC1 z powodu częściowego nieprawidłowego fałdowania

Analizy Western blot i immunofluorescencji wykazały, żeERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) w endogennymERCC1locus komórek RPE1-hTERT. Co ciekawe, całkowita utrata ERCC1 u myszy doprowadziła do śmierci w ciągu 4 tygodni, podczas gdy zwiększenie poziomu białka do około 15% poziomu u myszy WT wydłużyło pięciokrotnie długość życia (Weeda i wsp., 1997), co sugeruje, że nawet niski poziom ERCC1 znacznie zwiększyć potencjał rentowności. Zgodnie z naszymi ustaleniami, poprzednie badania wykazały, że mutacje zmiany sensu w domenie centralnejERCC1ogólnie powodują destabilizację (Sijbers i wsp., 1996b), co wskazuje, że region ten jest ważny dla stabilności białka.

Niedawno ogłoszona kriogeniczna mikroskopia elektronowa struktury pełnej długościERCC1heterodimer -XPF (Jones et al., 2020) ujawnia, żeERCC1R156reszta znajduje się na samym skraju heterodimeru. Spekulujemy, że zwiększona objętość i zmieniona struktura elektronowa podstawienia argininy przez tryptofan nie tylko zaburza kieszonkę wiążącą XPA, ale także interfejs dimeryzacji między domeną centralną ERCC1 a domeną nukleazy XPF, powodując ogólną destabilizację (ryc. S5 F). Co ciekawe, wariant zmiany sensu XPFR799W znajduje się na tym samym interfejsie po stronie XPF (ryc. S5 F), a także powoduje destabilizację i poważnie obniżony poziom białka XPF (Mori i wsp., 2018). U jednego dotkniętego chorobą osobnika (CALIF1010), który prezentował cechy progeroidu podobne do CS i segmentowych, wariant XPFR799W został odziedziczony wraz z międzygenową delecją w innym allelu XPF, co skutkowało silnym defektem NER połączonym z łagodnym defektem naprawy ICL (Mori i al., 2018), podobnie jak rodzeństwo zgłoszone w niniejszym badaniu.

Ektopowa ekspresja indukowalnej wersjiERCC1R156Wprzez 24 godziny umożliwiło nam osiągnięcie poziomów WT tego zmutowanego białka, co spowodowało nieprawidłową lokalizację w cytoplazmie, zmniejszoną interakcję z XPF i zwiększoną interakcję z białkami opiekuńczymi, wykrytymi przez MS. Wszystkie te ustalenia potwierdzają pogląd, że:ERCC1R156Wjest częściowo nieprawidłowo sfałdowany i degradowany w komórkach pacjenta, co powoduje -80 procentową redukcję poziomu białka jądrowego ERCC1. KI ERCC1R156W w komórkach RPE1-hTERT potwierdza ten wniosek.

PorównującERCC1i poziomy białka XPF w komórkach PV46LD i PV50LD z tymi w komórkach od osób poważniej dotkniętych (165TOR i CS20LO), zauważyliśmy, że poziomy te były porównywalne, a być może nawet niższe, w komórkach rodzeństwa opisanych w tym badaniu (ryc. 3 C i ryc. S3, E i F; Jaspers i wsp., 2007; Kashiyama i wsp., 2013). Należy zauważyć, że CS20LO jest homozygotą dla ERCC1F231L, podczas gdy 165TOR jest heterozygotą i niesie dodatkowe przedwczesne zatrzymanie z drugiej stronyERCC1allel (Q158X). Odkrycia te sugerują, że oprócz obniżonych poziomów białka, funkcjonalność zmutowanego białka, które jest nadal eksprymowane, oraz połączenie dwóch zmutowanych alleli muszą być brane pod uwagę jako potencjalny modulator nasilenia i ekspresji fenotypowej.

ERCC1R156W: Zróżnicowany wpływ na zależne od ERCC1-szlaki naprawy DNA

Ekspresja ERCC1R156W-GFP w komórkach ERCC1-KO na poziomach podobnych do ERCC1WT umożliwiła oddzielenie wpływu podstawienia aminokwasu na stabilność białka od wpływu na funkcjonalność białka. Podczas gdy zmutowane białko ERCC1R156W było poważnie osłabione w indukowanej przez UV interakcji z XPA i rybami i nie było w stanie skutecznie zlokalizować miejsc uszkodzeń DNA indukowanych przez UV, nadal wykryliśmy znaczną (~40 procent) aktywność naprawczą w testach UDS, przeżycia klonogenne, oraz testy NER in vitro. Odkrycia te sugerują, że zmutowane białko ERCC1, które tylko bardzo słabo oddziałuje z kompleksem NER, może nadal wspierać znaczny poziom aktywności NER (~40 procent) wewnątrz komórek. Razem, odkrycia te sugerują, że niski poziom ekspresji ERCC1 (~20 procent) w połączeniu z resztkową aktywnością GGR zmutowanych białek, które wciąż ulegają ekspresji, zapewnia wystarczającą ochronę, aby zapobiec PV46LD i PV50LD przed rozwojem pełnego XP. Rzeczywiście, resztkowa aktywność GGR była nadal wykrywana w bardziej czułych warunkach w testach UDS w porównaniu z fibroblastami od poważnie dotkniętego i podatnego na raka pacjenta XP-A. Niemniej jednak obaj pacjenci mogą nadal być narażeni na ryzyko rozwoju raka skóry, dlatego zaleca się ochronę przed światłem słonecznym. Aktywność resztkowa w komórkach PV46LD i PV50LD była podobna lub niższa niż aktywność naprawcza, którą wykryliśmy w komórkach 165TOR lub CS20LO (ryc. 6 J; Jaspers i wsp., 2007; Kashiyama i wsp., 2013). Zatem ciężkość kliniczna nie koreluje z aktywnością NER, ale prawdopodobnie wynika z roli ERCC1 poza NER, która jest ważna podczas rozwoju.

Pomimo naszych ustaleń, że ERCC1R156W wykazywał zmniejszoną interakcję z SLX4 i był również mniej wydajnie rekrutowany do miejsc lokalnej indukcji ICL, dalsza analiza wykazała, że ​​zmutowane białko ERCC1R156W miało jedynie niewielki wpływ na wspomaganie naprawy ICL, gdy ektopowo ulegał ekspresji w ERCC1- komórki KO. Jednak wpływ na naprawę ICL był znacznie łagodniejszy niż wpływ podstawienia R156W na NER, co w połączeniu z wcześniejszymi odkryciami, że naprawa ICL wymaga znacznie mniej białka ERCC1 niż naprawa uszkodzeń DNA specyficznych dla NER (Jaspers et al. , 2007; Sijbers i wsp., 1996b), mogą bardzo dobrze wyjaśnić łagodny wpływ na naprawę ICL. W fibroblastach pacjentów, które mają silnie obniżone poziomy ERCC1, wykryliśmy umiarkowaną wrażliwość, a także zwiększone pękanie chromosomów po ekspozycji na związek MMC indukujący ICL, aczkolwiek znacznie łagodniejszy niż komórki od pacjenta z FA, które zostały włączone równolegle. Co ważne, ani PV46LD, ani PV50LD nie wykazywały żadnych wyraźnych oznak cech klinicznych podobnych do FA, co sugeruje, że zmutowane białko ERCC1R156W zapewnia wystarczającą ochronę przed niskim endogennym obciążeniem ICL u tych pacjentów.

Niedobór ERCC1 powoduje zaburzenia czynności wątroby i nerek

Myszy, które są KO dla ERCC1 lub XPF wykazują silne bieganie (tj. mniejsze i słabsze niż myszy WT) i umierają przed pierwszymi 4 tygodniami życia z powodu ciężkiej niewydolności wątroby (McWhir i wsp., 1993; Sijbers i wsp., 1996b; Tian i wsp., 2004; Weeda i wsp., 1997). Specyficzna dla wątroby ekspresja ERCC1 u tych myszy częściowo skorygowała mniejszy rozmiar i wydłużony czas życia do 12 tygodni, ale także ujawniładysfunkcja nerekoraz niewydolność nerek jako wtórną przyczynę śmierci (Selfridge et al., 2001). Myszy KO specyficzne dla XP lub FA nie wykazują choroby wątroby, co sugeruje, że ten fenotyp nie jest spowodowany defektem naprawy NER lub ICL. Możliwe, że częściowa redundancja między tymi dwoma szlakami, która jest tracona u myszy ERCC1-KO z niedoborem obu szlaków, może wyjaśnić ten fenotyp. Zgodnie z tą ideą hepatocyty ikomórki kanalika bliższego nerkistał się poliploidalny u myszy ERCC1-KO i zgromadził wysokie poziomy p53 (McWhir i wsp., 1993; Selfridge i wsp., 2001; Weeda i wsp., 1997), co sugeruje, że akumulacja endogennych uszkodzeń DNA w tych narządach może wystąpić. Dokładny charakter tej endogennej zmiany DNA pozostaje jednak niejasny.

Co ciekawe, myszy ze stawową inaktywacją naprawy zarówno NER, jak i ICL nie wykazują dysfunkcji wątroby, co sugeruje, że redundancja między tymi szlakami naprawy DNA nie jest jedynym wyjaśnieniem i że dodatkowa funkcja ERCC1-XPF poza tymi szlakami naprawy DNA przyczynia się do niewydolności wątroby (Mulderrig i Garaycoechea, 2020). Możliwe, że ERCC1-XPF jest zaangażowany w dodatkowe szlaki naprawy DNA, które zajmują się endogennymi uszkodzeniami DNA. Na przykład ostatnio wykazano, że ERCC1-XPF działa na alternatywne struktury DNA, takie jak Z-DNA, podczas których współpracuje z białkami naprawiającymi niedopasowania, a nie z czynnikami naprawczymi NER lub ICL (McKinney i wsp., 2020). Ponadto wykazano, że ERCC1-XPF jest zaangażowany w podścieżkę naprawy przez wycinanie bazy wraz z helikazą RECQ1 (Woodrick et al., 2017).

Dwoje rodzeństwa (PV46LD i PV50LD) w tym badaniu wykazywało brak rozwoju, niski wzrost i brak podskórnej tkanki tłuszczowej, co przypomina mały rozmiar obserwowany u myszy ERCC1-KO (McWhir i wsp., 1993; Selfridge i wsp., 2001; Weeda i wsp., 1997). Co więcej, u rodzeństwa wystąpiły zaburzenia czynności wątroby z głównie obrazem cholestatycznym, które doprowadziły do ​​przeszczepu ortotopowego wątroby przed ukończeniem 9 roku życia. Ta interwencja wyraźnie zapobiegła przedwczesnej śmierci, ale nie poprawiła braku rozwoju, co widać na podstawie wzrostu masy ciała, wzrostu i obwodu głowy znacznie poniżej trzeciego centyla po przeszczepie.

Co ciekawe, cholestatyczna choroba wątroby została zgłoszona jako powszechna cecha u egipskich pacjentów z CS, co sugeruje, że należy ją ściślej monitorować u pacjentów z CS o innym pochodzeniu etnicznym, aby sprawdzić, czy jest to częstsza cecha niż wcześniej rozpoznawana (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Chociaż nie opisano żadnych nieprawidłowości wątroby u pacjentów z XP, istnieją pewne przypadki cytolizy wątroby (rozpad lub pęknięcie komórek) u pacjentów z FA (Masserot-Lureau i wsp., 2012), które mogą różnić się od nieprawidłowości wątroby obserwowanych w ERCC 1- brakujące rodzeństwo. Badanie histologiczne biopsji wątroby od starszego rodzeństwa (PV50LD) ujawniło zmiany w morfologii hepatocytów z powiększeniem jądra i zmiennością, jak zauważono u myszy z niedoborem 1-ERCC (ryc. S1 D; N´uñez i wsp., 2000 ).

Druga przyczyna śmierci u myszy ERCC1-KO ze swoistą dla wątroby ekspresją ERCC1 była ciężkaniewydolność nerek(Selfridge i wsp., 2001). Oboje rodzeństwo wykazuje również dysfunkcję nerek, z cechami sugerującymi dysfunkcję kanalików proksymalnych prowadzącą do postępującejnerkaosłabienie. Jednak funkcja kanalików ustabilizowała się po przeszczepieniu wątroby, alenerkafunkcjonowaćwymaga stałego monitorowania. Fenotyp nerkowy myszy KO ERCC1- — z rozszerzonymi kanalikami zawierającymi wyciekający materiał białkowy odpowiadający tubulopatii (McWhir i wsp., 1993; Selfridge i wsp., 2001; Weeda i wsp., 1997) — jest podobny w porównaniu z pacjentami opisanymi w naszym badaniu. Co więcej, zaburzenia czynności nerek i, w niektórych przypadkach, niewydolność zostały zgłoszone w połączeniu XP/CS (Ben Chehida i wsp., 2017; Kondo i wsp., 2016; Kralund i wsp., 2013) oraz CS (Funaki i wsp., ., 2006; Reiss i wsp., 1996; Sato i wsp., 1988), natomiast związek między FA a anomaliami strukturalnyminerkahas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) zmarły w wieku 37 lat (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. Pacjenci z defektami białek naprawczych poprzez wycięcie nukleotydów ERCC1 lub XPF wykazują xeroderma pigmentosum z późnym początkiem ciężkiego zwyrodnienia neurologicznego [Streszczenie] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Chociaż nie zgłoszono żadnego uszkodzenia wątroby, u tego pacjenta w wieku 15 lat rozwinęła się poważna atrofia mózgu, która rozwinęła się w postępującą neurodegenerację z demencją. U obu rodzeństwa w wieku 13 i 11 lat zaobserwowano również łagodny zanik mózgu, co wskazuje, że rozwój neurologiczny obojga rodzeństwa powinien być uważnie monitorowany.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers i in., 2007; Niedernhofer i wsp., 2006) przedstawili fenotyp, który częściowo pokrywa się z opisywanym tu rodzeństwem, w tym nadwrażliwość na światło bez raka skóry, niski wzrost, brak podskórnej tkanki tłuszczowej, opóźnienie rozwoju i niewydolność nerek (Niedernhofer i wsp., 2006). W odróżnieniu od rodzeństwa opisywanego tutaj, chłopiec ten wykazywał wyraźne odcinkowe cechy progeroidalne, ale znacznie łagodniejszy obraz wątroby bez cholestazy. Opisane tutaj rodzeństwo pokazuje, że bi-alleliczne mutacje ERCC1 mogą powodować szereg fenotypów, od typowego obserwowanego w CS do fenotypu obejmującego łagodniejszy niski wzrost, nadwrażliwość na światło i ciężką wątrobę inerkaosłabienie, potencjalnie z powodu połączonego silnego wpływu na NER i jednoczesnego wpływu na naprawę ICL, co może szczególnie dotyczyć tych narządów.

Materiały i metody

Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu są zgodne ze standardami etycznymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Człowieka Królewskiego Szpitala Dziecięcego w Melbourne w stanie Wiktoria w Australii (HREC36291C) oraz Komitet ds. Etyki w Wielkiej Brytanii w regionie North East – Newcastle i North Tyneside 2. Pacjenci zostali zrekrutowani do Programów Chorób Niezdiagnozowanych dla pacjentów pediatrycznych z domniemanymi „sierocymi” zaburzeniami Mendla. Próbki śliny lub krwi od pacjentów i członków ich rodzin pobrano do ekstrakcji genomowego DNA po wyrażeniu pisemnej świadomej zgody. Rodzice wyrazili zgodę na pokazanie niezredagowanych zdjęć rodzeństwa dotkniętego chorobą na ryc. 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T został zidentyfikowany u obu dotkniętych chorobą osobników w eksonie 4 z 8 genu ERCC1. Podczas wstępnego badania danych z egzomu u obu dotkniętych chorobą osobników ten wariant wydawał się być w stanie homozygotycznym, ale był obecny w stanie heterozygotycznym u ojca i nieobecny u matki, co sugeruje możliwą delecję w allelu matki. Wariant zmiany sensu jest obecny w bazie danych gnomAD z częstością 00,01 procent (22 heterozygoty, brak homozygot) i nie był wcześniej zgłaszany u osób dotkniętych chorobą. Wariant missense został zdeponowany w bazie danych LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 i http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) oraz w bazie ClinVar ( identyfikator odmiany: 978472).

Wykrywanie usunięcia przez qPCR

W celu wykrycia delecji, genomowy DNA wyekstrahowano z limfocytów/komórek nabłonkowych, a odpowiedni region genu ERCC1 zamplifikowano w qPCR. qPCR przeprowadzono przy użyciu sond i specyficznych starterów (wymienionych w Tabeli S1) zaprojektowanych przy użyciu Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) i zsyntetyzowanych przez Sigma-Aldrich. Startery zaprojektowano tak, aby obejmowały region z delecją w eksonie 4 i region w obrębie genu, który nie został usunięty jako kontrola (egzon 5). Przeprowadzono multipleks qPCR z użyciem mieszaniny reakcyjnej LightCycler R 480 Probes Master (Roche) zgodnie z protokołem producenta w celu amplifikacji i ilościowego oznaczenia regionu genu ERCC1, przy użyciu genu CFTR (egzon 27) jako standardu wewnętrznego (Tabela S1). qPCR przeprowadzono na aparacie LightCycler R 480 (Roche), a analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania LightCycler R 480 w wersji 1.5.0 (Roche). W celu interpretacji zmienności sekwencji postępowano zgodnie z wytycznymi American College of Medical Genetics.

Wykrywanie wariantu missense przez sekwencjonowanie Sangera

Genomowy DNA wyizolowano przez ponowne zawieszenie osadu komórek w buforze lizatu całych komórek (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8,0,25 mM MgCl2, {{12} },1 mg/ml żelatyny, 0,45% Tween-20 i 0,45% NP-40) zawierające 0,1 mg/ml proteinazy K (EO0491; ThermoFisher Scientific) i inkubowane przez 1 h w 56°, a następnie 10-min inaktywacja termiczna proteinazy K w 96°. Fragmenty o długości ~1 kb obejmujące mutacje zmiany sensu amplifikowano metodą PCR (startery do sekwencjonowania wymieniono w Tabeli S1), po czym przeprowadzono sekwencjonowanie Sangera przy użyciu startera przedniego lub startera wstecznego.

Linie komórkowe

Linie komórkowe fibroblastów ustalono na podstawie biopsji skóry zarówno od osób dotkniętych chorobą, jak i od rodziców. Wszystkie linie komórkowe (wymienione w tabeli S2) hodowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% indu CO2 (Thermo Fisher Scientific) uzupełnionej penicyliną/streptomycyną (Sigma-Aldrich) i 10% FBS (Bodinco BV). Wszystkie linie komórkowe były rutynowo testowane pod kątem infekcji mykoplazmą.

Unieśmiertelnienie fibroblastów za pomocą hTERT

Fibroblasty WT (48BR) i PV50LD unieśmiertelniono przez nukleofekcję p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) przy użyciu Amaxa Nucleofector (program U23). Każda elektroporacja zawierała 400 000 fibroblastów i 2,5 µg plazmidowego DNA. Po elektroporacji komórki wysiano w 25-cm2 kolbach do hodowli tkankowych zawierających 5 ml DMEM i 10% FBS. Po 2 dniach pożywkę hodowlaną zastąpiono pożywką zawierającą 20 µg/ml neomycyny.

/streptomycyna (Sigma-Aldrich) i 10% FBS (Bodinco BV). Wszystkie linie komórkowe były rutynowo testowane pod kątem infekcji mykoplazmą.

Konstrukcje plazmidowe

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>Mutacje T w ERCC1. Produkt nakładającego się PCR wstawiono jako fragment NheI i AgeI w celu wytworzenia dużej ilości CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT i ERCC1R156W zostały wstawione jako fragmenty NheI i AgeI do pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 w celu wygenerowania pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFP i pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Ukierunkowaną mutagenezę zastosowano do wprowadzenia mutacji punktowych w pMacro Bac-XPF-ERCC1WT przy użyciu zestawu do mutagenezy KOD-plus (Toyobo), jak opisano w protokole producenta, przy użyciu starterów wymienionych w Tabeli S1. Wszystkie sekwencje zweryfikowano przez sekwencjonowanie Sangera.

Generacja komórki KO

linie do generowania pojedynczych komórek KOs, U2OS(FRT) i RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) kotransfekowano z pLV-U6g-PPB kodującym kierujący RNA z Leiden University Medical Center/Sigma -Biblioteka Aldrich single-guide RNA (sgRNA) (patrz Tabela S3 dla plazmidów i Tabela S4 dla sekwencji sgRNA) ukierunkowana na gen ERCC1 wraz z wektorem ekspresyjnym kodującym Cas{11}}A-GFP (pX458; Addgen #48138) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfekowane komórki U2OS(FRT) selekcjonowano na puromycynie (1 µg/ml) przez 3 dni i wysiewano w niskiej gęstości, po czym izolowano poszczególne klony. Transfekowane komórki RPE1-hTERT posortowano FACS na BFP/GFP i wysiano w niskiej gęstości, po czym wyizolowano poszczególne klony. Klony KO zweryfikowano za pomocą analizy Western blot. Brak integracji/stabilnej ekspresji Cas9 potwierdzono metodą Western blot.

Generowanie stabilnych linii komórkowych

Pojedynczy klon KO ERCC1 w tle U2OS(FRT) (patrz tabela S2) użyto do stabilnej ekspresji ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP lub GFP-NLS przez kotransfekcję pcDNA5-FRT-TO-puroplazmidu cDNA (2 µg) wraz z plazmidem pOG44 kodującym rekombinazę Flp (00,5 µg). Populację komórek poliklonalnych otrzymano po selekcji na 1 µg/ml puromycyny i 4 µg/ml blastycydyny S. Ekspresję znakowanych przez GFP białek ERCC1 lub GFP-NLS indukowano przez dodanie 2 µg/ml doksycykliny przez 24 godziny.

Generowanie linii komórkowych KI

Aby wygenerować homozygotyczne KI, komórki RPE{0}}hTERT najpierw traktowano przez 30 minut 1 µM inhibitorem DNA-PK (NU7441), aby zahamować podatną na błędy naprawę DSB i zwiększyć wykorzystanie naprawy zależnej od homologii. Następnie 350 000 komórek zawieszono ponownie w 20 µl buforu nukleofektorowego (V4XP-3032; Lonza) w obecności 4,5 µg plazmidu zawierającego Cas9 i sgRNA celującego w gen ERCC1 (patrz Tabela S3 dla plazmidów i Tabela S4 forsgRNA) i 100 µM jednoniciowego DNA dawcy zawierającego mutację pacjenta, jak również ciche mutacje, aby zniszczyć miejsce PAM, aby zapobiec ponownemu cięciu przez Cas9 i ciche mutacje, aby wprowadzić miejsce restrykcyjne Hindlll, aby ułatwić badanie przesiewowe klonów KI. Komórki poddano elektroporacji przy użyciu jednostki Amaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) przy użyciu programu EA-104. Po elektroporacji komórki wysiano w niskiej gęstości w pożywce McCoy z 10% FBS. Następnego dnia pożywkę zastąpiono DMEM (10% FBS i 1% penicylina/streptomycyna) i pozwolono komórkom utworzyć kolonie. Wyizolowano i rozszerzono około 400 kolonii. Wyizolowano genomowy DNA, a fragment zawierający wprowadzoną mutację i wprowadzone miejsce restrykcyjne (Hindlll) zamplifikowano metodą nested PCR (startery patrz Tabela S1). Fragmenty PCR trawiono Hindlll (NEB) przez 3 godziny w temperaturze 37°C, a następnie rozdzielono metodą elektroforezy żelowej. Klony, które miały wprowadzone miejsce restrykcyjne HindIII analizowano przez sekwencjonowanie Sangera (startery patrz Tabela S1). Otrzymaliśmy dwa homozygotyczne klony KI spośród 400 izolowanych klonów, co odpowiada wydajności KI ~0,5 procenta.

Transdukcja lentiwirusowa

w celu transdukcji lentiwirusa mVenus-ERCC1WT lub mVenus ERCC1R156W wstawiono do wektora lentiwirusowego pLenti-CW57-TO. HEK293T transfekowano wektorami kodującymi te fuzje ERCC1, VSV-G, RRE i REV przy użyciu JetPEI (Sigma Aldrich) do wytworzenia wirusa. Supernatant zawierający wirus zebrano po 24 godzinach i przesączono przez filtr 0.44-µm. Pierwotne fibroblasty PV46LD i PV50LD poddano transdukcji lentiwirusowej w obecności polibrenu (Sigma-Aldrich). Komórki selekcjonowano za pomocą 15 µg/ml puromycyny. Ekspresję białek ERCC1 znakowanych mVenus indukowano przez dodanie 2 ug/ml doksycykliny na 24 godziny.

Klonogeniczne testy przeżycia

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >Zliczono 20 komórek. Eksperymenty przeżycia przeprowadzono w dwóch powtórzeniach i powtórzono co najmniej dwa razy.

Immunoprecypitacja dla Co-IP

Komórki poddano pozornemu działaniu lub napromieniowaniu UV-C (20 J/m2) i zebrano po 1 godzinie. Osady komórkowe lizowano przez 20 min na lodzie w buforze EBC-150 (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM MgCl2 i inhibitor proteazy koktajl [Roche]) uzupełniony 500 U/ml Benzonase Nuclease (Novagen). Lizaty komórkowe inkubowano przez 1,5 godziny w 4 stopniach z kulkami GFP-Trap A (Chromotek). Następnie kulki przemywano sześciokrotnie buforem EBC-150 (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 1 mM EDTA i koktajl inhibitora proteazy) i gotowano w Laemmli-SDS bufor próbki.

Zachodnia plama

Komórki odwirowano, przemyto PBS i gotowano przez 10 min w buforze Laemmli (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35 procent SDS, 16,5 procent glicerol, 0,0005 procent błękit bromofenolowy i 0,05). M-ditiotreitol). Białka rozdzielono na 4-12-procentowych żelach Criterion XT Bis-Tris (#3450124; Bio-Rad) w buforze NuPAGE MOPSrunning (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) i przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu (IPFL00010; EMD Millipore ). Membranę zablokowano buforem blokującym (MB-070-003; Rockland) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Membranę następnie sondowano przeciwciałami (wymienionymi w Tabeli S5), jak wskazano. Do wykrywania zastosowano system Odyssey CLx (LI-COR Biosciences).

Test odzyskiwania RNA (RRS)

30,000 komórki wysiano na 12-mm szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach w DMEM z 1% FBS. Po 24 godzinach komórki naświetlano UV-C w dawce 6 J/m2 i inkubowano w kondycjonowanej pożywce przez różne okresy czasu ({{20}} godz., 3 godz. i 18 godz.). Po inkubacji powstałe transkrypty znakowano przez inkubowanie komórek z 400 µM 5-etynylourydyną (CLK-N002-10; Jena Bioscience), którą następnie wizualizowano za pomocą mieszaniny Click-iT składającej się z 50 mM bufor Tris, pH 8,0, 60 µM Atto Azydek (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM kwas L-askorbinowy (A0278; Sigma-Aldrich) i 0,1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) przez 1 godz. Komórki przemywano trzykrotnie przez 5 min PBS i mocowano na szkiełkach mikroskopowych (Thermo Fisher Scientific) przy użyciu Aqua Polymount (Brunschwig).

Immunofluorescencja

Do barwienia immunofluorescencyjnego 250,000 komórek wysiano na 18-mm szklanych szkiełkach nakrywkowych. Następnego dnia komórki utrwalono 4% paraformaldehydem, a następnie poddano permeabilizacji za pomocą {{10}}0,5% Triton X-100 przez 10 min. Komórki traktowano 100 glicynami w PBS przez 10 min w celu zablokowania nieprzereagowanych grup aldehydowych, płukano PBS i równoważono w buforze do płukania (PBS zawierający 0,5% BSA i 0,05% Tween-20; Sigma-Aldrich) przez 10 min. Etapy przeciwciał i płukania znajdowały się w buforze do płukania. Pierwotne przeciwciała inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeciwciała drugorzędowe przez 1 godzinę i DAPI przez 5 minut. Pierwotne i drugorzędowe przeciwciała są wymienione w Tabeli S5. Komórki inkubowano z 0,1 µg/ml DAPI i mocowano przy użyciu Aqua Polymount.

Barwienie H2AX

200 000 komórek wysiano na 18-mm szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach z DMEM (10 procent FBS i 1 procent P/S). Następnego dnia komórki wystawiono na działanie IR za pomocą generatora rentgenowskiego YXlon International (200 KV, 4 mA; szybkość dawki 2 Gy/min). We wskazanych punktach czasowych komórki utrwalano 3% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut i barwiono H2AX przez 1 godzinę (patrz powyżej). Obrazy oceniano ilościowo za pomocą niestandardowego makra w ImageJ, które umożliwiało automatyczną i obiektywną analizę liczby ognisk na komórkę, jak opisano wcześniej (Typas i in., 2015).

Analiza mikroskopowa utrwalonych komórek

Obrazy utrwalonych próbek uzyskano za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AxioImagerM2 lub D2 wyposażonego w obiektywy olejowo-imersyjne (Zeiss) 63x PLAN APO (1,4 apertura numeryczna [NA]) i lampę metalohalogenkową HXP 120 używaną do wzbudzania. Sondy fluorescencyjne wykrywano stosując następujące filtry dla DAPI (filtr wzbudzenia: 350/50 nm; lustro dichroiczne: 400 nm; filtr emisyjny: 460/50 nm), Alexa 555 (filtr wzbudzenia: 545/25 nm; lustro dichroiczne: 565 nm ; filtr emisyjny: 605/70 nm) lub Alexa 647 (filtr wzbudzenia: 640/30 nm; zwierciadło dichroiczne: 660 nm; filtr emisyjny: 690/50 nm). Obrazy rejestrowano za pomocą oprogramowania ZEN 2012 i analizowano w ImageJ.

Mikronaświetlanie laserem UV

Komórki hodowano na szkiełkach nakrywkowych 18-mm kwarcowych (UV-C) lub szklanych (UV-A) i umieszczono w komorze magnetycznej Chamlide CMB, w której pożywkę hodowlaną zastąpiono niezależnym od CO2- Leibovitz L{ {4}} (Thermo Fisher Scientific). Ścieżki laserowe UV-C wykonano przy użyciu pompowanego diodowo lasera 266-mm itru Aluminium Granat na ciele stałym (średnia moc 5 mW, częstotliwość powtarzania do 10 kHz i długość impulsu 1 ns). Przed napromieniowaniem UV-Amicro, komórki albo uczulano 6 µM trioksalenem przez 1 godzinę w celu wytworzenia ICL lub 15 µM BrdU przez 24 godziny w celu wytworzenia DSB. Ścieżki laserowe UV-A zostały wykonane za pomocą pompowanego diodowo lasera 355-nm itru aluminium granat (średnia moc 14 mW i częstotliwość powtarzania do 200 Hz). Oba lasery zostały zintegrowane z systemem oświetlenia punktowego UGA-42-Caliburn/2L (Rapp OptoElectronic).

Mikronapromienianie połączono z obrazowaniem żywych komórek w komorze środowiskowej ustawionej na 37 stopni na całkowicie kwarcowym mikroskopie fluorescencyjnym Zeiss Axio Observer 7 o szerokim polu, przy użyciu ultrafiltrowego obiektywu glicerynowo-zanurzeniowego 100× (1,2 NA) (UV-C ) lub obiektyw immersyjny Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) (UV-A). System laserowy jest połączony z mikroskopem za pomocą TriggerBox, a filtr o neutralnej gęstości (ND-1) blokuje 90 procent światła laserowego. Do wzbudzenia użyto lampy metalohalogenkowej AnHXP 120-V. Obrazy uzyskano w Zeiss ZEN i oznaczono ilościowo w ImageJ.

Test na pękanie chromosomów

2 x 1{{2{23}}}6 fibroblastów wysiano w 175-cm2 butelkach do hodowli tkankowych z DMEM (10 procent FBS) i hodowano w temperaturze 37 stopni w obecności lub przy braku 50 nM MMC. Po 48 godzinach do każdej kolby hodowlanej dodano 600 µl demekolcyny (10 µg/µl) i komórki inkubowano przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 stopni w celu wzbogacenia w metafazy. Komórki następnie trypsynizowano i ponownie zawieszano w 75 mM KCL i inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej. Komórki odwirowano, ponownie zawieszono w 10 ml utrwalacza (75% metanolu i 25% kwasu octowego), inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej i odwirowano. Osady ponownie zawieszono w 10 ml utrwalacza i inkubowano przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ten etap powtórzono, a na koniec osad ponownie zawieszono w 0,5-1,0 ml utrwalacza. Zawiesinę komórek wkroplono na szkiełko i pozostawiono do wyschnięcia. Szkiełka barwiono przez 5 min w 3% roztworze Giemsy, płukano w wodzie z kranu i pozostawiano do wyschnięcia. Zakodowano preparaty iz każdej zakodowanej hodowli zbadano 50 metafaz pod kątem uszkodzeń chromosomów. Po zliczeniu slajdy dekodowano, a wyniki analizowano tak, jak przedstawiono (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,000 komórek wysiano na 18-mm szklanych szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowych płytkach w DMEM z 1% FBS. Po 24 godzinach komórki lokalnie napromieniowano przez filtr 5-µm z 30 J/m2 UV-C. Komórki następnie znakowano impulsowo 20 µM EdU (VWR) i 1 µM 5-fluorodeoksyurydyny (Sigma-Aldrich) przez 1 godzinę lub 4 godziny. Po znakowaniu komórki przeszukiwano pożywkę 10 µM tymidyny w DMEM bez suplementów przez 30 min i utrwalano przez 15 min 3,7% formaldehydem w PBS. Komórki permeabilizowano przez 20 min w PBS z 0,5% Triton-X100 i blokowano w 3% BSA (Thermo Fisher Scientific) w PBS. Wprowadzoną EdU połączono z Attoazide Alexa Fluor 647 przy użyciu chemii Click-iT zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). Po sprzężeniu komórki utrwalano 2% formaldehydem przez 10 min, a następnie blokowano 100 mM glicyną. DNA denaturowano 0,5 M NaOH przez 5 min, a następnie blokowano 10% BSA przez 15 min. Następnie komórki inkubowano z przeciwciałem przeciwko dimerom cyklobutanu pirymidyny (patrz Tabela S5) przez 2 godz., a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godz. i DAPI przez 5 min. Komórki zamontowano w Polymount (Brunschwig).

Akwizycja danych MS

MS przeprowadzono zasadniczo jak opisano wcześniej (Salas Lloret i in., 2019). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na systemie EASY-nLC 1000 (Proxeon) połączonym z Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) przez źródło jonów nanoelektrorozpylania. Q-Exactive był sprzężony z emiterem krzemionkowym 25-cm (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) wypełnionym na miejscu kulkami 1,9 µm C18-AQ (Reprospher -DE; Pur; dr Manish, Ammerbuch-Entringen, Niemcy). Próbki analizowano w 40-min gradiencie chromatograficznym od 0% do 30% acetonitrylu, a następnie zwiększono do 95% acetonitrylu przed ponownym zrównoważeniem kolumny przy szybkości przepływu 200 NL/min. Spektrometr mas pracował w trybie akwizycji zależnej od danych z metodą top Seven i zakresem skanowania 300–1600 m/z. Widma MS pełnego skanu uzyskano przy docelowej wartości 3 × 106 i rozdzielczości 70,000, a wyższe tandemowe widma masowe z dysocjacją kolizyjną (MS/MS) zarejestrowano przy docelowej wartości 105, i z rozdzielczością 35 000, oknem izolacyjnym 2,2 m/z i znormalizowaną energią zderzeń 25 procent. Minimalna wartość docelowa automatycznej regulacji wzmocnienia wynosiła 104. Maksymalne czasy wtrysku MS1 i MS2 wynosiły odpowiednio 250 i 120 ms. Masy jonów prekursorowych zeskanowanych jonów dynamicznie wykluczano z analizy MS/MS na 30 sekund. Jony o ładunku 1 i wyższym niż 6 zostały wykluczone z wyzwalania analizy MS2.

Analiza danych MS Wszystkie surowe dane analizowano przy użyciu MaxQuant (wersja 1.6.6.0), jak opisano wcześniej (Tyanova i in., 2016a). Przeprowadziliśmy poszukiwania wobec trawionego in silico proteomu referencyjnego UniProt dla Homo sapiens, w tym sekwencji kanonicznych i izoformowych (27 maja 019). Przeszukania bazy danych przeprowadzono zgodnie ze standardowymi ustawieniami z następującymi modyfikacjami. Zastosowano trawienie trypsyną/P, co pozwoliło na cztery pominięte cięcia. Utlenianie (M) i acetyl (białko N-końca) były dozwolone jako zmienne modyfikacje z maksymalną liczbą trzech. Karbamidometyl (C) został wyłączony jako stała modyfikacja. Włączono kwantyfikację bez etykiety (LFQ), co uniemożliwiło szybkie LFQ. Dane wyjściowe Max-Quant były dalej przetwarzane przy użyciu platformy obliczeniowej Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova i in., 2016b). Wartości intensywności LFQ zostały przekształcone w log2, a potencjalne zanieczyszczenia i białka zidentyfikowane tylko przez miejsce lub odwrotne peptydy zostały usunięte. Próbki pogrupowano w kategorie eksperymentalne, a białka niezidentyfikowane w czterech z czterech powtórzeń w co najmniej jednej grupie również zostały usunięte. Brakujące wartości zostały przypisane przy użyciu wartości o rozkładzie normalnym z przesunięciem w dół o 1,8 (log2) i zrandomizowaną szerokością 0,3 (log2), biorąc pod uwagę wartości całej macierzy. Przeprowadzono analizę statystyczną (testy t) w celu określenia, które białka zostały znacząco wzbogacone. Wygenerowano wykresy wulkaniczne, a tabele wyników analizy statystycznej poddano dalszej obróbce w programie Microsoft Excel. Dane z proteomiki MS zostały zdeponowane w konsorcjum ProteomeXchange za pośrednictwem repozytorium partnerów PRIDE (Perez-Riverol i in., 2019) z identyfikatorem zestawu danych PXD017940.

Oczyszczanie rekombinowanego ERCC1-XPF

Wytwarzanie bakulowirusa przeprowadzono jak opisano przy użyciu konstruktów pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin i Sch¨arer, 2002). ERCC1WT i ERCC1R156W podlegały koekspresji z XPFWT z pojedynczego bakulowirusa w komórkach owadzich Sf9. Heterodimery oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa do niklu, wykluczenia wielkości i chromatografii heparynowej, jak opisano (Enzlin i Scharer, 2002). ERCC1-XPF eluowano z kolumny heparyny przy około 600 mM NaCl. Stężenia białka wahały się od 0,1 do 0,2 mg/ml.

Test nukleazy

Substrat pętlowy (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) zawierający barwnik fluorescencyjny Cy5 (50 pmol) na 39 końcach (IDT) został wyżarzony w 100-µl buforu do wygrzewania (10 mM Tris, pH 7,5 i 50 mM NaCl) przez ogrzewanie w 95 stopniach przez 5 minut i powolne schładzanie przez okres 2 godzin. 200 fmol wygrzanego substratu użyto w 20-µl reakcjach zawierających 25 mM HEPES, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 10% glicerol, 0,5 mM -merkaptoetanol, 0,1 mg/ml BSA, 40 mM NaCl i 0-40 nM białka. Reakcje inkubowano w 30 stopniach przez 30 minut i zatrzymano przez dodanie 10 µl90% formamidu/10 mM EDTA. Po ogrzewaniu w 95 stopniach przez 5 minut i schłodzeniu na lodzie, 15 µl każdej próbki załadowano na 15% denaturujący żel poliakryloamidowy. Żele puszczano przy 30 mA przez 30 min i prążki wizualizowano za pomocą fluorescencji za pomocą Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

Test NER in vitro

Ekstrakty komórek z niedoborem XPF (XP2YO) i plazmid zawierający miejscowo-specyficzną zmianę dG-AAF wytworzono jak opisano wcześniej (Gillet i wsp., 2005; Shivji i wsp., 1999) . Dla każdej reakcji 2 µl buforu naprawczego (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfokreatyny i 1,8 mg / ml BSA, końcowe pH 7,8), 0,2 µl buforu fosfokinazy kreatynowej (2,5 mg/ml fosfokinazy kreatynowej z mięśnia królika [Sigma Aldrich], 10 mM glicyny, pH 9,0 i 50% gliceryny), 3 µl komórek z niedoborem XPF ekstrakt, NaCl (do końcowego stężenia 70 mM) i oczyszczone białka ERCC1-XPF w łącznej objętości 9 µl wstępnie ogrzano w 30 stopniach przez 10 min. Do każdej reakcji dodano 1 ul plazmidu zawierającego dG-AAF (50 ng/ul) i reakcje inkubowano w 30 stopniach przez 45 min. Mieszaninę reakcyjną następnie ochłodzono na lodzie przez 5 min, po czym dodano 0,5 µl 1 µM komplementarnej nici d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGCTACGTAGCTC) i mieszaninę reakcyjną denaturowano przez ogrzewanie w 95 stopniach przez 5 minut. Po 15 min wygrzewania w temperaturze pokojowej dodano 1 µl mieszaniny sekwencji (zawierającej 0,13 U sekwencji i 2,0 µCi [-32P] dCTP dla każdej reakcji). Po wstępnej inkubacji w 37°C przez 3 min, dodano 1,2 µl mieszaniny trifosforanu deoksyrybonukleotydu (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP i 100 µM dGTP). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 37°C przez 12 min i reakcję zatrzymano przez dodanie 8 µl barwnika obciążającego (80 procent formamidu i 10 mM EDTA). Próbki ogrzewano w 95 stopniach przez 5 minut, schłodzono na lodzie i załadowano na 14% denaturujący żel poliakryloamidowy. Żele uruchamiano przy 45 W przez 2,5 godz., a prążki wizualizowano za pomocą PhosphorImager (Typhoon RGB).

Materiały uzupełniające online

Ryc. S1 przedstawia laboratoryjne wartości funkcji wątroby i nerek u rodzeństwa 1 i rodzeństwa 2. Ryc. S2 przedstawia dane z sekwencjonowania genomowego potwierdzające mutację zmiany sensu i wewnątrzgenową delecję w genie ERCC1. Fig. S3 przedstawia ekspresję białka ERCC1 i XPF w fibroblastach pacjentów. Fig. S4 przedstawia oczyszczone rekombinowane białka ERCC1 i XPF oraz Co-IP ERCC1WT i ERCC1R156W. Ryc. S5 przedstawia obrazy mikroskopowe UDS, ognisk H2AX i lokalizację mutacji pacjenta w ERCC 1-XPF. Tabela S1 zawiera sekwencje wszystkich starterów i sond użytych w tym badaniu. W tabeli S2 wymieniono wszystkie linie komórkowe testowane w tym badaniu. W tabeli S3 wymieniono wszystkie plazmidy biorące udział w tym badaniu. Tabela S4 przedstawia sekwencje sgRNA z badania, a Tabela S5 przedstawia przeciwciała. Tabela S6 podaje liczbę komórek użytych do oznaczenia ilościowego na rysunkach. Data S1 wyświetla wszystkie nieprzycięte pliki Western blot.

Podziękowanie

Autorzy dziękują zarówno rodzeństwu, jak i ich rodzicom za przyczynienie się do powstania tego artykułu, Sylvie Noordermeer (Leiden University Medical Center [LUMC], Leiden, Holandia) za lentiwirusowy wektor ekspresyjny pLenti-CW57-TO-GFP i porady dotyczące generowania KI komórek, Joachim Goedhart (Uniwersytet Amsterdamski, Amsterdam, Holandia) za mVenus cDNA, Bert van der Kooij (LUMC, Leiden, Holandia) za inhibitor DNA-PK, Wim Vermeulen i Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Holandia) za dostarczenie 165TOR, Tomoo Ogi (University of Nagoya, Japonia) za dostarczenie komórek CS20LO, Alan Lehman (University of Sussex, Wielka Brytania) za dostarczenie CSL16NG i CSL16NG hTERT oraz Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Holandia) za doradztwo w zakresie generowania ogniw KI .

Praca ta została sfinansowana przez Leiden University Medical CenterResearch Fellowship i Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI grant (ALW.016.161.320) dla MSLuijsterburg, grant początkowy Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (310913) dla ACO Vertegaal, grant KWF Kankerbestrijding (YoungInvestigator 11367) R. Gonz´alez-Prieto, grant KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) dla MA Rooimans, oraz granty z Koreańskiego Instytutu Nauk Podstawowych (IBS-R022-A1) i Narodowego Cancer Institute (P01CA092584) do ODSch arer.

Wkład autorów: K. Apelt wygenerował komórki KO, komórki KI i stabilne linie komórkowe; wykonali Western blot i barwienia immunologiczne pod kątem ekspresji ERCC1 i XPF, transdukcji lentiwirusów, przeżywalności klonogennej (UV, MMC, IR), eksperymentów Co-IP dla analizy Western blot, eksperymentów UDS, eksperymentów Co-IP dla barwienia MS i H2AX; i napisałem gazetę. A. Kragten wykonał UDS, RRS i immunobarwienia po miejscowym UV. Klejnot AP Wonder wygenerował komórki KO i KI i wykonał eksperymenty UDS, Western blot i sekwencjonowanie Sangera, aby potwierdzić mutację zmiany sensu. SM White udzielił porad pacjentom, przeanalizował dane egzomowe, wykonał biopsje, wygenerował pierwotne fibroblasty i napisał kliniczny opis pacjenta. S. Lunke i BT Wilson wygenerowali dane NGS. S. Pantaleo i D. Flanagan wykonali qPCR w celu potwierdzenia usunięcia. C. Quinlan napisał opis kliniczny nerki. W. Hardikar napisał opis kliniczny wątroby. MA Rooimans i R.MF Wolthuis wytworzyli unieśmiertelnione hTERT fibroblasty 48BR i PV50LD oraz przeprowadzili testy pękania chromosomów indukowanego przez MMC. R. Gonzalez-Prieto i ACO Vertegaal przeanalizowali wszystkie eksperymenty MS. WW Wiegant i H. vanadium przeprowadzili klonogenne przeżycia w komórkach U2OS (IR). J.-E.Yeo i HS Kim oczyścili rekombinowane białka i przeprowadzili test nukleazy i testy NER in vitro. Nadzorowana in vitro praca NER przez OD Sch¨arera przyczyniła się do interpretacji strukturalnej allelu R156W i zredagowała artykuł. MS Luij Sterburg nadzorował projekt i napisał pracę.

Bibliografia

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky i SM Elsayed. 2011. Cholestaza u pacjentów z zespołem Cockayne'a i sugerowane zmodyfikowane kryteria rozpoznania klinicznego. OrphanetJ. Rzadkie Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown i PJ McHugh. 2017. RPA aktywuje endonukleazę XPF-ERCC1 w celu zainicjowania przetwarzania wiązań krzyżowych między nićmi DNA. EMBO J. 36: 2047-2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson i RS Nairn. 2000. Rola ERCC1 w usuwaniu długich niehomologicznych ogonów podczas ukierunkowanej rekombinacji homologicznej. EMBO J. 19:5552-5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers i LJ Niedernhofer. 2008. Endonukleaza ERCC1-XPF ułatwia naprawę pęknięć dwuniciowych DNA. Mol. Komórka. Biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers i in. 2010. Nieprawidłowa lokalizacja nukleazy XPF-ERCC1 przyczynia się do zmniejszenia naprawy DNA u pacjentów z XP-F. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Niedokrwistość Fanconiego i jej diagnostyka. Mutacja. Res. 668:4-10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa i N. Tebib. 2017. Zajęcie nerek u dwojga rodzeństwa z zespołem Cockayne'a. Iran. J. Nerka Dis. 11:253–255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski i RD Wood. 1993. Kokorekcja defektów naprawy DNA ERCC1, ERCC4 i xeroderma pigmentosum grupy F in vitro. EMBO J. 12:3685–3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol i in. 2013. Mutacje w ERCC4, kodujące endonukleazę naprawczą DNA XPF, powodują anemię Fanconiego. Jestem. J. Hum. Genet. 92:800-806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi i AD D'Andrea. 2016. Ścieżka anemii Fanconiego: nowi gracze i nowe funkcje. Nat. Ks. Mol. Biol. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers i JH Hoeijmakers. 1998a. Elementy strukturalne DNA wymagane do aktywności endonukleazy ERCC1-XPF. J. Biol. Chem. 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers i JH Hoeijmakers. 1998b. Mapowanie domen interakcji między ludzkimi białkami naprawczymi ERCC1 i XPF. Kwasy nukleinowe Res. 26:4146–4152.

na/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg i SJ Verbeek. 1995. Zwiększona podatność na promieniowanie ultrafioletowe B i czynniki rakotwórcze myszy pozbawionych genu naprawy przez wycinanie DNA XPA. Natura. 377:169-173.

DiGiovanna, JJ i KH Kraemer. 2012. Światło na xeroderma pigmentosum. J.Inwestuj. Dermatol. 132:785–796.

Enzlin, JH i OD Schrer. 2002. Miejsce aktywne endonukleazy naprawy DNA XPF-ERCC1 tworzy wysoce konserwatywny motyw nukleazy. EMBO J. 21:2045-2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada i H. Kitamura. 2006. Zespół Cockayne'a z nawracającym ostrym cewkowo-śródmiąższowym zapaleniem nerek. Patol. wewn. 56:678–682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer i OD Schrer. 2005. Specyficzne włączenie N-(deoksyguanozyny-8-yl)-2-acetyloaminofluorenu (dG-AAF) do oligonukleotydów przy użyciu zmodyfikowanej „ultra-łagodnej” syntezy DNA. Kwasy nukleinowe Res. 33: 1961-1969.

Gregg, SQ, AR Robinson i LJ Niedernhofer. 2011. Fizjologiczne konsekwencje defektów endonukleazy naprawczej DNA ERCC1-XPF. Naprawa DNA (Amst.). 10:781–791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama i in. 2015. Niedobór XRCC4 u ludzi powoduje wyraźny fenotyp neurologiczny, ale nie jawny niedobór odporności. J. Klinika Alergologii. Immunol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker i in. 2020. Utrata ZBTB24 upośledza niehomologiczną rekombinację łączenia końców i przełącznika klasy u pacjentów z zespołem ICF. J. Eksp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeijmakers i W. Vermeulen. 1999. Działanie endonukleazy naprawczej DNA ERCC1/XPF w żywych komórkach. Nauki ścisłe. 284:958–961. h

nauka.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeijmakers i W. Vermeulen. 2007. Pierwszy zgłoszony pacjent z niedoborem ludzkiego ERCC1 ma zespół mózgowo-oczo-twarzowo-szkieletowy z łagodnym defektem naprawy przez wycinanie nukleotydów i poważną niewydolnością rozwojową. Jestem. J. Hum. Genet. 80:457–466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald i F. Arwert. 1997. Dowody na co najmniej osiem genów anemii Fanconiego. Jestem. J. Hum. Genet. 61:940-944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch i NQ McDonald. 2020. Struktury Cryo-EM endonukleazy XPF-ERCC1 ujawniają, w jaki sposób sprzężenie złącza DNA zakłóca konformację autohamowaną. Nat. Komunia. 11:1120.

Karikkineth AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau i VA Bohr. 2017. Zespół Cockayne'a: ​​cechy kliniczne, systemy modelowe i ścieżki. Starzenie Res. Obj. 33:3–17.002

K. Kashiyama, Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr i in. 2013. Nieprawidłowe działanie nukleazy ERCC1-XPF powoduje różne objawy kliniczne i powoduje zespół Cockayne'a, xeroderma pigmentosum i anemię Fanconiego. Jestem. J. Hum. Genet. 92:807–819.