Część 2|Kinaza syntazy glikogenu 3b Nadpobudliwość w złuszczanych komórkach moczu przewiduje progresję cukrzycowej choroby nerek

Kliknij tutaj, aby przejść do części 1

Aby uzyskać więcej informacji prosimy o kontakt:emily.li@wecistanche.com

DYSKUSJA

W Stanach Zjednoczonych i innych krajach zachodnich DKD pozostaje wiodącą etiologią postępuprzewlekłą chorobę nereki stanowi duże obciążenie dla skarbu państwa i systemów opieki zdrowotnej, ponieważ nie jest jeszcze dostępne ostateczne leczenie.5 Od dawna wiadomo, że nie u wszystkich pacjentów z cukrzycą rozwinie się DN.5 W zależności od badanej kohorty oszacowano, że DN dotyka od 30 do 50 procent pacjentów z cukrzycą. Środki przyjęte przez obecną praktykę kliniczną w celu identyfikacji pacjentów z cukrzycą, u których występuje ryzyko rozwoju DKD, ograniczają się w dużej mierze do badania oczu w kierunku retinopatii i badania moczu w kierunku albuminurii.5 Jednak zbieżne dane epidemiologiczne sugerują, że mikrowaskulopatia pozanerkowa lub albuminuria są znacząco niezgodne z postępującą progresją DKD.12,13,26,27 W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowego biomarkera do precyzyjnej stratyfikacji pacjentów z cukrzycą zagrożonych DN. Obecne badanie po raz pierwszy donosi, że GSK3b jest nadeksprymowany i nadaktywny w miąższunerkakomórki zarówno w eksperymentalnej, jak i klinicznej DN, związane zpostęp choroby nerek. Co więcej, nadaktywność GSK3b w złuszczanych komórkach moczu jest prawdopodobnie w stanie przewidzieć progresję DN.

Cistanche tubulosa zapobiega chorobie nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

GSK3b, wysoce konserwatywna, wrażliwa na redoks kinaza białkowa serynowo/treoninowa, jest centralnie zaangażowana w sygnalizację insuliny, a także w szereg innych komórkowych szlaków sygnałowych, które są kluczowe dla procesów patofizjologicznych związanych znerkauraz, naprawa i regeneracja. W tkankach wrażliwych na insulinę, takich jak wątroba i mięsień szkieletowy, GSK3b jest aktywny w warunkach podstawowych i hamuje aktywność syntazy glikogenu.19,28 Insulina szybko inaktywuje GSK3b poprzez hamującą fosforylację w serynie 9, powodując biosyntezę glikogenu. Coraz więcej dowodów sugeruje, że dysregulacja GSK3b jest związana z cukrzycą typu 2.19,29-31 Rzeczywiście, istnieją dane wskazujące na nadekspresję i nadaktywność GSK3b w mięśniach pacjentów z cukrzycą31-33 oraz w tkance tłuszczowej otyłych myszy z cukrzycą.34 transgeniczna nadekspresja GSK3b w mięśniach szkieletowych myszy powoduje upośledzoną tolerancję glukozy, insulinooporność i hiperinsulinemię.29,35 I odwrotnie, myszy pozbawione GSK3b w mięśniach szkieletowych wykazywały lepszą tolerancję glukozy.36 Konsekwentnie, inhibitory GSK3, takie jak lit, są w stanie naśladować działanie insuliny w liniach komórkowych i tkankach.37 Ponadto u otyłych myszy z cukrzycą inhibitory GSK3 poprawiały wrażliwość na insulinę i homeostazę glukozy.38nerkatradycyjnie nie był uważany za docelowy narząd działania insuliny. Jednak ostatnio przekonujące dowody sugerują, że sygnalizacja insuliny w:nerkakomórki, w szczególności w podocytach, odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu kłębuszków inerkahomeostaza.39-41 Wadliwa sygnalizacja insuliny w podocytach, spowodowana niedoborem lub opornością na insulinę, jest prawdopodobnie głównym inicjatorem wielu patologicznych zmian obserwowanych w DN. Ponadto badania kliniczne wykazały, że insulinooporność koreluje z początkiem i nasileniem albuminurii nawet u pacjentów z prawidłowym ciśnieniem tętniczym bez cukrzycy, co sugeruje, że insulinooporność per se może powodować albuminurię. warunkowy nokaut receptora insuliny w kłębuszkowych podocytach, rozwinęła się albuminuria i zmiany kłębuszkowe, które rekapitulują DN, pomimo braku hiperglikemii lub cukrzycy.41 Odwrotnie, u zwierząt z cukrzycą, leki uczulające na insulinę są w stanie spowolnić postęp DN niezależnie od kontroli glikemii.43 Odkrycia te sugerują, że sygnalizacja insulinowa reguluje funkcję podocytów niezależnie od poziomu glukozy we krwi. Jednak rola GSK3b jako kluczowego przetwornika szlaku sygnałowego insuliny w patogenezie i progresji DN jest bardzo słabo zbadana.

wnerka, GSK3b jest wyrażany głównie w podocytach i, w mniejszym stopniu, w komórkach mezangialnych i śródbłonkowych w kłębuszku nerkowym20,21 i ekstensywnie wyrażany przez komórki kanalików nerkowych. Istnieją dane z naszej i innych grup wskazujące, że GSK3b pośredniczy w autonomicznym uszkodzeniu podocytów poprzez integrację wielu topatycznych szlaków sygnałowych podocytów.17,20,44,45 Niespójność, genetyczna lub farmakologiczna blokada GSK3b może chronić przed uszkodzeniem podocytów i łagodzić białkomocz w modelach zwierzęcych różne niecukrzycowe glomerulopatie.21 Ponadto w progresywnymchronicznynerkachorobaStwierdzono, że GSK3b jest modulatorem uszkodzenia kanalików nerkowych i uszkodzenia śródmiąższowego. Jednak to, czy i w jaki sposób GSK3b jest zaangażowany w DN, było niepewne i bardzo kontrowersyjne, mimo że niniejsze badanie wykazało, że zwiększona aktywacja GSK3b wnerkaaw komórkach złuszczanych moczu może być związane z rozwojem lub progresją DKD. Na przykład u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną Lin i wsp.46 stwierdzili, że hamowanie GSK3b przez inhibitor kompetycyjny adenozynotrójfosforanu (20 Z,30 E)-6-bromo w -30 -oksymie indyrubiny ( BIO) osłabił białkomocz i poprawił zmiany kłębuszkowe DN przy braku korekcji hiperglikemii, co sugeruje, że GSK3b odgrywa szkodliwą rolę w DN. Również u szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną, Paeng i wsp.22 dokonali podobnych ustaleń przy użyciu BIO i doszli do wniosku, że zwiększona aktywność GSK3b w podocytach w warunkach cukrzycowych jest związana z apoptozą i utratą podocytów w DN. Jest to zgodne z innym badaniem in vitro, w którym stwierdzono, że GSK3b pośredniczy w odróżnicowaniu i uszkodzeniu podocytów po ekspozycji na pożywkę o wysokiej zawartości glukozy.47 Wręcz przeciwnie, Mariappan i wsp.48 twierdzili, że aktywacja GSK3b zamiast tego łagodzi wywołaną cukrzycąnerkauraz. W ich badaniu myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną leczono nitroprusydkiem sodu, dawcą tlenku azotu, który jest w stanie aktywować GSK3b. Odkryli, że albuminuria, przerost nerek i akumulacja macierzy zewnątrzkomórkowej w kłębuszkach uległy złagodzeniu przy braku poprawy nadciśnienia lub hiperglikemii. Jednak odkrycia te są ostro sprzeczne z danymi uzyskanymi od myszy typu knock-in ukierunkowanych na geny z konstytutywnie aktywnym GSK3, u których rozwinęła się spontaniczna albuminuria i uszkodzenie podocytów. GSK3b. Chociaż wielokrotnie potwierdzano, że BIO jest wysoce selektywnym drobnocząsteczkowym inhibitorem GSK3b, nitroprusydek sodu nie jest specyficznym aktywatorem GSK3b, ale wiadomo, że ma silne działanie hemodynamiczne,50 co prawdopodobnie zakłóca jego działanie zmniejszające albuminurię i renoprotekcyjne w myszy z cukrzycą. Podsumowując, pomimo pewnych sprzecznych danych, przeważające dowody potwierdzają, że GSK3b jest prawdopodobnie powiązany znerkaurazi białkomocz w DN. Należy wspomnieć o kilku ograniczeniach niniejszego badania. Po pierwsze, dane przedkliniczne ograniczały się tylko do mysich modeli DB/DB. Aby określić generalizowalność roli GSK3b wcukrzycowe uszkodzenie nerek, konieczna jest walidacja wyników w innych modelach DN, w tym modelach DN typu 1. Po drugie, przedstawione tu obserwacje kliniczne pochodzą z retrospektywnych kohort pacjentów z cukrzycą o ograniczonej liczebności próby i stosunkowo krótkim czasie obserwacji. Trzeba przyznać, że do zweryfikowania naszych obserwacji i potwierdzenia siły GSK3b w złuszczanych komórkach moczu w przewidywaniu wyniku DKD potrzebne są prospektywne, wieloośrodkowe, wielkoskalowe, randomizowane badania.

GSK3b, wysoce konserwatywna, wrażliwa na redoks kinaza białkowa serynowo/treoninowa, jest centralnie zaangażowana w sygnalizację insuliny, a także w szereg innych komórkowych szlaków sygnałowych, które są kluczowe dla procesów patofizjologicznych związanych znerkauraz, naprawa i regeneracja. W tkankach wrażliwych na insulinę, takich jak wątroba i mięsień szkieletowy, GSK3b jest aktywny w warunkach podstawowych i hamuje aktywność syntazy glikogenu.19,28 Insulina szybko inaktywuje GSK3b poprzez hamującą fosforylację w serynie 9, powodując biosyntezę glikogenu. Coraz więcej dowodów sugeruje, że dysregulacja GSK3b jest związana z cukrzycą typu 2.19,29-31 Rzeczywiście, istnieją dane wskazujące na nadekspresję i nadaktywność GSK3b w mięśniach pacjentów z cukrzycą31-33 oraz w tkance tłuszczowej otyłych myszy z cukrzycą.34 transgeniczna nadekspresja GSK3b w mięśniach szkieletowych myszy powoduje upośledzoną tolerancję glukozy, insulinooporność i hiperinsulinemię.29,35 I odwrotnie, myszy pozbawione GSK3b w mięśniach szkieletowych wykazywały lepszą tolerancję glukozy.36 Konsekwentnie, inhibitory GSK3, takie jak lit, są w stanie naśladować insulinę

Działanie w liniach komórkowych i tkankach.37 Ponadto, u otyłych myszy z cukrzycą, inhibitory GSK3 poprawiały wrażliwość na insulinę i homeostazę glukozy.38 Tradycyjnie nerki nie były uważane za narząd docelowy działania insuliny. Jednak ostatnio przekonujące dowody sugerują, że sygnalizacja insulinowa w komórkach nerkowych, zwłaszcza w podocytach, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy kłębuszkowej i nerkowej. dla wielu patologicznych zmian obserwowanych w DN. Ponadto badania kliniczne wykazały, że insulinooporność koreluje z początkiem i nasileniem albuminurii nawet u pacjentów z prawidłowym ciśnieniem tętniczym bez cukrzycy, co sugeruje, że insulinooporność per se może powodować albuminurię. warunkowy nokaut receptora insuliny w kłębuszkowych podocytach, rozwinęła się albuminuria i zmiany kłębuszkowe, które rekapitulują DN, pomimo braku hiperglikemii lub cukrzycy.41 Odwrotnie, u zwierząt z cukrzycą, leki uczulające na insulinę są w stanie spowolnić postęp DN niezależnie od kontroli glikemii.43 Odkrycia te sugerują, że sygnalizacja insulinowa reguluje funkcję podocytów niezależnie od poziomu glukozy we krwi. Jednak rola GSK3b jako kluczowego przetwornika szlaku sygnałowego insuliny w patogenezie i progresji DN jest bardzo słabo zbadana.

W nerkach GSK3b jest wyrażany głównie w podocytach i, w mniejszym stopniu, w komórkach mezangialnych i śródbłonka kłębuszków nerkowych20,21 i ekstensywnie wyrażany przez komórki kanalików nerkowych. Istnieją dane z naszej i innych grup wskazujące, że GSK3b pośredniczy w autonomicznym uszkodzeniu podocytów poprzez integrację wielu szlaków sygnalizacji patycznej podocytów.17,20,44,45 Niespójność, genetyczna lub farmakologiczna blokada GSK3b może chronić przed uszkodzeniem podocytów i łagodzić białkomocz w modelach zwierzęcych różne niecukrzycowe glomerulopatie.21 Ponadto w postępującej przewlekłejnerkachorobaStwierdzono, że GSK3b jest modulatorem uszkodzenia kanalików nerkowych i uszkodzenia śródmiąższowego. Jednak to, czy iw jaki sposób GSK3b jest zaangażowany w DN, było niepewne i bardzo kontrowersyjne, chociaż niniejsze badanie wykazało, że zwiększona aktywacja GSK3b w nerkach i złuszczanych komórkach moczu może być związana z rozwojem lub progresją DKD. Na przykład u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną Lin i wsp.46 stwierdzili, że hamowanie GSK3b przez inhibitor kompetycyjny adenozynotrójfosforanu (20 Z,30 E)-6-bromo w -30 -oksymie indyrubiny ( BIO) osłabił białkomocz i poprawił zmiany kłębuszkowe DN przy braku korekcji hiperglikemii, co sugeruje, że GSK3b odgrywa szkodliwą rolę w DN. Również u szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną, Paeng i wsp.22 dokonali podobnych ustaleń przy użyciu BIO i doszli do wniosku, że zwiększona aktywność GSK3b w podocytach w warunkach cukrzycowych jest związana z apoptozą i utratą podocytów w DN. Jest to zgodne z innym badaniem in vitro, w którym stwierdzono, że GSK3b pośredniczy w odróżnicowaniu i uszkodzeniu podocytów po ekspozycji na pożywkę o wysokiej zawartości glukozy.47 Wręcz przeciwnie, Mariappan i wsp.48 twierdzili, że aktywacja GSK3b zamiast tego łagodzi wywołaną cukrzycąnerkauraz. W ich badaniu myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną leczono nitroprusydkiem sodu, dawcą tlenku azotu, który jest w stanie aktywować GSK3b. Odkryli, że albuminuria, przerost nerek i akumulacja macierzy zewnątrzkomórkowej w kłębuszkach uległy złagodzeniu przy braku poprawy nadciśnienia lub hiperglikemii. Jednak odkrycia te są ostro sprzeczne z danymi uzyskanymi od myszy typu knock-in ukierunkowanych na geny z konstytutywnie aktywnym GSK3, u których rozwinęła się spontaniczna albuminuria i uszkodzenie podocytów. GSK3b. Chociaż wielokrotnie potwierdzano, że BIO jest wysoce selektywnym drobnocząsteczkowym inhibitorem GSK3b, nitroprusydek sodu nie jest specyficznym aktywatorem GSK3b, ale wiadomo, że ma silne działanie hemodynamiczne,50 co prawdopodobnie zakłóca jego działanie zmniejszające albuminurię i renoprotekcyjne w myszy z cukrzycą. Podsumowując, pomimo pewnych sprzecznych danych, przeważające dowody potwierdzają, że GSK3b jest prawdopodobnie powiązany znerkaurazi białkomocz w DN. Kilka ograniczeń

należy wspomnieć o obecnym badaniu. Po pierwsze, dane przedkliniczne ograniczały się tylko do mysich modeli dB/dB. Aby określić generalizowalność roli GSK3b wcukrzycowe uszkodzenie nerek, konieczna jest walidacja wyników w innych modelach DN, w tym modelach DN typu 1. Po drugie, przedstawione tu obserwacje kliniczne pochodzą z retrospektywnych kohort pacjentów z cukrzycą o ograniczonej liczebności próby i stosunkowo krótkim czasie obserwacji. Trzeba przyznać, że do zweryfikowania naszych obserwacji i potwierdzenia siły GSK3b w złuszczanych komórkach moczu w przewidywaniu wyniku DKD potrzebne są prospektywne, wieloośrodkowe, wielkoskalowe, randomizowane badania.

Podsumowując, nasze badania wykazały, że ekspresja i aktywność GSK3b w nerkach są wzmacniane w eksperymentalnej i klinicznej DN. Aktywność GSK3b w złuszczanych komórkach moczu może służyć jako nowy biomarker do przewidywania progresji DN. Nasze dane mogą utorować drogę do szeroko zakrojonego, dogłębnego zbadania wartości, jaką GSK3b w złuszczanych komórkach moczu może służyć jako prognostyczny biomarker DN.

METODY

Badania na zwierzętach

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Committee i są zgodne z przepisami Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych oraz Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia w zakresie opieki nad ludźmi i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Samce myszy DB/DB i kontrolne db/m z miotu w wieku 6 tygodni zakupiono od NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Chiny) i umieszczono w Central Animal Facility Uniwersytetu Zhengzhou. Wszystkie myszy były karmione ad libitum, a 8 do 10 myszy uśmiercono we wskazanym wieku. Próbki moczu i krwi pobrano we wskazanych punktach czasowych. Po zabiciu nerki pobrano do dalszych badań. Poziomy albuminy w moczu mierzono przy użyciu zestawu do oznaczania ilościowego immunosorbentu związanego z enzymami mysiej albuminy (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Poziomy kreatyniny w moczu określono przy użyciu zestawu do oznaczania kreatyniny (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Hodowlę komórkową

Warunkowo unieśmiertelnione mysie podocyty między pasażami 21 i 25 hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą w sprzyjających warunkach, jak opisano wcześniej. następnie wystawiono na działanie normalnego środowiska/pożywki hodowlanej zawierającej 5 mM glukozy, środowiska cukrzycowego składającego się z glukozy (25 mM) i transformującego czynnika wzrostu b1 (2 ng/ml) lub pożywki kontrolnej o wysokiej osmolalności zawierającej 20 mM mannitol przez 48 godziny. Mysie proksymalne komórki nabłonka kanalików i mysie kłębuszkowe komórki mezangialne utrzymywano w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco/F12 uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą. Komórki wysiewano w 70% konfluencji w pożywce zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej przez 24 godziny, a następnie poddano głodzeniu surowicą przez kolejne 24 godziny, po czym poddano ekspozycji na normalne środowisko/pożywkę hodowlaną, która zawierała 5 mM glukozy, środowisko cukrzycowe składające się z wysokiej glukozę (25 mM) i transformujący czynnik wzrostu b1 (2 ng/ml) lub pożywkę kontrolną o wysokiej osmolalności zawierającą 5 mM glukozy i 20 mM mannitol przez 48 godzin. Żywotność komórek oceniano przez wykluczenie błękitu trypanowego. We wskazanych punktach czasowych komórki utrwalono lub zebrano lizaty komórkowe do dalszych badań.

Przejściowa transfekcja wektorów

Wektory kodujące pusty wektor lub zmutowany konstytutywnie aktywny (S9A) (S9A-GSK3b-HA/ pcDNA3) GSK3b znakowany hemaglutyniną (HA) zostały dostarczone przez dr Gail VW Johnson (Birmingham, AL) i zostały transfekowane do hodowanych podocytów, komórki mezangialne i komórki nabłonka kanalików przy użyciu Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA), jak opisano wcześniej.44 Skuteczność transfekcji potwierdzono przez barwienie immunofluorescencyjne lub immunoblotting dla HA po 12 godzinach. Komórki następnie zebrano i przygotowano do analizy Western blot lub innych testów.

RNAi

Pula 3 myszy specyficznych dla GSK3b małych, interferujących dupleksów RNA — 50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 i 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 -zostały zaprojektowane i zsyntetyzowane zgodnie z pełną sekwencją kodującą mysiego genu GSK3b (nr dostępu GenBank BC060743.1). Dodatkowo, jako kontrolę dla RNAi zastosowano pomieszaną małą, interferującą sekwencję RNA (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) bez podobieństwa sekwencji do jakichkolwiek znanych sekwencji genów myszy, szczurów lub ludzi. Skuteczność wyciszania genów za pośrednictwem lipofektaminy (Invitrogen, Carlsbad, CA) oceniono za pomocą analizy immunoblot dla GSK3b. Zadowalające tłumienie ekspresji białka GSK3b obserwowano w hodowanych podocytach, komórkach mezangialnych i komórkach nabłonka kanalików 24 godziny po RNAi. Komórki następnie poddano działaniu normalnego środowiska/pożywki hodowlanej, środowiska cukrzycowego lub pożywki kontrolnej o wysokiej osmolalności przez 48 godzin, jak podano powyżej, zanim komórki poddano dalszej obróbce.

Studia kliniczne

Kliniczna część tego badania była zgodna z wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej z 1975 r. i została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Zhengzhou. Uczestnicy badań na ludziach nie byli specjalnie rekrutowani do tego badania. Wszystkie dane kliniczne zebrano przez retrospektywny przegląd wykresów i badanie zarchiwizowanych skrawków tkanek lub próbek moczu z banku. Nadmiarowe lub odrzucone próbki biopsji nerki, a także frakcjonowane próbki moczu były rutynowo przechowywane w Instytucie Nefrologii Pierwszego Szpitala Zrzeszonego Uniwersytetu Zhengzhou. Zarchiwizowane, niezidentyfikowane tkanki z biopsji nerki utrwalone formaliną i zatopione w parafinie od pacjentów w różnym stopniu zaawansowania DN zostały losowo wybrane do badania. Dodatkowe próbki nerki bez zmian histomorfologicznych pobrano z nerek odrzuconych do przeszczepu z powodu anomalii naczyniowych lub z tkanek z biopsji przedimplantacyjnej i służyły one jako normalne kontrole. W retrospektywnym badaniu kohortowym łącznie 127 pacjentów z cukrzycą typu 2, którzy od 2010 r. byli obserwowani za pomocą zebranych w banku próbek frakcjonowanego moczu, poddano retrospektywnemu badaniu przesiewowemu pod kątem włączenia do tego badania. Badani pacjenci byli w wieku od 29 do 80 lat, u których rozpoznano cukrzycę typu 2 według kryteriów Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego. Kryteria wykluczenia obejmowały utratę działań następczych, nieodpowiednie informacje,nerkadysfunkcja, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 lat. Podczas rutynowej obserwacji dokumentowano dane demograficzne, a także parametry kliniczne, w tym płeć, wiek, choroby współistniejące, przyjmowane leki, czas trwania cukrzycy, ciśnienie krwi, poziom glikemii, poziom kreatyniny w surowicy, dane z badania moczu, ZEA i eGFR. Wynikiem klinicznym po 5 latach obserwacji była obecność lub brak progresji niewydolności nerek, którą zdefiniowano jako 25-procentowe zmniejszenie eGFR lub progresję albuminurii, na co wskazuje nasilenie albuminurii w różnych stadiach klinicznych DN, czyli normoalbuminuria, mikroalbuminuria, makroalbuminuria lub jawna proteinuria. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

Ocena morfologii nerek i analiza immunohistochemiczna

Zatopione w parafinie, utrwalone w formalinie bloczki tkanki nerki myszy pocięto na skrawki 3-mm. W przypadku histologii ogólnej skrawki poddano obróbce do barwienia kwasem nadjodowym-Schiffa. Barwienie immunohistochemiczne dla GSK3b i p-GSK3b przeprowadzono przy użyciu zestawu VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), jak opisano wcześniej.20 Jako kontrolę negatywną, pierwotne przeciwciało zastąpiono surowicą nieodporną z tego samego gatunku; nie wystąpiło zabarwienie. Cechy morfologiczne wszystkich przekrojów zostały ocenione przez jednego obserwatora w sposób zaślepiony przy pomocy nefrologa.

Barwienie immunofluorescencyjne

Hodowane komórki lub zamrożone skrawki kriostatu utrwalono i wybarwiono pierwszorzędowymi przeciwciałami, a następnie zastosowano drugorzędowe przeciwciała skoniugowane z Alexa Fluor (Invitrogen). Jako kontrolę negatywną pierwotne przeciwciała zastąpiono przedodporną IgG z tego samego gatunku; nie wystąpiło zabarwienie. Na koniec, skrawki wybarwiono kontrastowo 40,6-diamidyno-2-fenyloindolem lub jodkiem propidyny i umocowano za pomocą pożywki zamykającej VECTASHIELD (Vector Laboratories). W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej FL wszystkie skrawki analizowano w tym samym czasie, aby wykluczyć artefakty spowodowane zmiennym rozpadem fluorochromu. Skrawki badano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus FL wyposażonego w kamerę cyfrową Spot II (Olympus, Tokio, Japonia). W przypadku barwienia dwukolorowego obrazy pozyskiwano sekwencyjnie, aby uniknąć interferencji barwnika. Oprogramowanie ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) zostało użyte do postprocessingu obrazów, na przykład skalowania, łączenia i analizy kolokalizacji.

Komputerowa morfometria

Obrazy barwienia immunohistochemicznego rejestrowano i digitalizowano przy użyciu komputerowego systemu analizy obrazu składającego się z aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości ze sprzężonym ładunkiem, podłączonego do mikroskopu (Olympus BX41, Olympus) i do komputera. Obrazy były wyświetlane w rozdzielczości piksela 1024 768 pikseli (rozdzielczość przestrzenna, 0,24 mm/piksel). W przypadku obrazów barwienia immunohistochemicznego tkanek ludzkich nerek zastosowano oprogramowanie ImageJ do segmentacji obrazu, ustalenia progu i pomiarów natężenia sygnału. W razie potrzeby dokonywano korekt ręcznych. W sumie do analizy morfometrycznej pobrano próbki 10 kłębków nerkowych lub 10 losowych pól cewkowo-śródmiąższowych, a końcowe dane wyrażono jako wartość całkowanej gęstości pikseli względem grupy kontrolnej.

Analiza Western immunoblot

Hodowane komórki poddano lizie;nerkatkankilub izolowane kłębuszki nerkowe homogenizowano w buforze testowym radioimmunoprecypitacji uzupełnionym inhibitorami proteazy, a próbki poddano obróbce do analizy immunoblot. W celu przeprowadzenia analizy immunoblot ograniczonej liczby złuszczonych komórek w moczu zmodyfikowano protokół Western blot, jak opisano wcześniej, stosując wysokowydajne żele NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) i wysokiej jakości membrany transferowe.25 Udoskonalony immunoblotting może wykrywają białka o umiarkowanej ekspresji w zaledwie 1000 komórek. Przeciwciała przeciwko GSK3b, fibronektynie, kolagenowi IV, aktynie i dehydrogenazie -3-fosforanu gliceraldehydu (GAPDH) zakupiono z Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); te przeciwko synaptopodynie zakupiono od PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Niemcy); a te przeciwko ZO-1 i p-GSK3b uzyskano z Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Analiza statystyczna

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 porównania. Dane kategoryczne porównano między grupami za pomocą testu chi-kwadrat. Zastosowano analizę regresji liniowej w celu zbadania możliwych zależności między 2 parametrami. Przeprowadzono jednoczynnikową analizę regresji proporcjonalnego hazardu Coxa w celu oceny związku między odpowiednimi zmiennymi a ryzykiem progresji niewydolności nerek, a następnie przeprowadzono analizy wieloczynnikowe w odniesieniu do potencjalnych czynników zakłócających. Przeprowadzono analizę krzywych ROC i zmierzono obszary pod krzywymi ROC, aby przeanalizować siłę niektórych zmiennych w przewidywaniu progresji niewydolności nerek u pacjentów z cukrzycą. Zmienne o nienormalnym rozkładzie, takie jak ZEA, zostały przekształcone logarytmicznie w celu uzyskania normalności dla analizy regresji hazardów proporcji Coxa dla analiz krzywych ROC. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu PSS wersja 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). Wartości P<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

UJAWNIENIE

Wszyscy autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

PODZIĘKOWANIE

Część tego badania została przedstawiona jako prezentacja ustna na dorocznym spotkaniu KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology, 15–20 listopada 2016 r., Chicago, IL. RG był częściowo wspierany przez fundację dla Zdrowia. XL był wspierany przez stypendium naukowe na staż zaoczny. ZL był wspierany przez granty National NaturalScience Foundation of China U1604284, 81770672 i 81873612. Fundatorzy nie brali udziału w projektowaniu i prowadzeniu tego badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani przygotowaniu i zatwierdzeniu rękopisu.

AUTORSKIE WKŁADY

RG opracował konceptualne pomysły. XL, ZL i RG wnieśli swój wkład w projekt badania. XL, PW, BC, YG, AYG i BF przeprowadziły eksperymenty z hodowlą komórkową. XL i ZL przeprowadzili eksperymenty na zwierzętach i zebrali dane od pacjentów z cukrzycą. XL, LJW, DKM, LDD, ZL oraz przyczyniły się do dyskusji i interpretacji wyników. objął prowadzenie w pisaniu rękopisu. XL, BC i BF przyczyniły się do redakcji rękopisów. Wszyscy autorzy zgodzili się, że cała koncepcja i własność tej pracy należą do RG. Wszyscy autorzy zatwierdzili ostateczny rękopis.

MATERIAŁ UZUPEŁNIAJĄCY

Metody uzupełniające.

Tabela S1. Charakterystyka osób z grupy kontrolnej i pacjentów z nefropatią cukrzycową ze stratyfikacją według klas histologicznych nefropatii cukrzycowej. Tabela S2. Wyjściowe dane demograficzne, kliniczne i laboratoryjne retrospektywnej kohorty pacjentów z cukrzycą we wczesnym stadium bez objawów DKD. Tabela S3. Dane demograficzne, kliniczne i laboratoryjne pacjentów z cukrzycą typu 2 we wczesnym stadium, ze stratyfikacją według stanu nerek po 5 latach obserwacji. Rysunek S1. Zwiększona aktywność nerkowa GSK3b przewiduje rozwój i nasileniecukrzycowynerkachorobau myszy db/db. Samce myszy db/db i db/m obserwowano między 4 a 13 tygodniem życia. (A) Krew pobrano od myszy nie będących na czczo w wieku 4 i 7 tygodni i oznaczono poziomy glukozy w osoczu. *P < 0.001="" w="" porównaniu="" z="" db/m="" myszy="" w="" wieku="" 7="" tygodni.="" n="15-18." (b)="" pobrano="" próbki="" moczu="" w="" 4,="" 7,="" 10="" i="" 13="" tygodniu="" życia="" i="" poddano="" badaniu="" albuminy="" moczu="" i="" kreatyniny="" w="" moczu="" w="" celu="" określenia="" stosunku="" albuminy="" w="" moczu="" do="" kreatyniny="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" w="" porównaniu="" z="" db/m="" myszy="" w="" wieku="" 10="" tygodni="" (n="15-18);" #p="">< 0,001="" wobec="" myszy="" db/m="" w="" wieku="" 13="" tygodni.="" n="15-18." (c)="" wszystkie="" myszy="" otrzymały="" otwartą="" biopsję="" nerki="" w="" wieku="" 7="" tygodni,="" a="" próbki="" biopsji="" poddano="" analizie="" immunoblot="" pod="" kątem="" p-gsk3b,="" gsk3b="" i="" gapdh.="" (d)="" immunobloty="" poddano="" analizie="" densytometrycznej.="" względną="" obfitość="" gsk3b="" i="" p-gsk3b="" określono="" jako="" stosunki="" densytometryczne="" odpowiedniej="" cząsteczki/gapdh="" jako="" krotność="" zmian="" w="" porównaniu="" z="" kontrolnymi="" myszami="" db/m.="" względną="" aktywność="" gsk3b="" obliczono="" jako="" stosunki="" p="" gsk3b="" do="" gsk3b="" jako="" fałdy="" myszy="" kontrolnych="" db/m.="" (e)="" analiza="" regresji="" liniowej="" wykazała="" statystycznie="" istotną="" dodatnią="" korelację="" między="" nerkową="" aktywnością="" gsk3b="" w="" wieku="" 7="" tygodni="" u="" myszy="" db/db="" a="" rozwojem="" i="" nasileniem="" albuminurii,="" która="" jest="" cechą="">cukrzycowynerkachorobaw wieku 13 tygodni. R=0,699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Analiza krzywej charakterystyki działania odbiornika wykazała, że ​​nerkowa aktywność GSK3b we wczesnych stadiach cukrzycy (7 tygodni) zapewnia doskonałą dokładność i moc w przewidywaniu rozwoju albuminurii i DKD w wieku 13 tygodni u myszy db/db. Rysunek S2. Insulinooporność i wysoki poziom glukozy w otoczeniu synergistycznie aktywują GSK3b w komórkach nerki. (A) Hodowane mysie podocyty, (B) kłębuszkowe komórki mezangialne moczu (MMC) i (C) komórki nabłonka kanalików nerkowych (TEC) transfekowano mieszanymi oligonukleotydami siRNA (siCon) lub oligonukleotydami siRNA (siIRb) specyficznymi dla izoformy b receptor insuliny (IRB) do modelowania stanu insulinooporności in vitro. Następnie komórki eksponowano przez 48 godzin na normalne środowisko zawierające glukozę (NG) lub środowisko cukrzycowe o wysokim stężeniu glukozy (HG). Lizaty komórkowe zebrano i poddano analizie immunoblot pod kątem IRB, p-GSK3b, GSK3b i GAPDH, a następnie analizie densytometrycznej blotów. *P < 0,01="" versus="" ekspresja="" irb="" w="" komórkach="" traktowanych="" sicon="" wystawionych="" na="" to="" samo="" środowisko="" (n="3)," #p="">< 0,05="" versus="" ta="" sama="" ekspresja="" białka="" w="" grupie="" siirb="" þ="" ng="" lub="" sicon="" þ="" hg="" (n="3)," &p="">< 0,05="" w="" porównaniu="" z="" taką="" samą="" ekspresją="" białka="" w="" drugiej="" grupie="" hg="" lub="" siirb="" þ="" ng="" (n="3)." rysunek="" s3.="" poziomy="" ekspresji="" mrna="" gsk3b="" w="" próbkach="" ludzkiej="" nerki="" pobranych="" od="" zdrowych,="" żyjących="" dawców="" i="" pacjentów="" z="" nefropatią="" cukrzycową.="" dane="" uzyskano="" z="" www.nephroseq.org="" na="" podstawie="" zbioru="" danych="" ju="" ckd="" glom51="" i="" wyrażono="" jako="" intensywność="" wyśrodkowaną="" w="" log2.="" rysunek="" s4.="" zwiększona="" aktywność="" gsk3b="" w="" złuszczanych="" komórkach="" moczu="" pobranych="" od="" pacjentów="" z="" cukrzycą="" we="" wczesnym="" stadium="" zapowiada="" rozwój="" cukrzycowej="" choroby="" nerek.="" (a,="" b)="" wykrywanie="" gsk3b="" i="" aktywowanego="" gsk3b="" w="" złuszczanych="" komórkach="" moczu="" pobranych="" od="" pacjentów="" z="" cukrzycą="" we="" wczesnym="" stadium="" (pts)="" i="" osób="" zdrowych="" (ctrls).="" złuszczone="" komórki="" moczu="" zebrano="" i="" poddano="" lizie.="" lizaty="" komórkowe="" poddano="" obróbce="" do="" analizy="" immunoblot="" dla="" gsk3b,="" p-gsk3b="" i="" gapdh.="" (c)="" immunobloty="" poddano="" analizie="" densytometrycznej.="" względną="" ilość="" gsk3b="" i="" p-gsk3b="" określono="" jako="" stosunki="" densytometryczne="" odpowiedniej="" cząsteczki/gapdh="" jako="" krotność="" zmian="" w="" porównaniu="" z="" kontrolami="" (ctrls).="" względną="" aktywność="" gsk3b="" obliczono="" jako="" stosunki="" p-gsk3b="" do="" gsk3b="" jako="" krotności="" normalnej="" kontroli="" (ctrls).="" (d)="" analiza="" krzywej="" charakterystyki="" działania="" odbiornika="" wykazała,="" że="" ​​względna="" aktywność="" gsk3b="" (stosunek="" p-gsk3b/gsk3b)="" w="" złuszczanych="" komórkach="" moczu="" pobranych="" od="" pacjentów="" we="" wczesnym="" stadium="" cukrzycy="" zapewnia="" doskonałą="" dokładność="" w="" przewidywaniu="">cukrzycowa choroba nerekza 5 lat, przy czym pole pod krzywą (AUC) wynosi 00.886.

BIBLIOGRAFIA

1. Umanath K, Lewis JB. Aktualizacja dotycząca nefropatii cukrzycowej: podstawa programowa 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Zmiany w powikłaniach związanych z cukrzycą w Stanach Zjednoczonych, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan na opóźnienie lub zapobieganie mikroalbuminurii w cukrzycy typu 2. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetyczne mechanizmy nefropatii cukrzycowej. J Am Soc Nefrol. 2005;16(suplement 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Objawy kliniczne i naturalny przebieg nefropatii cukrzycowej. Kontrybucja Nefrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA i in. 10-roczna obserwacja intensywnej kontroli glikemii w cukrzycy typu 2. N Engl J Med. 2008;359:1577-1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE i in. Mikroalbuminuria i ryzyko wczesnego postępującego pogorszenia czynności nerek w cukrzycy typu 1. J Am Soc Nefrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM i in. Ryzyko progresji CKD z normoalbuminurią do schyłkowej niewydolności nerek u osób z cukrzycą: badanie CRIC (Chronic Renal Insuffiency Cohort). Am J Nerki Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Potrzeba wczesnych predyktorów ryzyka nefropatii cukrzycowej: czy szybkość wydalania albumin jest wystarczająca? Cukrzyca. 2000;49:1399-1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Niski wskaźnik przesączania kłębuszkowego u pacjentów z cukrzycą typu 1 z prawidłową albuminą: wskaźnik bardziej zaawansowanych zmian kłębuszkowych. Cukrzyca. 2003;52:1036–1040.

11. Królewski AS. Postępujący zanik nerek: nowy paradygmat nefropatii cukrzycowej w cukrzycy typu 1. Opieka nad cukrzycą. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Nefropatia cukrzycowa niebiałkomoczowa. J Clin Med. 2015;4:1761-1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Rozwój i progresja nefropatii w cukrzycy typu 2: The United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS 64). Nerka wewn. 2003;63:225-232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Biomarkery w moczu w ocenie wczesnej nefropatii cukrzycowej. J Cukrzyca Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y i in. IgG4 i Smad1 w moczu są swoistymi biomarkerami zmian strukturalnych i czynnościowych nerek we wczesnych stadiach nefropatii cukrzycowej. Cukrzyca. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Wydalanie pełnej długości megaliny z moczem za pośrednictwem egzocytozy jest związane z patogenezą nefropatii cukrzycowej. Cukrzyca. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z i in. Kinaza syntazy glikogenu 3b dyktuje ruchliwość podocytów i ogniskową adhezję poprzez modulowanie aktywności paksyliny: implikacje dla ochronnego działania małej dawki litu w podocytopatii. Jestem J Patholem. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Kinaza syntazy glikogenu-3: właściwości, funkcje i regulacja. Chem Rev. 2001;101:2527-2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Kinaza syntazy glikogenu-3 (GSK3): regulacja, działanie i choroby. Pharmacol. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. Izoforma b GSK3 pośredniczy w autonomicznym uszkodzeniu podocytów w glomerulopatii białkomoczowej. J Pathol. 2016;239:23.