Część 2: Verbascoside chroni komórki β trzustki przed stresem ER
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1,+, Paola Marciani 1,+, Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*
Pls Kliknij tutaj z powrotem do części 1
3.4 Werakozyd moduluje aktywność i dynamikę mitochondriów komórek β
Testy rentowności MTT sugerują możliwy wpływverbascosidebezpośrednio na mitochondria, co zapewnia sprzężenie wydzielania insuliny ze stanem odżywczym i przeżyciem komórek w tym typie komórek. Kształt i potencjał błony są markerami zdrowia mitochondriów [42]. Najpierw oceniliśmy potencjał błony mitochondrialnej, znakując komórki MitoSpyw Orange CMTMRos, przepuszczalnym barwnikiem, którego stężenie zależy od wewnętrznego potencjału błony mitochondrialnej, podczas gdy MitoSpyw Green FM został użyty do normalizacji danych do masy mitochondrialnej (ryc. 4A, B). Potencjał błonowy mitochondriów wverbascoside-komórki leczone były zwiększone w porównaniu z grupą kontrolną zarówno w warunkach podstawowych, jak i stresowych. Ciekaweverbascosidemetabolity wywierały różne skutki. Kwas kafejkowy nie poprawił potencjału mitochondrialnego, podczas gdy hydroksytyrozol spowodował zależne od dawki upośledzenie funkcji mitochondriów, zgodnie z danymi dotyczącymi żywotności komórek, taki efekt był bardziej widoczny po ekspozycji na H2O2 (ryc. S3).
Ponieważ funkcja jest ściśle związana z morfologią, zmierzyliśmy średnicę, powierzchnię i okrężność mitochondriów Fereta. Ostry stres oksydacyjny sprzyja rozległemu rozszczepieniu mitochondriów, co skutkuje mniejszymi, okrągłymi mitochondriami [42]. W warunkach stresu H2O2 mitochondria komórek poddanych działaniu verbascoside były bardziej wydłużone i wykazywały zwiększoną powierzchnię niż kontrolne (ryc. 4C, D i ryc. S4). Okrężność mitochondrialna była niższa w komórkach poddanych działaniu verbascoside niż w grupie kontrolnej, a różnice były bardziej widoczne w komórkach leczonych H2O2 (ryc. S3), ponownie potwierdzając ochronną rolę polifenolu.
Zdolność tych organelli do modyfikowania ich kształtu w odpowiedzi na stany żywieniowe lub stresujące warunki jest pod kontrolą zdarzeń fuzji i rozszczepienia i wymaga ruchliwości mitochondriów [39]. Śledzenie ruchów mitochondriów doprowadziło nas do obliczenia skumulowanej przebytej odległości, a analiza ujawniła znaczny wzrost dynamiki mitochondriów w komórkach leczonych werbasozydem w porównaniu z kontrolą, już w warunkach podstawowych (ryc. 4E, F i filmy S1-S4). Efekt był bardziej wyraźny po leczeniu H2O2, w rzeczywistości wstępna obróbka werbaskopowa prawie całkowicie odwróciła wpływ stresu oksydacyjnego na dynamikę mitochondriów.
Podsumowując, dane te silnie potwierdzają kluczową rolę werbasozydu w zapewnieniu dynamiki mitochondriów, która ma kluczowe znaczenie dla promowania szybkiej adaptacji tej organelli do warunków stresowych.
3.5 Wpływ wertakozydu na przetrwanie i funkcjonowanie człowieka Langerhansa
Biorąc pod uwagę potencjał translacyjnyverbascosidew zdrowiu człowieka zweryfikowaliśmy jego wpływ na wyizolowane wysepki Langerhansa, bardziej odpowiedni model do badań fizykopatologicznych i farmakologicznych na komórkach β. Izolowane wysepki leczono 16 uM werbasozydem przez 5 dni i oceniano potencjał błony mitochondrialnej. Jak podano na rycinie 5A, podczas gdy potencjał organelli był zagrożony w kontrolnych ludzkich wysepkach po ekspozycji na H2O2, wewnętrzny potencjał błonowy mitochondriów w wstępnie poddanych obróbce werkasydowych nie zmniejszył się znacząco, co potwierdza hipotezę ochronnej roli werbazydu przeciwko dysfunkcji komórek β wywołanej ROS. Analiza ekspresji markerów stresu ER wykazała istotną redukcję frakcji P-eIF2α w dwóch odrębnych preparatach wysp trzustkowych utrzymywanych w 16 uM werbaskopydu, potwierdzając regulację w dół tego szlaku również w próbkach ludzkich (ryc. 5D). Korzystne działanie leczenia polifenolami zostało potwierdzone przez zwiększoną zawartość insuliny obserwowaną na wyspach leczonych werbaskopem w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 5B). Dyspersja danych w naszych eksperymentach nie pozwoliła wykazać żadnej istotnej różnicy w wydzielaniu insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) w wysepkach leczonych werbaskopem, chociaż pozytywny trend wydaje się widoczny zarówno w warunkach podstawowych, jak i stresowych (ryc. 5C).
4. Dyskusja
Stres oksydacyjny i stan zapalny są podstawą dysfunkcji komórek β występujących podczas T2D [43,44] jako takie, żywność funkcjonalna, nutraceutyki i fitochemikalia zostały zbadane jako narzędzia zapobiegające cukrzycy typu 2 [45]. W tej pracy skupiliśmy się na werbasydzie, o którym wiadomo, że wywiera działanie przeciwzapalne i przeciwutleniające w neuronach [18]. Pomimo dużej złożoności strukturalnej, werbazyd i izonbazyd znaleziono w osoczu krwi szczurów karmionych ekstraktem Lippia citriodora wraz z niektórymi metabolitami [20]. Ponadto w linii komórkowej raka piersi SKBR3 [23] wykryto akumulację komórek werbazydu i werbazydu, a badania przeprowadzone na komórkach Caco-2 wykazują, że umiarkowane ilości werbasozydu i izonbazydu pozostają nienaruszone i biodostępne po procesie trawienia in vitro. Ponadto Caco-2 może pobierać obie cząsteczki poprzez szybki i liniowy transport w zakresie od 10 do 100 uM [22]. Nie zgłoszono żadnych danych na temat biodostępności werbaskopowej u ludzi, a jednak wyżej wymienione badania sugerują, że może być możliwe, aby niemetabolizowany werbazyd przekroczył barierę jelitową, krążył w osoczu krwi i wywierał działanie przeciwutleniające na endokrynologiczne β komórki trzustki.
Stwierdziliśmy zależną od dawki (0,8–16 uM) ochronną rolę werbasozydu na klonalnych i ludzkich komórkach β, zarówno w warunkach podstawowych, jak i stresowych. Efekt ten wynika z samego wraskopozydu, a nie z jego metabolitów kwasu kofeinowego i hydroksytyrozolu, które faktycznie wydają się cytotoksyczne w stężeniu 16 uM. Stężenia udowodnione w naszych eksperymentach są zgodne z tymi opisanymi u zwierząt karmionych werbakozydem [20].
Chociaż nie wiemy, czy verbascoside działa pozakomórkowo poprzez wiązanie się z receptorem błonowym, czy jest internalizowany przez endocytozę i działa wewnątrzkomórkowo, nasze dane potwierdzają, że werakozyd ma właściwości przeciwutleniające i przeciwzapalne oraz chroni komórki β przed dysfunkcjami związanymi ze stresem ER poprzez zmniejszenie UPR i promowanie dynamiki mitochondriów.
Rzeczywiście, wykryliśmy znaczny spadek zawartości ROS w komórkach poddanych działaniu verbascoside, co dodatkowo potwierdza zmniejszenie peroksydacji lipidów mierzone za pomocą ekspresji HNE i akroleiny. W przeciwieństwie do większości polifenoli roślinnych, werbaskopowa aktywność oczyszczania ROS następuje głównie pośrednio (poprzez regulację w górę enzymów usuwających ROS), a nie bezpośrednie szlaki. W rzeczywistości zwiększa transkrypcję genów niektórych enzymów przeciwutleniających poprzez aktywację szlaku Nrf2 (czynnika związanego z NF-E2) i mechanizm zależny od AhR (receptora węglowodorowego arylu) [24,29]. W związku z tym stwierdziliśmy zwiększoną ekspresję SOD1 w komórkach leczonych werkasydem.
Homeostaza ROS jest niezwykle istotna w patologii β-komórek. Ze względu na niedobór enzymów przeciwutleniających, podwyższona produkcja ROS nie może zostać zneutralizowana i wywołany jest stres ER promujący nieprawidłowe fałdowanie białek. Stres ER prowadzi do zmniejszenia transkrypcji i translacji insuliny poprzez aktywację UPR [44,46]. Szlak ten ma główny cel odzyskania funkcji ER poprzez przeprogramowanie ekspresji genów, jednak gdy jest nadmiernie stymulowany, wywołuje apoptozę. Nasze dane sugerują, że ważnym działaniem verbascoside jest złagodzenie UPR, umożliwiając modyfikacje niezbędne do naprawy dysfunkcji ER, bez powodowania apoptozy. Zgodnie z tą możliwością ekspresja białek BIP, HSP70 i PERK była zmniejszona w komórkach β leczonych werkasozydem, a aktywacja szlaku PERK została osłabiona w odpowiedzi na stres ER wywołany tunicamycyną. Podobne działanie zgłoszono dla tyrosolu w linii komórkowej insulinoma NIT-1 [47].
Szczególnie interesująca jest zdolność verbascoside do modulowania aktywacji gałęzi PERK UPR. W komórkach β szlak ten jest wymagany do utrzymania podstawowej homeostazy wydzielniczej i przeżycia komórek β, a w cukrzycy jest poważnie rozregulowany [41,48]. Jeszcze bardziej intrygujące, powszechne warianty w PERK przyczyniają się do ryzyka stanu przedcukrzycowego i recesywnych mutacji w genie EIF2AK3 (kodowanie PERK) leżących u podstaw podatności na zespół Wolcotta-Rallisona charakteryzujący się trwałą cukrzycą insulinozależną noworodków [49,50].
W naszym układzie wykryto również regulację w dół szlaku zapalnego IKBα-NFKB w obecności werbazydu. NFKB reprezentuje główny szlak zapalny w komórkach β, a jego trwała aktywacja inicjuje kaskadę zdarzeń zakończonych śmiercią komórek β. W zestresowanych komórkach β zmniejszenie ekspresji NFKB chroni komórki β trzustki przed czynnikami diabetogennymi [27,51], dodatkowo wspierając zastosowanie werbasozydu w profilaktyce cukrzycy. Co ciekawe, sygnalizacja PERK aktywuje czynniki transkrypcyjne NFR2 (zaangażowane w homeostazę redoks) i NFKB, wyjaśniając w ten sposób przeciwutleniające i przeciwzapalne działanie werbasozydu [40,52].
Nasze dane ujawniają również ważną rolę werbasozydu w aktywności i dynamice mitochondriów.
Markerem jakości operacyjnej mitochondriów jest ich dynamika, proces charakteryzujący się skoordynowanymi cyklami fuzji i rozszczepienia, które regulują liczbę mitochondriów, rozkład, morfologię i potencjał błony [39]. Zgodnie z tą możliwością, verbascoside poprawia potencjał błony mitochondrialnej βtc3 zarówno w warunkach podstawowych, jak i stresowych. Ponownie, efekt jest spowodowany werbasozydem, a nie jego metabolitami, ponieważ kwas kofeinowy nie poprawia funkcji mitochondriów, a hydroksytyrozol znacznie zmniejsza potencjał organelli. Zwiększoną dynamikę mitochondriów i zmiany w ich morfologii zaobserwowano poprzez śledzenie ruchów mitochondrialnych, co sugeruje, że verbascoside promuje program mito-morfozy. Przekształcenie komórkowej sieci mitochondrialnej wpływa na montaż superkompleksów łańcucha oddechowego, zmieniając w ten sposób nie tylko metabolizm komórkowy, ale także stan redoks i umożliwiając komórkom lepsze przeciwdziałanie stresowi oksydacyjnemu i stanom zapalnym [5,37,39].
Chociaż mechanizm molekularny jest nadal nieznany, możemy postawić hipotezę, że werbasukozyd, podobnie jak inne polifenole, chroni mitochondrialne DNA poprzez zmniejszenie stężenia ROS [53] i zapobiega otwieraniu mitochondrialnych porów przejściowych przepuszczalności [54], zapewniając fizjologiczną aktywność mitochondrialną. Inną intrygującą możliwością jest to, że modyfikacja dynamiki i aktywności mitochondriów jest ponownie pośredniczona przez działanie werbasozydu na UPR. Rzeczywiście, ostatnie badania w dziedzinie mitochondriów wskazują, że miejsca interakcji ER-mitochondria odgrywają kluczową rolę w kontroli dynamiki i aktywności mitochondriów w odpowiedzi na stres oksydacyjny, a PERK jest zaangażowany w to zjawisko [55]. Większość badań in vitro z polifenolami przeprowadzono w liniach komórkowych, często pochodzenia nowotworowego, które różnią się od pierwotnych komórek pod względem metabolizmu i produkcji ROS. Przedstawiamy tutaj dowody na to, że verbascoside wywiera ochronny wpływ również na ludzkie izolowane wysepki Langerhansa, ostateczny cel interwencji w cukrzycę. Co ciekawe, polifenol łagodzi aktywację sygnalizacji PERK już w warunkach podstawowych, zwiększając w ten sposób zawartość insuliny i zapobiegając dysfunkcjom mitochondrialnym za pośrednictwem stresu oksydacyjnego. Pozostaje wyjaśnić, czy wpływ polifenoli na zawartość insuliny odzwierciedla zdolność związku do zapobiegania śmierci komórek β, łagodzenia stresu ER lub bezpośredniej kontroli ekspresji genu insuliny, jak pokazano w przypadku innych związków polifenolowych [56]. Dane te są szczególnie istotne, biorąc pod uwagę możliwe zastosowanie werbasozydu jako terapii uzupełniającej w leczeniu cukrzycy.
5. Wnioski
Opisane tutaj badania in vitro na klonalnych i ludzkich komórkach β wskazują, że werbasozyd wywiera działanie ochronne przeciwko dysfunkcjom związanym ze stresem ER, łagodząc aktywację gałęzi PERK UPR i poprawiając dynamikę mitochondriów. Ponieważ zakłócenie homeostazy ER powoduje uszkodzenie komórek β i cukrzycę, dane te dostarczają uzasadnienia dla możliwego zastosowania wrazakozydu jako nutraceutyku w zapobieganiu i leczeniu chorób. Jednak wiele problemów musi zostać rozwiązanych w celu skutecznego klinicznego zastosowania werbaskopu. Pomimo bogactwa badań laboratoryjnych, wiarygodne badania kliniczne potwierdzające wpływ werbaskopydu in vivo na zdrowie są ograniczone. Ponadto zwiększenie jego stabilności i biodostępności jest obowiązkowe dla przyszłego zastosowania tego związku w zdrowiu ludzkim. Od tego momentu verbascoside jest interesującą cząsteczką, ponieważ jego rusztowanie ma różne reaktywne miejsca, które można modyfikować za pomocą chemii kombinacyjnej. Spodziewamy się, że informacje wynikające z tych badań otworzą możliwości terapeutycznej modulacji stresu oksydacyjnego i stanów zapalnych w stanach patologicznych poprzez zastosowanie naturalnych związków.
Materiały uzupełniające: Poniższe informacje są dostępne online na stronie http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Rycina S1: Wpływ kwasu kofeinowego i hydroksytyrozolu na żywotność komórek β. Ryc. S2: Wpływ werbaskudu na stres ER wywołany tunikamycyną. Ryc. S3: Wpływ kwasu kofeinowego i hydroksytyrozolu na potencjał błony mitochondrialnej. Ryc. S4: Ilościowe analizy obrazowe mitochondriów w komórkach leczonych kwasem kofeinowym i hydroksytyrozolem. Wideo S1, S2 Filmy: Dynamika mitochondriów zarejestrowana w warunkach podstawowych, przy braku (S1) lub obecności (S2) werbaskopu. Wideo S3, S4: Dynamika mitochondriów zarejestrowana w warunkach stresu oksydacyjnego, przy braku (S3) lub obecności (S4) werbaskopu.
Wkład autora: Konceptualizacja, A.G., P.M. i C.P.; kuracja danych, A.G. i P.M.; analiza formalna, A.G. i P.M.; pozyskiwanie finansowania, C.P.; dochodzenie, M.C.; metodologia, A.M. i S.G.; zasoby, F.B., R.R. i A.D.G.; nadzór, C.P.; walidacja, A.M., S.G. i M.C.; wizualizacja, A.G. i A.M.; pisanie – oryginalny szkic, A.G.; pisanie – recenzja i redakcja, P.M., A.M., F.B., R.R., A.D.G., M.C. i C.P. Wszyscy autorzy przeczytali i zgodzili się na opublikowaną wersję manuskryptu.
Finansowanie: Badania te nie otrzymały finansowania zewnętrznego.
Podziękowania: Chcielibyśmy podziękować Carlo Corino i Mario Dell'Agli za odczynniki i pomocną dyskusję.
Konflikty interesów: Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Odwołania
1. Cho, N.H.; Shaw, J.E.; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, J.D.; Ohlrogge, A.W.; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: Globalne szacunki rozpowszechnienia cukrzycy na 2017 r. i prognozy na 2045 r. Cukrzyca Res. Clin. Ćwicz. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, R.D.; Palmer, J.; Schlott, N.C.; Lernmark, A. Cukrzyca na rozdrożu: Znaczenie klasyfikacji chorób dla patofizjologii i leczenia. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, V.L.; MacDonald, P.E.; Klip, A. Biologia komórkowa układowej funkcji insuliny. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, A.L.; Norata, G.D. Metabolizm cholesterolu, funkcja β komórek trzustki i cukrzyca. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Algieria, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Kształtowanie różnicowania i funkcjonowania komórek β trzustki: wpływ mechanotransdukcji. Komórki 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, F.M.; Rorsman, P. Diabetes Mellitus and the β Cell: The Last Ten Years. Komórka 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, A.H.; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, S.A.; Trawers, M.E.; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, A.S.; i in. Zmniejszona egzocytoza insuliny w ludzkich komórkach trzustki z wariantami genów związanymi z cukrzycą typu 2. Cukrzyca 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, K.S. Dynamika wydzielania insuliny w otyłości i cukrzycy. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, G.I. Biologia integracyjna cukrzycy typu 2. Natura 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
