CZĘŚĆ Ⅰ: Rola SIK1 w przechodzeniu ostrego uszkodzenia nerek do przewlekłej choroby nerek
Mar 25, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 i in.
Tło
Ostre uszkodzenie nerek(AKI), powszechna choroba charakteryzująca się spadkiem współczynnika przesączania kłębuszkowego (GFR) i wzrostem stężenia kreatyniny w surowicy [1], jest uważana za czynnik ryzyka rozwoju i progresji PChN[2,3]. Ostatnio AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek) przejście stało się jednym z najważniejszych punktów w badaniach nad chorobami nerek. Chociaż doniesiono, że stan zapalny, EMT i zwłóknienie odgrywają istotną rolę w postępie AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejście [4,5], dokładny mechanizm molekularny AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejście jest nadal niejasne.
cistanche leczy choroby nerek i zapobiega niewydolności nerek
Kinaza indukowana solą 1(SIK1) należy do rodziny kinaz białkowych aktywowanych przez AMP (AMPK), które odgrywają kluczową rolę w regulacji metabolizmu, przeżycia komórek i wzrostu [6, 7]. Badania wykazały, że hamowanie SIK1(Kinaza indukowana solą 1)promuje EMT, prowadząc do migracji i przerzutów nowotworów[8-10]. Poza tym poinformowano, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)ujemnie reguluje aktywację NF-kB indukowaną przez TLR4- i osłabia ekspresję cytokin prozapalnych [11]. Ponadto pojawiające się dowody wykazały związek między SIK1(Kinaza indukowana solą 1)oraz choroby nerek [6,12]. Na przykład podwyższenie poziomu SIK1(Kinaza indukowana solą 1)odwrócił indukowaną wysoką glukozą proliferację komórek mezangialnych i akumulację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) poprzez hamowanie ekspresji FN i PAI-1, z których oba są zaangażowane w zaburzenia zwłóknieniowe, takie jak stwardnienie kłębuszków nerkowych [6,13]. Spekulujemy więc, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)może być zaangażowany w rozwój AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejście, które charakteryzuje się EMT, stanem zapalnym i zwłóknieniem nerek.
Szlak WNT/-katenina jest złożonym, wysoce konserwatywnym szlakiem sygnałowym, który reguluje różne procesy biologiczne, takie jak rozwój narządów, homeostaza tkanek i karcynogeneza [14, 15]. Chociaż jest cichy w normalnej dorosłej nerce, okazuje się, że jest reaktywowany w różnych chorobach nerek, w tym w ostrym uszkodzeniu nerek, nefropatii cukrzycowej, zwłóknieniu śródmiąższowym i torbielowatych chorobach nerek [16]. Ponadto doniesiono, że wyciszenie szlaku WNT/-katenina łagodzi zwłóknienie nerek, opóźniając postęp AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)w urazach wywołanych I/R [17]. Ale czy SIK1(Kinaza indukowana solą 1)może uczestniczyć w AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejście przez modulację szlaku WNT/-katenina pozostaje do dalszego wyjaśnienia.
Nowe dowody wykazały, że Snail i Twistl, czynniki transkrypcyjne EMT, odgrywają ważną rolę w patogenezie zwłóknienia nerek [18-20]. Doniesiono, że warunkowa delecja Twistla lub ślimaka w komórkach nabłonka kanalików proksymalnych hamuje EMT, osłabiając zwłóknienie śródmiąższowe w eksperymentalnie wywołanym zwłóknieniu nerek u myszy [21]. Biorąc pod uwagę, że Snail i Twist1 są istotnymi cząsteczkami zlokalizowanymi poniżej szlaku WNT/-katenina, spekulowaliśmy, że mogą one również odgrywać istotną rolę w SIK1(Kinaza indukowana solą 1)pośredniczy AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana.
Dlatego w tym badaniu staraliśmy się wyjaśnić rolę i mechanizm SIK1(Kinaza indukowana solą 1) w AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejście, które zapewni nowy cel terapeutyczny w profilaktyce klinicznej i leczeniu zwłóknienia nerek oraz zapewni nowy sposób na opóźnienie postępu AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana.
cistanche w leczeniu chorób nerek
Materiały i metody
Pacjenci i próbki tkanek
Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań Klinicznych Szpitala Prowincjonalnego Shandong przy Uniwersytecie w Shandong. Próbki ludzkich nerek pobrano od pacjentów z AKI (Ostre uszkodzenie nerek) zdiagnozowano na podstawie biopsji nerki, a próbki nerki w grupach kontrolnych pobrano z tkanki paranowotworowej pacjentów z guzami nerki, którzy przeszli resekcję chirurgiczną. Próbki tkanek przechowywano w ciekłym azocie, a świadoma zgoda została podpisana przez wszystkich pacjentów zgodnie z Deklaracją Helsińską.
Budowa AAV9-Sik1(Kinaza indukowana solą 1)
Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (AAV9-Sik1) i kontrola negatywna wirusa związanego z adenowirusem (AAV9-NC) zostały skonstruowane przez GENECHEM (Szanghaj, Chiny). Rekombinowany wektor wirusowy AAV9-Sik1 związany z adenowirusem GV467 zawiera promotor, region kodujący przeciwciało, region kodujący białko zielonej fluorescencji EGFP i region kodujący białko znacznika 3FLAG. Potwierdzono zdolność wektora AAV9 do transdukcji nerek (dodatkowy plik 1).
Zwierzęta i metody modelowania
Modelowanie i dalsze programy eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie w Shandong. Myszy C57BL/6 w wieku 4-6 tygodni i ważące 15-20 g zostały dostarczone przez Centrum Doświadczalne Zwierząt Uniwersytetu w Shandong i zostały losowo przydzielone do 4 grup: grupa kontrolna (kontrola), normalne myszy leczone grupą AA ( AA), myszy AA leczone AAV9-grupą Sik1 (AAV9-Sik1 plus AA), myszy AA leczone AAV9-grupą NC (AAV9-NC plus AA) . Myszom w grupie AA wstrzyknięto AA (10 mg/kg) dootrzewnowo, podczas gdy myszom w grupie kontrolnej wstrzyknięto PBS. 3, 7, 14 i 28 po wstrzyknięciu AA, 24-godzinny mocz myszy zebrano w metabolicznej klatce i supernatant przechowywano w -20 stopniu C po odwirowaniu. Krew odwirowywano przy 3000r przez 10 minut, a supernatant przechowywano w -20 stopniu .24 godziny białko w moczu, kreatynina w surowicy (Scr) i azot mocznikowy we krwi (BUN) mierzono automatycznym analizatorem biochemicznym. ILSA w surowicy -1 i TNF- zostały wykryte przez ELSA. Następnie myszy uśmiercono i zważono. Następnie wycięto i zważono nerki. Wszystkie próbki nerek podzielono na dwie części, z których jedną utrwalono w 4% paraformaldehydzie do barwienia histologicznego, a drugą przechowywano poniżej stopnia -80 do wykrywania w czasie rzeczywistym metodą PCR i Western blot.
Histologia i immunohistochemia
Po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie próbki nerki odwodniono, przeźroczyste, zatopiono w parafinie i podzielono na plastry o grubości 4 μm. Następnie szkiełka zostały odparafinowane, nawodnione i wybarwione. Do analizy histologicznej nerek stosowano barwienie HE, barwienie PAS i barwienie trichromem Massona zgodnie z instrukcjami producenta. Do analizy immunohistochemicznej skrawki inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko SIK1(Kinaza indukowana solą 1)(51045-1-AP, Proteintech, USA), E-kadheryna (20874-1-AP, Proteintech, USA), -SMA (ab32575, Abcam, USA), COL1(bs-10423R, Bioss , Pekin, Chiny) przy 4 stopniach w nocy. Po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym dodano DAB, a następnie przeprowadzono barwienie kontrastowe jądra hematoksyliną. Na koniec obrazy były obserwowane pod mikroskopem (Leica, Niemcy). Procent dodatniego barwienia dla SIK1(Kinaza indukowana solą 1), E-kadherynę, -SMA i COL1 mierzono za pomocą ilościowego oprogramowania Image-Pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Hodowla komórkowa i leczenie
Ludzkie komórki nabłonka kanalików proksymalnych (HK2) hodowano w pożywce DMEM (Gibco, USA) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (Gibco, USA) i 1% penicyliną-streptomycyną (Sigma, USA) w temperaturze 37 stopni C w nawilżona atmosfera zawierająca 5% CO2. Kwas arystolochowy (AA) (Sigma, USA) rozpuszczono w DMSO do 1 mg/mL, a komórki potraktowano końcowym stężeniem 10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L i 60 μmol/L, a grupa kontrolna była leczona taką samą ilością DMSO.
Transdukcja wektora lentiwirusowego i transfekcja siRNA Konstrukty lentiwirusowego shRNA celują w SIK1(Kinaza indukowana solą 1), -katenina i zaszyfrowany shRNA, a także wektor nadekspresji lentiwirusowej dla SIK1(Kinaza indukowana solą 1)a pusty wektor kontrolny został skonstruowany przez Cyagen (Guangzhou, Chiny). Sekwencje docelowe wymieniono w następujący sposób: SIKI shRNA:5'-GCCGCGTGCATTGATTACTATC-3';
Korzyści z pustynnego cistanche: leczenie przewlekłych chorób nerek
Wyniki
SIK1(Kinaza indukowana solą 1)został obniżony w AKI(Ostre uszkodzenie nerek)
Biorąc pod uwagę, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)odgrywa znaczącą rolę w uszkodzeniu nerek, najpierw wykryliśmy ekspresję SIK1(Kinaza indukowana solą 1)w tkankach nerkowych AKI(Ostre uszkodzenie nerek)pacjentów i AKI(Ostre uszkodzenie nerek)myszy. Barwienie immunohistochemiczne wykazało, że nie tylko u pacjentów, ale także u myszy, SIK1(Kinaza indukowana solą 1)ekspresja kanalików nerkowych w kontroli jest wyższa niż w AKI(Ostre uszkodzenie nerek)grupy, która wskazała, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)został obniżony podczas AKI(Ostre uszkodzenie nerek)(rys.la,b). Poza tym przeprowadziliśmy barwienie HE i trichromem Massona w celu analizy zmian histopatologicznych w próbkach nerek AKI(Ostre uszkodzenie nerek)pacjentów (ryc. 1c). W porównaniu z kontrolą, w grupie AKI obserwowano obrzęk komórek nabłonka kanalików nerkowych, zwyrodnienie wakuolarne i obrzęk śródmiąższowy za pomocą barwienia HE. Ponadto, w porównaniu z kontrolą, w grupie AKI zaobserwowano wyraźnie spłaszczone komórki kanalików, oderwany rąbek szczoteczki i powiększoną płótno kanalikowe w barwieniu trichromianem Massona. Podsumowując, wszystkie te ustalenia wskazują, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)może odgrywać rolę w urazie cewkowym.
Ryc.1 SIK1 został obniżony w AKI(Ostre uszkodzenie nerek).a Reprezentatywne obrazy barwienia immunohistochemicznego SIK1 w kontroli i AKI(Ostre uszkodzenie nerek)pacjentów. Skala =50 μm. Wykres przedstawia analizę ilościową SIK1 w skrawkach barwionych immunohistochemicznie.b Reprezentatywne obrazy barwienia immunohistochemicznego SIK1 w kontroli i AKI(Ostre uszkodzenie nerek)myszy. Skala =50 μm. Wykres przedstawia analizę ilościową SIK1 w skrawkach barwionych immunohistochemicznie. c Reprezentatywne obrazy barwienia HE i trichromu Massona w tkankach nerek AKI(Ostre uszkodzenie nerek)pacjentów. Skala =10 μm. Dane są pokazane jako średnia±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Kinaza indukowana solą 1)był obniżony w AKI-CKD wywołanym przez AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)myszy przejściowe
Aby uzyskać model myszy AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejścia, wstrzyknęliśmy myszom AA dootrzewnowo. W porównaniu z kontrolą, myszy leczone AA wykazywały zwiększoną produkcję czynników zapalnych, EMT i zwłóknienie nerek (ryc. 2a-d). Ponadto indeks nerkowy, Scr w surowicy, BUN i 24-godzinne białko w moczu zostały wzmocnione po leczeniu AA (ryc. 2e). Ponadto AA zaburza strukturę nerek, prowadząc do atrofii komórek nabłonka kanalików nerkowych, powiększenia wapna i różnego stopnia odkładania się włókien kolagenowych w kanaliku śródmiąższowym (ryc. 2f). Wszystko powyżej wskazywało, że AKI-CKD wywołany AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)model przejściowy został pomyślnie ustanowiony. Zbadanie roli SIK1(Kinaza indukowana solą 1)w AKI-CKD wywołanym przez AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek) przejścia, oceniliśmy jego ekspresję w próbkach nerek myszy, którym wstrzyknięto AA. Znaleźliśmy SIK1(Kinaza indukowana solą 1)i p-SIK1(Kinaza indukowana solą 1)(Thr182) zostały obniżone w sposób zależny od czasu po wstrzyknięciu AA (ryc. 2g), co wskazuje na potencjalną rolę SIK1(Kinaza indukowana solą 1)w regulacji AKI-CKD wywołanej przez AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana.
Ryc. 2 SIK1 był obniżony w AKI-CKD wywołanym przez AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)myszy przejściowe.analizę ELISA ekspresji IL-1 i TNF w różnych grupach myszy. b analiza Western blot i PCR w czasie rzeczywistym ekspresji markerów zapalenia i zwłóknienia (kaspazy1/p20/p10, FN i COL1); c Analiza Western blot i PCR w czasie rzeczywistym markerów EMT (E-kadheryna, wimentyna i -SMA). d Reprezentatywne obrazy barwienia immunohistochemicznego E-kadheryny w różnych grupach myszy. Skala =50 μm. Wykres przedstawia analizę ilościową E-kadheryny w skrawkach barwionych immunohistochemicznie. e Wskaźnik nerkowy, Scr, BUN i 24-godzinny poziom białka w moczu u różnych grup myszy. f Reprezentatywne obrazy barwienia histologicznego (barwienie HE, PAS i trichromem Massona) tkanek nerki w różnych grupach myszy. podziałka =50 μm. g Analiza Western blot poziomów białka SIK1 i p-SIK (Thr182) u myszy C57BL/6. Dane są pokazane jako średnia±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Nadekspresja SIK1(Kinaza indukowana solą 1)złagodzony AKI-CKD wywołany AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana
Aby określić funkcję SIK1(Kinaza indukowana solą 1)w AKI-CKD wywołanym przez AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejścia, wstrzyknęliśmy AAV9-SikI do żyły ogonowej myszy w celu nadekspresji SIK1(Kinaza indukowana solą 1). Stwierdziliśmy, że po wstrzyknięciu AAV9-Sik1, zaburzenia czynności nerek wywołane przez AA uległy znacznej poprawie, o czym świadczą obniżone poziomy wskaźnika nerkowego, Scr, BUN i 24-godzinnego białka w moczu (ryc. 3a). PCR w czasie rzeczywistym ujawnił, że AAV9-Sik1(Kinaza indukowana solą 1)złagodził odpowiedź zapalną wywołaną przez AA (ryc. 3b). Ponadto AAV9-Sik1(Kinaza indukowana solą 1)znacznie poprawiła uszkodzenia histopatologiczne wywołane przez AA (ryc. 3c). Ponadto wyniki barwienia immunohistochemicznego sugerują, że AAV9-Sik1(Kinaza indukowana solą 1)złagodzenie zwłóknienia śródmiąższowego i EMT w przebiegu AKI-CKD wywołanej AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejście (rys.3d). Ogólnie wyniki te wskazują, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)odgrywał ochronną rolę w AKI-CKD wywołanym przez AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana.
korzyści zdrowotne cistanche: poprawa funkcji nerek
SIK1(Kinaza indukowana solą 1)był obniżony w komórkach HK2 leczonych AA Wiele badań wykazało, że kanalik proksymalny nerki jest jednym z głównych celów uszkodzenia w AKI(Ostre uszkodzenie nerek), a uszkodzenie kanalika proksymalnego może odgrywać ważną rolę patofizjologiczną w rozwoju AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana. Dalsza ocena, czy SIK1(Kinaza indukowana solą 1)był obniżony in vitro, skupiliśmy się w tym badaniu na komórkach HK2. Wykonując testy CCK8, wybieramy 10 μmol/L AA jako optymalne stężenie do kolejnych eksperymentów (dodatkowy plik 2). Konsekwentnie, leczenie AA wykazywało zwiększone zapalenie, EMT i zwłóknienie w komórkach HK2 (Fig. 4a-c), co sugeruje indukowane AA uszkodzenie komórek HK2 in vitro. Następnie zbadaliśmy poziomy białka SIK1(Kinaza indukowana solą 1)i zaobserwował wyraźnie obniżony SIK1(Kinaza indukowana solą 1)i p-SIK1(Thr182) w komórkach HK2 w obecności AA (Fig. 4d). Ponadto wykryliśmy lokalizację SIK1(Kinaza indukowana solą 1)białko w komórkach HK2 przed i po ekspozycji na AA za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. W komórkach niestymulowanych SIK1(Kinaza indukowana solą 1)zaobserwowano zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Po leczeniu AA ekspresja SIK1(Kinaza indukowana solą 1)została zmniejszona i SIK1(Kinaza indukowana solą 1)był stopniowo wykrywany w jądrze (dodatkowy plik 3). Podsumowując, wyniki te wyjaśniły, że SIK1 był zaangażowany w uszkodzenie komórek HK2 wywołane przez AA.
Ryc. 3 Nadekspresja AKI-CKD wywołanej przez SIK1 złagodzonej przez SIK1(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przemiana.a. Wskaźnik nerkowy, Scr, BUN i 24-godzinny poziom białka w moczu w różnych grupach myszy. b Analiza PCR w czasie rzeczywistym poziomu kaspazy 1 i mRNA IL-1 w różnych grupach myszy. c W celu oceny zmian histologicznych i zakresu zwłóknienia kanalikowo-śródmiąższowego zastosowano barwienie HE, PAS i trichromianem Massona. Skala =50 µm. d Reprezentatywne obrazy barwienia immunohistochemicznego E-kadheryny, białka -SMA i COLI w różnych grupach myszy. podziałka =50 µm. Wykresy przedstawiały ilościową analizę E-kadheryny, -SMA i COL1 w skrawkach barwionych immunohistochemicznie. Dane przedstawiono jako średnią ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
ekstrakt z cistanche: poprawiają czynność nerek
Nadekspresja SIK1(Kinaza indukowana solą 1)poprawa uszkodzenia komórek HK2 wywołanych przez AA
Dalsze wyjaśnienie roli SIK1(Kinaza indukowana solą 1)w uszkodzeniu komórek HK2 wywołanym przez AA, skonstruowaliśmy linie komórkowe, które stabilnie podwyższają poziom SIK1(Kinaza indukowana solą 1)przez zakażenie lentiwirusem komórek HK2 (dodatkowy plik 4). Nadekspresja SIK1 doprowadziła do znacznego wzrostu E-kadheryny i stłumienia kaspaselu/p20/p10, wimentyny, COLI i Fspl w porównaniu z komórkami kontrolnymi stymulowanymi samym AA (Fig. 4e, f). Poza tym nadekspresja SIK1(Kinaza indukowana solą 1)hamował zdolność migracji komórek HK2 indukowanych przez AA (Fig. 4g). Razem te odkrycia wykazały, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)chronił przed uszkodzeniem wywołanym AA w komórkach HK2.
Ryc.4 SIK1 był regulowany w dół w komórkach HK2 traktowanych AA, a nadekspresja SIK1 poprawiała uszkodzenie komórek HK2 indukowane AA.a. Wykrywanie ELISA poziomów IL{{0}} i TNF w supernatancie komórek HK2 traktowanych 10 μmol/l AA przez 0 godz., 24 godz., 48 godz. i 72 godz. b Analiza Western blot poziomów kaspazy 1/p20/p10, E-kadheryny, ZO-1, wimentyny i -SMA w komórkach HK2 traktowanych 10 μmol/l AA przez 0 h, 24 h, 48 h, i 72 h, z największym efektem po 72 h leczenia. -aktynę zastosowano jako kontrolę. c Analiza PCR w czasie rzeczywistym wczesnych wskaźników zwłóknienia (COLI, PAI-1 i MMP9) poziomów mRNA w komórkach HK2 traktowanych 10 μmol/l AA przez 72 godziny. d Analiza Western blot poziomów p-SIK1(Thr182) i SIK1 w komórkach HK2 traktowanych 10 μmol/l AA przez 0 godz., 24 godz., 48 godz. i 72 godz. e Analiza Western blot kaspazy1/p20/p10, E-kadheryny, wimentyny, Fsp1 i COL1 w komórkach HK2 traktowanych wektorem SIK1 (wektor nadekspresji lentiwirusowej SIK1) w obecności 10 µmol/L AA lub traktowanych 10 µmol /L AA sam przez 72 godziny. f Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne E-kadheryny i wimentyny w komórkach HK2. Skala =50 μm. g Reprezentatywne wyniki migracji komórek HK2. Skala =50 μm. Dane są pokazane jako średnia±sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
ekstrakt z cistanche deserticola: leczenie chorób nerek
SIK1(Kinaza indukowana solą 1)regulowany szlak sygnałowy WNT/-katenina in vivo i in vitro
Biorąc pod uwagę krytyczną rolę szlaku WNT/-kateniny w AKI-CKD(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)przejścia, zbadaliśmy, czy SIK1(Kinaza indukowana solą 1)reguluje szlak WNT/-katenina. W doświadczeniach in vivo zaobserwowaliśmy, że nadekspresja SIK1(Kinaza indukowana solą 1)hamował poziomy białka WNT1, p- -kateniny (Y654) i jądrowej kateniny w AKI-CKD wywołanej AA(Ostre uszkodzenie nerek w przewlekłą chorobę nerek)myszy (ryc. 5a). Aby dokładniej zbadać, czy SIK1(Kinaza indukowana solą 1)regulowaliśmy szlak WNT/-katenina in vitro, wyciszyliśmy ekspresję SIK1(Kinaza indukowana solą 1)przez shRNA w komórkach HK2 (dodatkowy plik 5). Zgodnie z wynikami in vivo, wyciszenie SIK1 skutkowało znacznym wzrostem poziomu mRNA kateniny, TCF4 i LEF1 (ryc. 5b). Poza tym powalenie SIK1(Kinaza indukowana solą 1)podwyższył poziomy białka -kateniny i p- -kateniny(Y654) (ryc. 5c). Dodatkowo powalenie SIK1(Kinaza indukowana solą 1)promował translokację jądrową -kateniny (ryc. 5d). Łącznie dane te sugerowały, że SIK1(Kinaza indukowana solą 1)regulował szlak WNT/-katenina in vivo i in vitro.
Ryc.5 SIK1 reguluje szlak WNT/-katenina in vivo i in vitro.a. Analiza Western blot poziomów białka SIK1, WNT1, p- -kateniny (Y654) i jądrowej kateniny w różnych grupach myszy. b Analiza PCR w czasie rzeczywistym β-kateniny, TCF4 i LEF1 w komórkach HK2 traktowanych SIK1 shRNA lub Scramble shRNA. c Analiza Western blot -katenina i p- -katenina(Y654) w komórkach HK2 traktowanych SIK1 shRNA lub Scramble shRNA.d Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne -kateniny w komórkach HK2. Podziałka skali=50 um. Dane są pokazane jako średnia±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Szlak sygnałowy WNT/-katenina bierze udział w uszkodzeniu komórek HK2 wywołanym przez AA
Aby zbadać, czy szlak WNT/-katenina odgrywa rolę w uszkodzeniu komórek HK2 wywołanym przez AA, przetestowaliśmy poziomy ekspresji WNT1, jądrowej kateniny i p- -kateniny (Y654) po leczeniu AA. Wyniki analizy Western blot wykazały, że WNT1, jądrowa katenina i p- -katenina (Y654) wzrosły znacząco po stymulacji AA (dodatkowy plik 6a). Poza tym barwienie immunofluorescencyjne ujawniło translokację jądrową β-kateniny (dodatkowy plik 6b), co sugeruje, że stymulacja AA może aktywować szlak sygnałowy WNT/-katenina. Biorąc pod uwagę, że -katenina jest centralnym składnikiem szlaku WNT/ -katenina, zastanawiamy się, czy regulacja -kateniny reguluje uszkodzenie komórek HK2 wywołane przez AA. W ten sposób stabilnie znokautowaliśmy kateninę przez lentiwirusa shRNA w komórkach HK2 (dodatkowy plik 6c). Zaobserwowaliśmy, że knockdown -katenina osłabia indukowaną przez AA ekspresję kaspaselu, IL-1, wimentyny, PAI-1 i MMP9 oraz promuje ekspresję E-kadheryny (ryc. 6a, b). Ponadto komórki shRNA z kateniną stymulowane AA wykazywały znacząco zmniejszoną migrację w porównaniu z komórkami kontrolnymi z kateniną stymulowanymi samym AA (Fig. 6c). Podsumowując, odkrycia te sugerują, że szlak WNT/-katenina był zaangażowany w uszkodzenie komórek HK2 wywołane przez AA.
Ryc. 6 Szlak sygnałowy WNT/B-katenina jest zaangażowany w uszkodzenie komórek HK2 wywołane przez AA.Komórki HK2 traktowano shRNA kateniną B lub Scramble shRNA w obecności 10 umol/LAA.analiza PCR w czasie rzeczywistym kaspazy1.L-1BE-kadheryna.wimentyna, PA/-1.i Poziomy mRNA MMP9 w komórkach HK2. b Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne E-kadheryny i wimentyny w komórkach HK2. Skala =50 um.c Reprezentatywne wyniki migracji komórek HK2. Podziałka skali=50 um. Dane są pokazane jako średnia±sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Ścieżka sygnałowa WNT/-katenina jest wymagana dla SIK1(Kinaza indukowana solą 1)pośredniczone uszkodzenie komórek HK2 wywołane przez AA
Aby zbadać, czy SIK1(Kinaza indukowana solą 1)regulowane uszkodzenie komórek HK2 wywołane przez AA poprzez szlak sygnałowy WNT/-katenina, -katenina uległa dalszemu zmniejszeniu w SIK1(Kinaza indukowana solą 1)powalenie komórek HK2. W porównaniu z komórkami knockdown SIK1, dalsze knockdown -kateniny zmniejszyło poziomy mRNA kaspaselu, COL1 i wimentyny, jednocześnie zwiększając poziomy mRNA E-kadheryny (ryc. 7a). Wyniki analizy West-ern blot były zgodne z PCR w czasie rzeczywistym, wykazując, że wyciszenie -kateniny i SIK1 odwróciło regulację w dół E-kadheryny, regulację w górę kaspaselu/p20/p10 i wimentyny indukowaną przez SIK1(Kinaza indukowana solą 1)powalenie (rys. 7b).
Podsumowując, wyniki te wskazują, że hamowanie -kateniny odwracało odpowiedź zapalną, EMT i progresję zwłóknienia za pośrednictwem SIK1(Kinaza indukowana solą 1)knockdown, który silnie pokazuje, że szlak WNT/-katenina był wymagany dla SIK1(Kinaza indukowana solą 1)mediowane uszkodzeniem komórek HK2 indukowanym przez AA.
Fig. 7 Szlak WNT/-katenina jest wymagany do uszkodzenia komórek HK2 za pośrednictwem SIK1 indukowanego przez AA.Komórki HK-2 kotransfekowano SIK1 i B-kateninowym shRNA lub transfekowano samym SIK1 lub -kateninowym shRNA, a następnie traktowano 10 µmol/l AA przez 72 ha analizy PCR w czasie rzeczywistym kaspazy1, COL1. E-kadheryna i ekspresja wimentyny. b. Analiza Western blot ekspresji kaspazy1/p20/p10, E-kadheryny i wimentyny. Dane przedstawiono jako średnie ±sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Rola Twist1 w uszkodzeniu komórek HK2 wywołanym przez AA
Działając jako EMT-TF, Twistl może promować EMT i zwłóknienie nerek. W tym badaniu stwierdziliśmy, że AA promuje ekspresję białka i mRNA Ślimaka i Twist1, podczas gdy knockdown -katenina hamuje ekspresję Ślimaka i Twist1 indukowaną przez AA (ryc. 8a), wskazując, że Ślimak i Twist1 znajdują się poniżej kateniny i grają rola w uszkodzeniu komórek HK2 wywołanym przez AA. Aby zweryfikować naszą hipotezę, stłumiliśmy Twist1 przez siRNA (dodatkowy plik 7) i przeprowadziliśmy analizę PCR w czasie rzeczywistym i Western blot. Zgodnie z oczekiwaniami, w porównaniu z komórkami kontrolnymi stymulowanymi samym AA, ekspresja wimentyny i COLI była zmniejszona, podczas gdy ZO-1 było zwiększone w komórkach Twist1 siRNA w obecności AA, co sugeruje, że milczenie Twist1 łagodziło występowanie EMT oraz postęp zwłóknienia nerek wywołany przez AA (Fig. 8b i c).
Ryc.8 Rola Twist w uszkodzeniu komórek HK2 wywołanym przez AA.Western blot i analiza PCR w czasie rzeczywistym poziomów Snail i Twist1 w komórkach HK2. b Analiza PCR w czasie rzeczywistym Twist1, COL1, ZO-1 i wimentyny w komórkach HK2 traktowanych Twist1 siRNA lub NC siRNA.c. Analiza Western blot poziomów Twist1, ZO-1 i wimentyny w komórkach HK2 traktowanych Twist1 siRNA lub NC siRNA. Dane są pokazane jako średnia±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">