Część 1: Akteozyd hamuje osteoklastogenezę za pośrednictwem RANKL, hamując indukcję C-Fos i szlak NF-KB oraz osłabiając produkcję ROS

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Abstrakcyjny

Liczne badania wykazały, że cytokiny zapalne są ważnymi mediatorami osteoklastogenezy, powodując w ten sposób nadmierną resorpcję kości i osteoporozę.Akteozyd z ziela cistanche, główny składnik aktywny Rehmannia glutinosa, szeroko stosowany w tradycyjnej medycynie Wschodu, ma potencjał przeciwzapalny i antyoksydacyjny. W tym badaniu odkryliśmy, żeakteozydznacznie hamował różnicowanie i tworzenie osteoklastów z makrofagów szpiku kostnego (BMM) i makrofagów RAW264.7 stymulowanych przez aktywator receptora ligandu czynnika jądrowego kappaB (NF-kB) (RANKL).Akteozydwstępne leczenie zapobiegało również resorpcji kości przez dojrzałe osteoklasty w sposób zależny od dawki. Akteozyd (10 mM) osłabiał stymulowaną przez RANKL aktywację kinazy p38, kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym i kinazy c-Jun N-końcowej, a także hamował aktywację NF-kB przez hamowanie fosforylacji podjednostki p65 i inhibitora kBa. Ponadto, za pośrednictwem RANKL wzrost ekspresji c-Fos i czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T, cytoplazmatycznego 1 (NFATc1) oraz produkcji czynnika martwicy nowotworu-a, interleukiny (IL)-1b i IL-6 były najwyraźniej hamowane przez wstępne traktowanie akteozydem. Dalej, ustnieakteozydzmniejszono utratę masy kostnej wywołaną wycięciem jajników i produkcję cytokin zapalnych w celu kontroli poziomów. Nasze dane sugerują, że akteozyd hamuje różnicowanie i dojrzewanie osteoklastów z prekursorów osteoklastów poprzez hamowanie indukowanej przez RANKL aktywacji kinaz białkowych aktywowanych mitogenami i czynników transkrypcyjnych, takich jak NF-kB, c-Fos i NFATc1. Podsumowując, wyniki te sugerują, że akteozyd może działać jako środek antyresorpcyjny w celu zmniejszenia utraty kości poprzez blokowanie aktywacji osteoklastów.

akteozyd cistanche

Wstęp

Kość podlega ciągłej przebudowie dzięki zrównoważonej aktywności osteoklastów i osteoblastów [1]. Osteoklasty powstają z hematopoetycznych komórek prekursorowych linii monocytów/makrofagów, podczas gdy osteoblasty są z linii mezenchymalnej [2]. Nieprawidłowa aktywacja osteoklastów lub zmniejszona osteoblastogeneza może zakłócić homeostazę kości, ostatecznie powodując choroby, takie jak osteoporoza, zapalenie stawów i rak kości [3,4]. Osteoporoza to powszechna choroba kości, która prowadzi do zwiększonego ryzyka złamań. Najczęstszą postacią osteoporozy jest niedobór estrogenów u kobiet po menopauzie. Leki, takie jak kortykosteroidy i leki przeciwpadaczkowe, mogą również powodować zaburzenia równowagi między resorpcją i tworzeniem kości, co może skutkować osteoporozą [5].

Do leczenia osteoporozy stosowano wiele inhibitorów antyresorpcyjnych, w tym bisfosfoniany, kalcytoninę, estrogen i selektywne modulatory receptora estrogenowego. Inhibitory te utrzymują masę kostną poprzez hamowanie funkcji osteoklastów [6]. Estrogenowa terapia zastępcza jest najpopularniejszym sposobem zapobiegania i leczenia osteoporozy pomenopauzalnej. Jednak długoterminowa terapia zastępcza estrogenem może zwiększać ryzyko raka endometrium i piersi. Dlatego wielu badaczy skoncentrowało swoje wysiłki na opracowaniu nowego środka antyresorpcyjnego, który nie ma skutków ubocznych [7–10]. Ponieważ osteoklasty działają w resorpcji kości, w wielu badaniach za główny cel uznano swoiste hamowanie osteoklastów.

Osteoklasty to wielojądrowe komórki olbrzymie utworzone przez jednojądrzaste komórki progenitorowe z rodziny monocytów/makrofagów poprzez sekwencyjną proliferację, różnicowanie i fuzję krwiotwórczych komórek prekursorowych [11]. Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora ligandu czynnika jądrowego (NF)-kB (RANK) (RANKL) są istotnymi czynnikami różnicowania osteoklastów [12]. Ponadto kilka zapalnych cytokin, takich jak czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interleukina (IL)-1b, przyczynia się do osteoklastogenezy poprzez modulację indukcji RANKL, osteoprotegeryny i M-CSF [7,13]. Wiązanie RANKL z receptorem RANK na powierzchni komórki powoduje powstanie kompleksów czynników związanych z RANKL/RANK/TNFR (TRAF), które sekwencyjnie aktywują NF-kB i kinazy białkowe aktywowane mitogenami (MAPK), w tym kinazę N-końcową c-Jun (JNK), p38 kinaza i kinaza związana z sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) [14]. Ta aktywacja odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w różnicowaniu, aktywacji i przeżyciu osteoklastów. RANKL aktywuje również ekspresję czynników transkrypcyjnych, takich jak czynnik jądrowy aktywowanych komórek T, cytoplazmatyczny 1 (NFATc1) i c-Fos, które są niezbędne do rozwoju osteoklastów [7,9]. Dlatego sygnalizacja RANKL jest uważana za główny cel środków antyresorpcyjnych, które hamują aktywację osteoklastów i utratę masy kostnej.

Akteozydjest głównym aktywnym związkiem Rehmannia glutinosa, szeroko stosowanym w tradycyjnej medycynie Wschodu [15,16]. Akteozyd jest silnym przeciwutleniaczem i ma działanie antyhepatotoksyczne, przeciwzapalne i antynocyceptywne [17–20]. Wcześniej stwierdziliśmy, że akteozyd zmniejsza aktywność tyrozynazy i biosyntezę melaniny poprzez regulację sygnalizacji ERK [21], chroni przed uszkodzeniem dziąseł za pośrednictwem reaktywnych form tlenu (ROS) [22] i hamuje uszkodzenia komórek za pośrednictwem mikotoksyn [23]. Efekty te są ściśle związane ze zdolnością nukleozydów do usuwania ROS i regulowania sygnalizacji, w której pośredniczy MAPK. W szczególności sugeruje się, że ROS pośredniczą w szlakach sygnałowych indukowanych przez RANKL i zdarzeniach komórkowych w osteoklastach. Wstępne leczenie przeciwutleniaczami hamowało indukowaną przez RANKL aktywację NF-kB, ERK i IkBa, tym samym hamując osteoklastogenezę [24]. Odkrycia te silnie sugerowały, że oprócz aktywności przeciwzapalnej, aktywność przeciwutleniająca jest kluczowa dla środka antyresorpcyjnego, a zatem akteozyd może hamować osteoklastogenezę indukowaną przez RANKL.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy, czy akteozyd ma działanie terapeutyczne na utratę masy kostnej. Zbadaliśmy wpływ akteozydu na różnicowanie osteoklastów i resorpcję kości oraz powiązane mechanizmy komórkowe, stosując systemy eksperymentalne in vitro i in vivo.

Cistanche acteoside hamuje osteoklastogenezę indukowaną przez RANKL

Materiały i metody

Oświadczenie etyczne

Praktyki dotyczące opieki nad zwierzętami i ich użytkowania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki w Opiece i Wykorzystywaniu Zwierząt Laboratoryjnych w Chonbuk National University (Zezwolenie nr CBU 2010-0007). Wszystkie eksperymenty w tym badaniu przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu.

Myszy, chemikalia i wyroby laboratoryjne

Czterotygodniowe samice myszy ICR zakupiono od Orient Bio Inc. (Seul, Korea) i trzymano w 2261uC i 5655% wilgotności w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Z liści Rehmannia glutinosa wyizolowano akteozyd (3,4-dihydroksy-bfenetylo-Oa-ramnopiranozylo-(1R3)-4-O-kafeoilo-bD-glukopiranozyd; C29H36O15) (ryc. S1). Akteozyd przed użyciem rozpuszczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 i M-CSF zostały zakupione od R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Przeciwciała specyficzne dla c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa i b-aktyny uzyskano z Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Przeciwciała dla p-p38 i p38 zakupiono z Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Zestawy EIA do oznaczania wapnia i osteokalcyny (OC) zakupiono odpowiednio od BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) i Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA) w celu określenia parametrów biochemicznych surowicy. Do pomiaru poziomu TRAP5b w surowicy użyto także mysiego zestawu do oznaczania kwaśnej fosfatazy opornej na winian (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). O ile nie określono inaczej, dodatkowe chemikalia otrzymano z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), a wyroby laboratoryjne z SPL Life Sciences (Pochun, Korea Południowa).

Hodowle komórkowe

Komórki szpiku kostnego pobrano z kości piszczelowych i udowych 6-tygodniowych samic myszy ICR zgodnie z metodami opisanymi wcześniej [25]. Zawiesinę szpiku kostnego inkubowano w naczyniu hodowlanym 100- mm w obecności 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dniach komórki przylegające zastosowano jako makrofagi szpiku kostnego (BMM) do indukowania różnicowania osteoklastycznego. Niektóre komórki szpiku kostnego inkubowano również przez 48 godzin bez M-CSF, a komórki przylegające hodowano w pożywce różnicującej osteoblasty, jak opisano w innym miejscu [25]. Komórki makrofagów RAW264.7 hodowano w pożywce Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminą i antybiotykami. Komórki te zostały wykorzystane jako odpowiednik linii komórkowej dla BMM do zbadania wpływu akteozydu na osteoklastogenezę.

Różnicowanie osteoklastów i barwienie TRAP

BMM były wstępnie traktowane różnymi stężeniami (0–50 mM)akteozydprzez 2 h przed stymulacją 100 ng/ml RANKL. Pożywkę hodowlaną zastąpiono świeżą pożywką w dniach 2 i 5. Po 7 dniach inkubacji hodowle utrwalono w 4% paraformaldehydzie buforowanym PBS i wybarwiono TRAP przy użyciu zestawu Sigma Aldrich zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki TRAP-dodatnie zliczono za pomocą mikroskopii optycznej, a komórki zawierające 3 lub więcej jąder uznano za osteoklasty. Komórki RAW 264,7 poddano również działaniu 100 ng/ml RANKL po wstępnym traktowaniu akteozydem przez 2 godziny, a po 7 dniach inkubacji komórki poddano obróbce pod kątem barwienia TRAP.

Pomiar żywotności komórek

Żywotność komórek określono przy użyciu odczynnika rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazoliowej (WST)-8. W skrócie, komórki BMM lub RAW264.7 hodowane w pożywce wzrostowej zawierającej 10% FBS i antybiotyki potraktowano 10 mM akteozydem lub związkiem fenolowym, takim jak kwercetyna, luteolina, apigenina lub galusan -3-epigallokatechiny (EGCG). Odczynnik WST-8 dodano do hodowli po 48 godzinach inkubacji. Po inkubacji przez dodatkowe 4 godziny zmierzono absorbancję właściwą WST-8- przy 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Test resorpcji kości

BMM (16105 komórek/ml) zawieszono w a-MEM zawierającym 50 ng/ml M-CSF i 100 ng/ml RANKL, a następnie podzielono na płytkę 24-dołkową pokrytą nanokryształami fosforanu wapnia (OAAS{{6} }; Substrate Assay Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Korea Południowa) o gęstości 26104 komórek/cm2 z lub bez akteozydu. Po inkubacji przez 7 dni komórki usunięto z płytek za pomocą 5% podchlorynu sodu i pod mikroskopem optycznym zaobserwowano tworzenie się jamek. Resorbowany obszar był również mierzony za pomocą analizatora obrazu i wyrażany jako procent wartości kontrolnej.

Analiza Western Blot

Lizaty pełnego białka przygotowano w buforze do lizy, jak opisano w innym miejscu [26]. Białka cytozolowe i jądrowe przygotowano jak opisano wcześniej [25]. Równe ilości ekstraktu białkowego oddzielono przez 12–15% SDS-PAGE i przeniesiono na membrany z polifluorku winylu. Bloty sondowano pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w 4uC przed inkubacją z drugorzędowym przeciwciałem w buforze blokującym przez 1 godzinę. Plamy były

opracowane przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Wielka Brytania) i wystawione na kliszę rentgenowską (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

Test aktywności MAPK

Komórki wstępnie potraktowanoakteozydprzez 2 godz., a następnie stymulowana RANKL przez dodatkowe -30 min. Aktywność MAPK określono przy użyciu zestawów do testów immunometrycznych, takich jak zestaw do testu kinazy p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA), zestaw do testu enzymatycznego p-ERK (Projekt testu) i zestaw do testu ELISA kanapkowego p-SAPK/JNK (Technologia sygnalizacji komórkowej, MA, USA). Wszystkie procedury były zgodne z instrukcjami producenta, a absorbancję mierzono czytnikiem mikropłytek.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)

Reakcje wiązania DNA-białko prowadzono przez 30 min w temperaturze pokojowej, z 10-15 mg białka w 20 ml buforu zawierającego 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli(dI-dC), 5% glicerol , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30,000 cpm oligonukleotydów znakowanych [a-32P] dCTP i fragment Klenowa polimerazy DNA. Próbki rozdzielano na 6% żelach poliakrylamidowych, które suszono i eksponowano na kliszę rentgenowską (Eastman Kodak Co.) przez 12-24 hw 270uC. Sekwencje starterów oligonukleotydowych specyficzne dla NF-kB to 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 i 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.

Test lucyferazy NF-kB

Makrofagi RAW264.7 na płytkach 24-studzienkowych transfekowano 0.8 mg wektorem reporterowym kB-lucyferazy przy użyciu 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. W 24 godziny po transfekcji komórki stymulowano RANKL w obecności i nieobecności akteozydu przez 24 godziny. Komórki ponownie zawieszono w 100 ml reporterowego buforu do lizy

(Promega, Madison, WI, USA). Równe ilości próbek białka umieszczono w 96-dołkowych mikropłytkach i zmieszano z substratem lucyferazy. Luminescencję mierzono stosując luminometr do mikropłytek (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Niemcy). W tym doświadczeniu jako dodatni inhibitor kB zastosowano przepuszczalny peptyd inhibitora NF-kB (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).

Pomiar cytokin

Komórki BMM lub RAW264.7 stymulowano RANKL w obecności akteozydu w 24-dołkowych płytkach hodowlanych. Po 48 godzinach inkubacji supernatanty hodowli zebrano i oceniono za pomocą testu ELISA przy użyciu zestawów OptEIATM specyficznych dla TNF-a-, IL-1b- i IL-6- zgodnie z instrukcjami producenta.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

Ekspresję mRNA markerów osteoklastycznych, takich jak c-Fos, NFATc1 i TNF-a, określono metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. W skrócie, całkowity RNA wyekstrahowano z makrofagów odczynnikiem Trizol zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). cDNA zsyntetyzowano z 1 mg całkowitego RNA przy użyciu SuperScript Reverse Transcriptase II i starterów (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) został użyty do wykrycia akumulacji produktu PCR podczas cyklu za pomocą systemu wykrywania sekwencji ABI 7500 (Applied Biosystems). Po denaturacji w 95uC przez 10 min, PCR był

przeprowadzono przy użyciu czterdziestu 3- cykli denaturacji w 95uC przez 15 sekund, wyżarzania w 60uC przez 1 sekundę i wydłużania w 72uC przez 30 sekund. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono co najmniej w trzech powtórzeniach, a poziomy ekspresji znormalizowano do genu metabolizmu podstawowego HPRT w tej samej reakcji. W badaniu tym zastosowano te same sekwencje starterów, które opisano w innym miejscu [7].

Pomiar wewnątrzkomórkowego ROS

Roztwór podstawowy dioctanu 29,79-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Niemcy) przygotowano w DMSO i przechowywano w temperaturze 220uC w ciemności. W skrócie, BMM (106 komórek/ml w płytkach 6-dołkowych) hodowano z 50 ng/ml M-CSF przez 24 godziny, a następnie traktowano różnymi stężeniami (0–10 mM)akteozyd2 godziny przed stymulacją 100 ng/ml RANKL. Po 1 godzinie wspólnej inkubacji komórki te następnie inkubowano z 25 mM DCFH-DA przez 30 min. Zieloną fluorescencję 29,79-dichlorofluoresceiny (DCF) zarejestrowano przy 515 nm (FL 1) przy użyciu systemu FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) i 10,000 zdarzenia zliczano na próbkę.

Indukcja osteoporozy wywołanej wycięciem jajników

W tym badaniu zastosowano samice myszy ICR (w wieku 6 tygodni). Myszy przeszły operację pozorowaną (Sham, n =10) lub chirurgiczne wycięcie jajników (OVX, n=20) w znieczuleniu. Tydzień po operacji myszy OVX zostały losowo podzielone na 2 grupy po 10 myszy każda: obustronna OVX i obustronna OVX uzupełniona 200 ml

PBS zawierający 1 mM akteozyd doustnie (grupa AC). Akteozyd doustny podawano raz na 3 dni przez 8 tygodni po zabiegu i

taką samą ilość PBS podano grupom Sham i OVX. Po 1 dniu od ostatniego podania myszy uśmiercono, a następnie analizowano parametry biochemiczne w surowicy i 3-wymiarową strukturę kości.

Oznaczanie parametrów biochemicznych surowicy

Próbki krwi pobrano przez nakłucie serca, a surowicę zebrano przez odwirowanie. Próbki surowicy przechowywano w temperaturze 280uC do analizy parametrów biochemicznych. Poziomy IL-1b i IL-6 w surowicy oszacowano za pomocą zestawu ELISA, jak opisano powyżej, natomiast aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP) określono za pomocą biochemicznego testu kolorymetrycznego, który mierzy ilość p -nitrofenol wytwarzany z substratu fosforanu p-nitrofenolu, jak opisano w innym miejscu [27]. Aby oszacować biomarkery tworzenia i resorpcji kości, oznaczono również poziomy OC, wapnia i TRAP5b w surowicy zgodnie z instrukcjami producentów.

Analizy struktury kości i parametrów morfometrycznych

Udowe myszy (grupy pozorowane, OVX i AC) wycięto i wypełniono solą fizjologiczną do testów mechanicznych. Wytrzymałość mechaniczną kości udowej mierzono w sposób opisany w innym miejscu [28]. Obciążenie złamania rejestrowano jako szczytową siłę w niutonach w punkcie złamania środkowego trzonu prawej kości udowej. Ponadto, jasną kość udową każdego zwierzęcia analizowano histomorfometrycznie przy użyciu systemu tomografii mikrokomputerowej (mikro-CT) (system mikroogniskowy rentgenowski SkyScan 1076, Kontich, Belgia). Krótko mówiąc, kości w 4% formaldehydzie suszono powierzchownie na bibułce papierowej, a następnie owijano w plastikową „folię spożywczą” lub parafilm, aby zapobiec wysychaniu podczas skanowania. Każdą owiniętą plastikiem kość umieszczono w plastikowych/polistyrenowych rurkach, które zamontowano pionowo poziomo w komorze próbki skanera 1076 dla

obrazowanie mikrotomowe. Skanowanie przeprowadzono przy użyciu napięcia źródła 100 kV i prądu źródła 140 mA z rozdzielczością 35 mm.

Trójwymiarowe modele kości beleczkowatych kości udowej zrekonstruowano za pomocą SkyScan CT Analyzer wersja 1.11. Parametry strukturalne, takie jak gęstość mineralna kości beleczkowej (BMD, g/cm3), procent objętości kości (objętość kości (BV)/objętość tkanki (TV), procent), grubość (Tb.Th, mm), separacja (Tb.Sp , mm), a następnie zmierzono liczbę (Tb.N, 1/mm).

Test różnicowania osteogenicznego i mineralizacji Komórki szpiku kostnego hodowane na płytkach do hodowli studzienkowych {{{{10}}} poddano działaniu DAG (10 nM deksametazonu, 50 mM kwasu askorbinowego i 20 mM b-glicerofosforanu) w obecność 10 mM akteozydu. Po 2 tygodniach różnicowania komórki utrwalano lodowatym 70% (obj./obj.) etanolem przez 1 godz. i barwiono 0,2% czerwienią alizarynową S w wodzie destylowanej przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po odbarwieniu komórek i wysuszeniu na powietrzu płytki do hodowli komórkowych oceniano pod mikroskopem świetlnym przy użyciu mikroskopu odwróconego (Nikon TS100, Japonia). Aby określić ilościowo ilość czerwonego barwnika, plamę eluowano 10% chlorkiem acetylopirydyniowym przez wytrząsanie przez 20 minut i mierzono absorbancję przy 560 nm. Ilość wapnia osadzonego w warstwach komórek mierzono również przy użyciu zestawu Calcium C (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Ponadto ekspresja markerów mRNA specyficznych dla kości, takich jak czynnik transkrypcyjny związany z runt -2 (Runx2), osterix, sialoproteina kości (BSP) i OC, została określona za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Startery oligonukleotydowe tych markerów zaprojektowano z produktami o wielkości mniejszej niż 200 pz przy użyciu oprogramowania Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems), jak opisano w innym miejscu [27].

akteozyd cistanche pobudza tworzenie kości

Wyniki

Akteozyd hamuje tworzenie osteoklastów przez makrofagi w sposób zależny od dawki

Aby zweryfikować wpływ akteozydu na różnicowanie BMM do osteoklastów, komórki hodowano z różnymi stężeniami (0– 20 mM) akteozydu przez 7 dni w obecności 50 ng/ml M-CSF i 100 ng/ml RANKL. Acteoside zmniejszał liczbę osteoklastów w sposób zależny od dawki. Gdy komórki były wstępnie traktowane 10 mM akteozydem przez 2 godziny, liczba osteoklastów zmniejszyła się o 43% w porównaniu z komórkami suplementowanymi M-CSF i RANKL (Fig. 1A). Fig. 1B przedstawia różnicowanie osteoklastów za pośrednictwem RANKL i jego hamowanie przez skojarzone leczenie akteozydem. Zgodnie z tym wynikiem, wstępne traktowanie akteozydem zmniejszyło stymulowane RANKL różnicowanie komórek RAW264.7 i tworzenie osteoklastów (ryc. 1C i D). Kiedy porównano potencjał antyosteoklastyczny akteozydu na BMM z potencjałami antyosteoklastycznymi kilku związków fenolowych w tym samym stężeniu (10 mM), luteolina wykazała najwyższą aktywność (ryc. 2A). Jednak luteolina, kwercetyna lub sama apigenina zmniejszały żywotność komórek (ryc. 2B). Wszystkie związki hamowały różnicowanie osteoklastów przez makrofagi RAW264,7 o następujących względnych aktywnościach: luteolina. kwercetyna=apigenina .

310bb742834b96757ffeffe92b86828