Aktywność estrogenowa glikozydów z Cistanche Deserticola jako adiuwantu receptorów estrogenowych in vitro

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

WPROWADZANIE

Cistanche deserticola(„Rou Cong Rong” po chińsku), tradycyjne chińskie lekarstwo ziołowe, które po raz pierwszy zostało odnotowane w ShenNongBenCaoJing, było stosowane od tysięcy lat w leczeniu niewydolności nerek, impotencji, zaparć starczych i niedoboru krwi.[1] Występuje głównie w pustynnych regionach północno-zachodnich Chin, takich jak Gansu i Xinjiang.[2] Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że C. deserticola może rozwijać szerokie funkcje lecznicze, takie jak regulacja hormonów, działanie immunomodulujące, antyoksydacyjne, neuroprotekcyjne, przeciwzapalne i estrogenne.[3,4] Glikozydy Cistanches (GC) uznano za jedną z główne składniki aktywne o różnych skutkach biologicznych.[5,6]

Receptory estrogenowe (ERs) i ER to podtypy ER, które mogą regulować funkcje fizjologiczne.[7] Białka te mogą regulować transkrypcję genów docelowych poprzez wiązanie się z powiązanymi sekwencjami regulatorowymi DNA w jądrze komórkowym. Oba podtypy ulegają wyraźnej ekspresji w układzie sercowo-naczyniowym i ośrodkowym układzie nerwowym.8,9 ER występuje głównie w gruczole sutkowym, macicy, jajniku, kościach, męskim narządzie rozrodczym i prostacie. ER występuje głównie w prostacie, jajniku i pęcherzu moczowym.[10,11] Ponadto istnieją pewne wspólne role fizjologiczne dla tych dwóch podtypów, takie jak rozwój i czynność jajników oraz ochrona układu sercowo-naczyniowego. [12,13] Wcześniejsze badania w naszej grupie ujawniły mechanizm estrogenopodobny GC za pomocą metody analizy metabolomicznej.[14] W ciągłym badaniu przeanalizowaliśmy mechanizm aktywności estrogenowej GC na liniach komórkowych MCF‑7 związanych z ER.

MATERIAŁY I METODY

Instrumenty

Inkubator ECO‑170P‑230 pochodził z New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., czytnik mikropłytek Bio‑Rad 680, a aparat do elektroforezy z Bio‑Rad Laboratories, Inc., mikroskop CX21 z Olympus Co., Ltd. , system obrazowania żelu GIS‑2019 pochodził z firmy Tanon Science and Technology Co., Ltd., płaska płytka dolna pochodziła z firmy Corning Inc., cytometria przepływowa EPICS‑XL pochodziła z firmy Beckman‑Coulter Inc., a reakcja łańcuchowa polimerazy StepOnePlus w czasie rzeczywistym (PCR) pochodził z firmy Thermo Fisher Scientific.

Chemikalia i odczynniki

GC zostały przygotowane w naszym laboratorium zgodnie z wcześniej opisaną metodą [14], a czystość GC określono na 52 procent (akteozyd zastosowano jako marker do określenia GC) za pomocą spektrofotometrii w ultrafiolecie. Estradiol (E2) zakupiono od Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny). Płodowa surowica bydlęca (FBS) i RPMI‑1640 pochodziły z Gibco Co., Ltd., 96‑dołkowa płytka płaskodenna pochodziła z Corning Inc., a dimetylosulfotlenek (DMSO) i 3-[4,5‑dimetylo‑2‑tiazolil Bromek ]-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT) zakupiono od Sigma-Aldrich Corporation. Odczynnik TRIzol, zestaw do odwrotnej transkrypcji (RT) oraz zestaw TB Green™ RT‑PCR zostały zakupione w firmie TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Chiny. Przeciwciała skierowane przeciwko pAb królika ER, pAb przeciwko ER królika i ‑aktynie zakupiono od Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Wszystkie inne powszechnie stosowane chemikalia zakupiono od standardowych dostawców komercyjnych.

przygotowanie próbki

Przygotowanie glikozydów roztworu podstawowego Cistanches

Ekstrakt GCs rozpuszczono w DMSO w celu sporządzenia roztworu podstawowego o stężeniu 0.1051 g/ml i przechowywano w 4 stopniach. Do rozcieńczenia roztworu podstawowego do różnych stężeń przed użyciem użyto RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej.

Przygotowanie roztworu podstawowego estradiolu

Ekstrakt E2 rozpuszczono w DMSO w celu wytworzenia roztworu podstawowego o stężeniu 0,27 mg/ml i przechowywano w 4 stopniach. Do rozcieńczenia roztworu podstawowego do różnych stężeń przed użyciem użyto RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej.

Przygotowanie płodowej surowicy bydlęcej traktowanej dekstranem

Setki mililitrów FBS zmieszano z 250 mg sproszkowanego węgla aktywowanego i 25 mg dekstranu. Po inkubacji przez 45 min w 55°C, mieszaninę wirowano w 4°C, 1000 obr/min przez 15 min. Supernatant filtrowano przy użyciu membrany Millipore Express PES, aby uzyskać potraktowany dekstranem (CDT)-FBS węgiel drzewny i przechowywano w temperaturze -20 stopni.

Hodowlę komórkową

Linie komórek ludzkiego raka piersi MCF‑7 uzyskano z kolekcji kultur typu amerykańskiego (ATCC). Ponadto komórki hodowano w pożywce RPMI‑1640 zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37°C w nawilżonej atmosferze 5% CO2. Komórki hodowano w pożywce RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej, zawierającej 5% CDT‑FBS 4 dni przed testem MTT, tak aby estrogen z komórek został usunięty.

Analiza proliferacji komórek estradiolu na liniach komórkowych MCF-7

Proliferację komórek mierzono za pomocą testu MTT dla komórek MCF‑7.[15,16] E2 rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach {{27 }}.1, 1, 10, 100 i 1000 nM. Linie komórkowe MCF‑7 hodowano w pożywce RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej przez 4 dni. Po trzykrotnym przepłukaniu roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), do 96-dołkowych płytek dodano 100 µl pożywki RPMI‑1640 wolnej od FBS w ilości 1,5 × 104 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano różnymi stężeniami roztworu E2 przez 72 godziny. Następnie do każdego dołka dodano 100 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml). Komórki inkubowano przez 4 godziny. Na koniec dodano 150 µl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 570 nm czytnikiem mikropłytek i obliczono szybkość proliferacji (PR).

Analiza proliferacji komórek glikozydów Cistanches na liniach komórkowych MCF-7

Proliferację komórek mierzono za pomocą testu MTT dla komórek MCF‑7. GCs rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 i 175 µg /ml. Linie komórkowe MCF‑7 hodowano w pożywce RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 5% CDT‑FBS przez 4 dni. Po trzykrotnym płukaniu PBS do płytek 96-dołkowych dodano 100 µl pożywki RPMI‑1640 wolnej od FBS w ilości 1,5 × 104 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano różnymi stężeniami roztworu GCs odpowiednio przez 24, 48 i 72 godziny. Następnie do każdego dołka dodano 100 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml). Komórki inkubowano przez 4 godziny. Na koniec dodano 150 µl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 570 nm czytnikiem mikropłytek i obliczono PR. RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej i podłoże zawierające E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) były odpowiednio grupą ujemną i dodatnią.

Analiza proliferacji komórek glikozydów Cistanches z fulwestrantem na liniach komórkowych MCF-7

Proliferację komórek mierzono za pomocą testu MTT dla komórek MCF‑7. GCs rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Linie komórkowe MCF‑7 hodowano w pożywce RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 5% CDT‑FBS przez 4 dni. Po trzykrotnym płukaniu PBS do płytek 96-dołkowych dodano 100 µl pożywki RPMI‑1640 wolnej od FBS w ilości 1,5 × 104 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki poddano działaniu różnych stężeń roztworu GCs i inkubowano z fulwestrantem (6,06 × 10−5 µg/ml) przez 48 godzin. Następnie do każdego dołka dodano 100 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml). Komórki inkubowano przez 4 godziny. Na koniec dodano 150 µl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 570 nm czytnikiem mikropłytek i obliczono PR. RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej i podłoże zawierające E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) były odpowiednio grupą ujemną i dodatnią.

Test cyklu komórkowego

GCs rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Linie komórkowe MCF‑7‑hodowano w pożywce RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 5% CDT‑FBS przez 4 dni. Po trzykrotnym przemyciu PBS, 1 ml podłoża RPMI‑1640 wolnego od FBS dodano do 6-dołkowych płytek w ilości 2,5 × 105 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki poddano działaniu różnych stężeń roztworu GCs i inkubowano z fulwestrantem (6,06 × 10−5 µg/ml) przez 48 godzin. Następnie komórki zebrano i trzykrotnie przemyto PBS, odwirowano w 4 stopniach, 1000 obr./min przez 10 minut i utrwalono 70 procentowym etanolem w temperaturze -20 stopni przez noc. Po dwukrotnym przemyciu PBS komórki barwiono roztworem PI (50 mg/ml) zawierającym 1 mg/ml RNazy A i 0,1% Triton X-100 przez 30 min w ciemności w 4 stopniach. Cykl komórkowy wykrywano za pomocą cytometrii przepływowej, a wskaźnik proliferacji (PI) obliczono w następujący sposób. RPMI‑1640 bez czerwieni fenolowej i podłoże zawierające E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) były odpowiednio grupą ujemną i dodatnią. PI=(S plus G2 M)/(G0 /G1 plus S plus G2 M) × 100 procent

Izolacja RNA i analiza ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Do pomiaru poziomu mRNA zastosowano test ilościowy RT-PCR (qPCR). Całkowity komórkowy RNA wyekstrahowano odczynnikiem TRIzol. W przypadku qPCR, RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA z 4 µg całkowitego RNA przy użyciu zestawu RT. Analizy RT‑PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu TB Green™ RT‑PCR Kit. Wszystkie protokoły wykonano zgodnie z instrukcjami producenta. Parą starterów użytą do amplifikacji ER była 5'‑GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG‑3’ (w przód) i 5’‑TGGCTGGACACATATAGTCGTT‑3’ (w tył); para starterów użyta do amplifikacji ER to 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (w przód) i 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (w tył). Warunki PCR dla ER i ER wynosiły 94 stopnie przez 3 min, a następnie odpowiednio 37 i 40 cykli, 94 stopnie przez 30 s, 58 stopni przez 2 min i 72 stopnie przez 2 min. Parą starterów użytą do amplifikacji GAPDH była 5'‑GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT‑3’ (w przód) i 5’‑GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG‑3’ (w tył). Warunki PCR dla GAPDH wynosiły 94 stopnie przez 3 min, a następnie 30 cykli 94 stopnie przez 30 s, 58 stopni przez 2 min i 72 stopnie przez 2 min. Za każdym razem eksperyment RT‑qPCR powtarzano więcej niż dwa razy. W tym celu jako kontrolę wewnętrzną zastosowano GAPDH. Względną ekspresję genu ER/ER transfektantów w stosunku do komórek kontrolnych obliczono: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

Ekspresję białek ER i ER wykryto za pomocą analizy Western blot jako opisanej metody z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, komórki MCF-7 hodowano w 6-studzienkowych płytkach przy 2,5 x 105 komórek na studzienkę i traktowano GC w końcowym stężeniu odpowiednio 1,75, 17,5 i 175 µg/ml przez 48 godzin. Po inkubacji ekstrakty z całych komórek przygotowano w buforze RIPA zawierającym 1 mM PMSF. Białka w ekstraktach z całych komórek rozdzielono metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z 12% dodecylosiarczanem sodu, a następnie przeniesiono na membrany z difluorku winylidenu. Membranę zablokowano 5% (wag./obj.) odtłuszczonym mlekiem rozpuszczonym w buforze TBST i inkubowano kolejno z pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami. Zaobserwowano związane przeciwciała.

Analiza statystyczna

Wyniki wyrażono jako średnie i odchylenia standardowe, a istotność statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta z oprogramowaniem SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

WYNIKI

Po 24 godzinach leczenia E2 proliferacja komórek MCF‑7 była wyraźnie zwiększona [ryc. 1a]. 10 nM roztworu E2 może oczywiście stymulować wzrost komórek (123,89 procent). Jednak wraz ze wzrostem stężenia E2 zdolność proliferacji komórek słabła. Stąd 10 nM było optymalnym stężeniem E2 w tym eksperymencie.

Grupa GCs w stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/mg mogła nasilać proliferację linii komórkowych MCF-7 w sposób zależny od czasu i dawki oraz wykazywała znaczącą różnicę w porównaniu z grupą ujemną [Rysunek 1b]. W porównaniu z grupą negatywną, grupa E2 wykazywała wyraźną proliferację (120,06 procent).

Grupa leków skojarzonych (CMG) (fulwestrant z E2 lub GC) w podłożu CDT‑FBS inkubowano z komórkami MCF‑4. Po 72 godzinach inkubacji CMG może prowadzić do nachylenia PR w porównaniu z indywidualną grupą leków (IMG) (P < 0,01)="" [rysunek="">

Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że ​​GC mogą nieznacznie zwiększyć wartość PI, co sugeruje, że GC mogą przenosić komórki fazy G{{0}}/G1 do fazy S i G2/M [Rysunek 2 i Tabela 1] i promować DNA komórki synteza. Wynik wskazujący, że mechanizm GCs na MCF‑7 był podobny do mechanizmu E2. W CMG (fulwestrant z GC) wartość PI komórki PI nieznacznie spadła do wartości IMG (P <>

Analiza RT‑PCR wykazała, że ​​ekspresja mRNA ER i ER była zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną (P < 0 0,01) w sposób zależny od dawki po leczeniu różnymi stężeniami GC przez 48 godzin [Rysunek 3a i b].

Wynik Western blot wskazujący, że po traktowaniu różnymi stężeniami GC przez 48 godzin, zawartość białek ER i ER w MCF-7 wzrastała wraz z GC wzrastała w sposób zależny od dawki [Rysunek 3c-e]

WNIOSEK

W tym badaniu wpływ GCs na proliferację i cykl komórkowy MCF‑7 oceniano odpowiednio metodą MTT i cytometrii przepływowej. GCs mogą zwiększać proliferację komórek MCF-7 w stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/ml po inkubacji przez 72 godziny. Jednak wzrost ten ulega spowolnieniu, gdy CC i fulwestrant są stosowane razem. GC mogą zwiększać wartość PI komórek MCF‑7, zmniejszać komórkę fazy G1 i zwiększać komórkę faz S i G2.

Fulwestrant jest specyficznym antagonistą ER, który blokuje jądrową lokalizację ER poprzez upośledzenie dimeryzacji receptora i zależnego od energii transportu jądrowego.[17] W tych badaniach wniosek potwierdził, że fulwestrant może osłabiać proliferację GC na komórkach MCF‑7 i może wpływać na transformację cyklu komórkowego. W związku z tym badanie to wykazało aktywność estrogenową GC, a także ER jest celem GC. W eksperymencie RT‑PCR i western blot ekspresja mRNA i białek ER i ER w komórkach MCF‑7 wzrastała wraz ze wzrostem stężenia GCs. W związku z tym GC mogą odgrywać rolę w aktywności estrogenowej zgodnie z podwyższonym poziomem mRNA i białek ER i ER.