Część 1: Wpływ izorhamnetyny na cukrzycę i jej powikłania: przegląd badań in vitro i in vivo oraz analiza transkryptomu post hoc zaangażowanego szlaku molekularnego

Po więcej informacji. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakcyjny: Cukrzycamellitus, zwłaszcza typ 2 (T2DM), jest głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. DM charakteryzuje się wysokimi poziomami glikemii i insulinemii z powodu upośledzonego wydzielania insuliny i wrażliwości komórek na insulinę, znanej jako insulinooporność. T2DM powoduje liczne i ciężkie powikłania, takie jak nefropatia, neuropatia i retinopatia, powodując oksydacyjne uszkodzenie komórek w różnych tkankach wewnętrznych, zwłaszcza w trzustce, sercu, tkance tłuszczowej, wątrobie i nerkach. Ekstrakty roślinne i ich bioaktywne fitochemikalia zyskują zainteresowanie jako nowe terapeutyczne i zapobiegawcze alternatywy dla T2DM i związanych z nim powikłań. W związku z tym, isorhamnetin, roślinaflawonoid, od dawna badano jego potencjalne działanie przeciwcukrzycowe. W niniejszym przeglądzie opisano jego wpływ na zmniejszenie zaburzeń związanych z cukrzycą poprzez obniżenie poziomu glukozy, poprawę stanu oksydacyjnego, łagodzenie stanu zapalnego oraz modulację metabolizmu lipidów i różnicowania adipocytów poprzez regulację zaangażowanych szlaków sygnałowych zgłaszanych w badaniach in vitro i in vivo. Dodatkowo włączamy analizę post hoc transkryptomu całego genomu aktywności biologicznej izoramnetyny przy użyciu narzędzia opartego na komórkach macierzystych.

Słowa kluczowe: izorhamnetyna; kwercetyna; czynności biologiczne; cukrzyca; szlaki molekularne; mikromacierz

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej kontaktów

1. Wstęp

Rośliny były stosowane jako tradycyjne leki na prawie wszystkich kontynentach świata od czasów starożytnych. Badania naukowe nad przyczynami ich zastosowań leczniczych doprowadziły do ​​zbadania molekuł bioaktywnych. Rośliny ekstremofilne, które rosną w ekstremalnych warunkach środowiskowych, są uważane za dobre potencjalne źródło interesujących cząsteczek bioaktywnych. W rzeczywistości te ograniczenia środowiskowe są przyczyną dysfunkcjonalnego metabolizmu tlenu, który prowadzi do stresu oksydacyjnego poprzez zwiększenie reaktywnych form tlenu (ROS)[1,2]. Niektóre rośliny, takie jak halofity, mają potężnąprzeciwutleniaczsystem do eliminacji tych szkodliwych związków. Wśród molekuł bioaktywnych będących przedmiotem zainteresowania znajdują się związki fenolowe. W kilku badaniach wyceniono rośliny bogate w polifenole z lub bez restrykcyjnych warunków w laboratorium [3-10]. Ekstraktom bogatym w polifenole przypisuje się kilka efektów biologicznych, takich jak działanie przeciwzapalne i przeciwnowotworowe [11-13]. Inne badania wykazały działanie przeciwutleniające, przeciwdrobnoustrojowe [8,14-16], a także przeciw otyłości, przeciwcukrzycowe i przeciwwątrobowe [17-19] działanie izorhamnetyny. Wśród tych polifenoli,flawonoidysą rozróżniane. Ta grupa obejmuje kilka podgrup, takich jak flawonole. Izorhamnetyna jest jednym z głównych związków flawonoli. Izorhamnetyna to monometoksy-flawon lub O-metylowany flawonol z klasy flawonoidów. To jestkwercetynaw którym grupa metoksy zastępuje grupę hydroksy w pozycji 3'. Niektóre pochodne izoramnetyny są obecne w przyrodzie, takie jak 3-O- -d-glukopiranozyd izoramnetyny, 3-O-neohesperydozyd izoramnetyny i 3-O-rutynozyd isorhamnetyny z Calendula officinalis L [20]. Izorhamnetyna wykazuje znaczące właściwości biologiczne, takie jak działanie przeciwutleniające [21], przeciwnowotworowe [22], przeciwdrobnoustrojowe [23], przeciwwirusowe [24], przeciwzapalne i przeciwcukrzycowe [21,25-33].

W niniejszym przeglądzie w pierwszej kolejności skupiono się na pochodzeniu, budowie chemicznej, metodach izolacji i ekstrakcji, a także fitochemicznym aspekcie izoramnetyny. Następnie w drugiej części skupimy się na opisie potencjalnego działania przeciwcukrzycowego tego flawonolu poprzez zmniejszenie zaburzeń związanych z cukrzycą poprzez obniżenie poziomu glukozy, poprawę stanu oksydacyjnego, łagodzenie stanu zapalnego oraz modulację metabolizmu lipidów i różnicowania adipocytów. Na koniec przeprowadziliśmy wtórną analizę naszych wcześniej opublikowanych danych z mikromacierzy całego genomu, aby zbadać związane z cukrzycą bioaktywności izoramnetyny w narzędziu opartym na komórkach macierzystych. Naszym celem jest również podkreślenie wpływu tej cząsteczki na regulację zaangażowanych szlaków sygnałowych poprzez przedstawienie badań in vitro i in vivo stosowanych w tej dziedzinie badań. W tym przeglądzie przedstawiliśmy charakterystykę działania przeciwcukrzycowego izoramnetyny w porównaniu zkwercetynaktóry jest uważany za metabolit izoramnetyny i ważny punkt odniesienia w naturalnym leczeniu cukrzycy.

2. Ogólny przegląd cząsteczek bioaktywnych w poszczególnych polifenolach i flawonoidach

2.1. Stres oksydacyjny jako źródło bioaktywnych cząsteczek w roślinach

Kilka roślin może być narażonych na różne warunki środowiskowe (zasolenie, susza, promienie UV, metale ciężkie, ekstremalne temperatury, niedobór składników odżywczych, zanieczyszczenie powietrza i ataki patogenów). Te ograniczenia są przyczyną dysfunkcji metabolizmu tlenu, które generują stres oksydacyjny poprzez zwiększenie reaktywnych form tlenu (ROS). Cząsteczka tlenu (O2) odgrywa ważną rolę w organizmach fotosyntetycznych. Pierwotnie w roślinach wyższych i algach wymiana gazowa z udziałem elektronów zachodzi w chloroplastach poprzez wychwytywanie dwutlenku węgla w ciągu dnia i wytwarzanie tlenu. Ta wymiana gazowa obejmuje elektrony. Rzeczywiście, w przypadku poważnych ograniczeń środowiskowych duża część tlenu nie jest redukowana i może w ten sposób generować ROS w niektórych organellach z komórek roślinnych [1,2] z powodu braku równowagi w prawidłowym funkcjonowaniu chloroplastów i przenoszeniu elektronów [ 1]. Ponadto, pod wpływem wspomnianych powyżej ograniczeń środowiskowych, wytwarzanych jest wiele ROS, takich jak rodnik hydroksylowy (OH), anionorodnik ponadtlenkowy (O,-), rodniki alkoksylowe i nadtlenkowe (odpowiednio RO: i RO2), nadtlenek wodoru (H2O2, ), rodnik podchlorynowy (-OCl), tlen singletowy (O2), rodnik tlenku azotu (NO) i inne nadtlenki lipidowe (takie jak dialdehyd malonowy i 4-hydroksynonenal)[2,34,35]. Niekiedy ROS mogą odgrywać rolę w sygnalizacji komórkowej w fizjologicznym zachowaniu roślin, na przykład w procesie wzrostu i rozwoju nasion, rozwoju tkanek oraz przechodzenia od proliferacji komórkowej do wydłużania komórek we wcześniejszych etapach różnicowania [36]. . Na wysokim poziomie cząsteczki te powodują uszkodzenia molekularne, takie jak peroksydacja lipidów błon, zmiany białek i DNA oraz śmierć komórki [1,35,37]. Niektóre rośliny, takie jak halofity, mają zdolność dobrego przystosowania się do tych warunków dzięki silnemu systemowi przeciwutleniaczy. Wiadomo, że halofity są źródłem wtórnych metabolitów, takich jak polifenole [3-10]. Autorzy ci pokazują, że w ciężkich warunkach syntetyzowane są polifenole, które odgrywają ważną rolę w ochronie przed uszkodzeniami oksydacyjnymi wywołanymi stresem. Biosynteza, zawartość i aktywność tych związków fenolowych jest funkcją kilku parametrów zewnętrznych (światło, temperatura, zasolenie i suchość) i wewnętrznych (genotyp, narząd, etap rozwoju) wpływających na ich zawartość i rozmieszczenie w roślinach [ 8,38,39]. Na przykład u Pyracantha coccinea niektóre flawonoidy, takie jak flawanony, flawony i flawonole, są obecne w pędach w fazie wegetatywnej, a w korzeniach wyłącznie w fazie rozrodczej 40]. Z drugiej strony kilku autorów wykazało, że te związki fenolowe mają inne właściwości biologiczne, takie jak działanie przeciwzapalne i przeciwnowotworowe [11-13]. Inne badania wykazały działanie przeciwutleniające, przeciwdrobnoustrojowe [8,14-16] oraz przeciwcukrzycowe [18,41,42] ekstraktów fenolowych.

2.2. Klasyfikacja naturalnych przeciwutleniaczy

Układ przeciwutleniaczy można podzielić zgodnie z charakterem tych składników na związki enzymatyczne lub nieenzymatyczne. Pierwsze obejmują dysmutazę ponadtlenkową (SOD), katalazę (CAT), peroksydazę askorbinianową i reduktazę glutationową [1,3542-44]. Geny związane z tymi enzymami ujawniły ich znaczenie podczas pożniwnego fizjologicznego niszczenia korzeni spichrzowych oraz w odpowiedzi na stres osmotyczny i zakażenie kwasem abscysynowym oraz zakażenie Xanthomonas axonopodis [44]. Druga grupa to głównie związki fenolowe, karotenoidy, witaminy i osmolity [1]. Związki fenolowe charakteryzują się obecnością jednego lub więcej pierścieni benzenowych i różnią się złożonością cząsteczki podstawowej, liczbą i lokalizacją grupy hydroksylowej oraz stopniem polimeryzacji. Związki te są metabolitami wtórnymi, które dzielą się na trzy szerokie grupy: kwasy fenolowe (pochodne kwasów benzoesowego i cynamonowego), flawonoidy (flawonole, flawonole, flawanony, flawony, antocyjany) oraz garbniki (hydrolizowalne taniny i proantocyjanidyny). Oprócz tych cząsteczek wyróżnia się również stylbeny, lignany i kumaryny [45].

2.3. Pochodzenie i struktura biochemiczna flawonoidów, w szczególności Izorhamnetyny

Związki fenolowe są metabolitami wtórnymi występującymi w roślinach. Związki te mają pierścień aromatyczny z jedną lub większą liczbą grup hydroksylowych (OH) i zawierają cząsteczki od prostych kwasów fenolowych do związków spolimeryzowanych, takich jak garbniki. Synteza związków fenolowych to złożony proces, który przebiega w kilku etapach. Związki fenolowe są bioaktywnymi cząsteczkami o dwóch ścieżkach pochodzenia: z jednej strony kwas szikimowy, az drugiej cząsteczki fenylopropanoidu. Biosynteza flawonoidów, takich jak izoramnetyna, opiera się na tych szlakach. W rzeczywistości, z jednej strony, szikimat daje podstawowy szkielet polifenoli, które mają jeden lub więcej pierścieni benzenowych (C6) pełniących jedną lub więcej funkcji hydroksylowych. Z drugiej strony zachodzi synteza zasady C6-C3 utworzonej przez kondensację fenyloalaniny do kwasu cynamonowego (Rysunek 1)[46].

Dokładniej, kwas szikimowy jest podstawą kilku reakcji, reprezentujących szkielet aminokwasów aromatycznych, które są inicjatorami związków fenolowych. Pierwszy etap składa się z połączenia dwóch cząsteczek: fosfoenolopirogronianu i erytrozy 4-fosforanu, które po czterech reakcjach prowadzą do powstania pierwszego szkieletu fenoli: szikimatu lub kwasu szikimowego (CHOOs). To później przedstawia pierwszy pierścień, który charakteryzuje fenole z dwiema grupami hydroksylowymi. Szikimat podlega sześciu reakcjom, które kończą się pierwszym aminokwasem: fenyloalaniną. Dzięki dwóm kluczowym enzymom, amonoliazie fenyloalaniny (PAL) i hydroksylazie cynamonowej-4-(C4H), fenyloalanina kolejno tworzy cynamonian i p-kumaran. Na tym etapie poziom aktywności PAL może ilościowo regulować akumulację związki fenolowe. Cząsteczka p-kumaranu jest źródłem pochodnych kumaryny. Szlak syntezy cząsteczek fenylopropanoidu charakteryzuje się obecnością kluczowego enzymu zwanego 4-ligazą kumaranową CoA (4CL), który katalizuje w obecności tiolowej funkcji koenzymu A(CoA) p-kumar kwas w 4-kumaroil CoA(C30Ha2N-O18P, S). Aromatyczny pierścień A flawonoidów pochodzi z kondensacji trzech cząsteczek malonylo-CoA (-C6).

Następnie 4-kumaroil CoA wytworzył chalkon naringeniny, wyjaśniając związek między aromatycznym pierścieniem B a pierścieniem 3C chalkonu (C6-C3-). Chalkon jest kluczowym elementem w tym temacie, ponieważ jest prekursorem wszystkich flawonoidów opartych na 15-węglowym szkielecie składającym się z dwóch pierścieni benzenowych. Następnie chalkon jest przekształcany w naringeninę (zwaną również flawanonem lub trihydroksyflawonem) w wyniku działania izomerazy chalkonowej (CHI). Z jednej strony, flawony, takie jak apigenina, akacetyna, chryzyna lub luteolina są syntetyzowane z naringeniny w obecności flawonu syntaza (FNS). Z drugiej strony różne flawonole i związki kwasu bursztynowego są wytwarzane z naringeniny w obecności dwóch enzymów; dioksygenaza flawanonowa 3- (F3D) i syntaza flawonolu (FS). Oprócz pochodnych flawonolu powstają również inne związki, takie jak kaempferol, mirycetyna i kwercetyna. Poprzez przeniesienie grupy metylowej z S-adenozylo-L-metioniny powstaje izoramnetyna w obecności 3'-O-metylotransferazy flawonowej (FMT) [47,48]. Następnie izoramnetyna jest monometoksy-flawonem lub O-metylowanym flawonolem z klasy flawonoidów. Jest to kwercetyna (prekursor), w której grupa hydroksylowa w pozycji 3' jest zastąpiona grupą metoksylową. Niektóre pochodne izoramnetyny są obecne w przyrodzie, takie jak 3-O- -d-glukopiranozyd izoramnetyny, 3-O-neohesperydozyd izoramnetyny i 3-O-rutynozyd izoramnetyny z Calendula officinalis L [20].

W rzeczywistości flawonoidy są uważane za jedną z najważniejszych grup rodziny polifenoli. Mają strukturę opartą na typie difenylopropanu z dwoma pierścieniami benzenowymi (pierścień A i B, patrz rysunek 2) połączonymi łańcuchem trójwęglowym, który tworzy zamknięty pierścień piranowy (pierścień C). Dlatego ich struktura jest określana jako C6-C3-C6. Pozycje O-glikozylacji to C7 we flawonach, izoflawonach, flawanonach i flawonolach oraz C3 we flawonolach i antocyjanidynach. Pozycje C-glikozylacji to C6 i C8 we flawonach [49]. Ponadto znaczenie antyoksydacyjnej roli związków fenolowych związane jest ze stopniem hydroksylacji cząsteczki. Flawonoidy obejmują izoflawony, flawony, flawanony oraz ich glikozydy i flawonole jako izoramnetynę, zwaną również 3'-metoksykwercetyną i 3-metylokwercetyną [50]. U roślin enzym, glikozylotransferazy zależne od UDP, jest odpowiedzialny za postać glikozydową izoramnetyny (izoramnetyna 3-O-glukozyd). Enzym ten wykorzystuje cukry nukleotydodifosforanowe, zwykle cukry difosforanu urydyny (UDP), do przeniesienia grupy metylowej do cyklu i powiązania funkcji glikozydowej z izoramnetyną [51].

2.4. Izolacja i analiza Ilzorhamnetyny pochodzącej z roślin leczniczych

Dystrybucja izoramnetyny w roślinach leczniczych jest bardzo szeroka, a metody ekstrakcji i analizy zróżnicowane. Szczególnie pożądane są pochodne izoramnetyny. Grupy hydroksylowe i metylowe pomagają w ich charakteryzacji. Do ekstrakcji izoramnetyny stosuje się niektóre metody, m.in. oparte na frakcjonowaniu, przy użyciu metod chemometrycznych, ekstrakcji enzymami i płynem w stanie nadkrytycznym (SFE-CO2). Po pierwsze, frakcjonowanie można zastosować w celu uproszczenia ekstrakcji poprzez usunięcie wszystkich pigmentów oleistych i lipofilowych z próbek zawierających lipidy. Odtłuszczona próbka jest również poddawana działaniu ultradźwięków przed maceracją w mieszaninie metanolu i wody. Chromatografia może być wówczas wykorzystana do analizy związków fenolowych, zwłaszcza flawonoidów [49]. W przypadku tych ostatnich związków stosuje się LC-MS i często stosuje się zarówno jonizację elektrorozpylania (ESI), jak i jonizację chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym, a najlepszą czułość dla flawonoidów uzyskuje się na ogół w trybie jonów ujemnych [49]. Oceniono na przykład fitochemię frakcji roślin Calligonum Azel Maire, zebranych z pustyni tunezyjskiej, a do identyfikacji fenoli wśród flawonów zastosowano ultrawysokosprawną chromatografię cieczową połączoną z poczwórną spektrometrią masową UHPLC-ESI-QTOF oraz flawanole, które były najliczniej zidentyfikowanymi związkami fenolowymi [52]. Dokładniej, przy użyciu technologii LC/ESI-MS/MS potwierdzono obecność glikozydu izoramnetyny i glukozyloramnozydu izoramnetyny jako głównych związków w liściach jadalnego halofitu Mesembryanthemum edule [3]. Po tej pracy poszli inni, którzy wykorzystali LC-ESI-TOF-MS do scharakteryzowania wielu polifenoli; wśród nich zidentyfikowano flawonoidy z nadziemnych części pełnego stadium kwitnienia halofitów, takich jak Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum[13] i Salsola kali[8]. Podobnie jak w poprzednich pracach, przeprowadzono profilowanie LC-ESI-TOF-MS i GC-MS roślin ziołowych Artemisia w celu identyfikacji związków fenolowych, takich jak flawony, flawonole i alkaloidy flawonoidowe[7]. Kolejną pracę przeprowadzono na Pancratium maritimum, a analiza metodą HPLC-DAD-ESI/MS wykazała obecność flawonoidów, w tym flawonolu jako izorhamnetyny z ich koniugatami pentatlenku i heksozydu, takimi jak di-heksozyd izoramnetyny [53].

Jako związek nietłuszczowy, flawonole można wyizolować za pomocą heksanu. Następnie można zastosować rozpuszczalnik polarny, taki jak etanol. Badanie Limoniastrum guyonianum z wykorzystaniem HPLC wykazało obecność wielu fenoli, w tym izoramnetyny-3-O-rutynozydu [54].

Z dala od ekstraktów fenolowych związki fenolowe znajdują się również w olejach, takich jak oliwa z oliwek [55]. Związki te mają zdolność ochrony olejów przed utlenianiem oraz poprawiają wartość odżywczą oleju. Izorhamnetyna, jako związek fenolowy, została również wykryta w ekstrakcie olejowym z nasion czarnuszki tunezyjskiej (Nigella sativa L.) otrzymanych z zielonym rozpuszczalnikiem, takim jak 2-metylotetrahydrofuran (MeTHF) jako alternatywa dla ropy naftowej lub heksanu rozpuszczalnika na bazie oleju do ekstrakcji związków fenolowych wzbogaconych w olej [10]. Obecność izoramnetyny potwierdzono analizą HPLC. Analizy przy użyciu chromatografii cieczowej z detektorem diodowym (LC-DAD) ujawniły dużą ilość izoramnetyny w zakresie od 6,3 do 6,6 µg/g oleju） po ekstrakcji oleju z czarnuszki za pomocą odpowiednio MeTHF i heksanu. Ponadto, stosując jądrowy rezonans magnetyczny H (HNMR) i jądrowy rezonans magnetyczny C (CNMR), niektóre glikozydy flawonolu, takie jak kaempferol-3-O-rutynozyd (nikotyfloryna) i izoramnetyna-3-O-rutynozyd (narcyzm) zostały scharakteryzowane na podstawie nadziemnych części Peucedanum aucheri Boiss zebranych w mieście Marivan w prowincji Kurdystan w Iranie [56]. Metoda NMR wykrywa właściwość polegającą na oddziaływaniu pewnych jąder atomowych związku z polem magnetycznym. Ta właściwość, polegająca na wytwarzaniu rezonansu magnetycznego o określonej częstotliwości, dostarcza informacji o budowie cząsteczki. Po drugie, wybiera się modele matematyczne do oceny skuteczności ekstrakcji flawonolu, zwłaszcza w celu zrozumienia najlepszego sposobu otrzymywania izoramnetyny-3-O-rutynozydu [20]. Przeprowadzono wielowymiarową analizę czynnikową z wykorzystaniem kwiatów Calendula officinalis. Przeanalizowano modele liniowe, kwadratowe, w pełni sześcienne i specjalne modele sześcienne. Ostatnia pełna kubatura była najbardziej odpowiednia, pozwalając na większą wydajność ekstrakcji izoramnetyny-3-O-rutynozydu o 60 procent . W tym badaniu enzymy Rapides Maxi Fruit i Viscozyme zostały wykorzystane pod pewnymi ważnymi czynnikami wpływającymi na aktywność enzymu w warunkach nadkrytycznych CO2, takich jak ciśnienie, temperatura, pH, czas i wodny roztwór etanolu. Ostatecznie do ekstrakcji związków fenolowych, takich jak flawonole, zastosowano metodę ekstrakcji płynem w stanie nadkrytycznym. Wiele lat temu po raz pierwszy zastosowano procedurę ekstrakcji płynem nadkrytycznym na korze Eucalyptus globulus przy użyciu czystego i modyfikowanego CO2 z wodą, octanem etylu i etanolem [57]. Autorzy wykazali, że nadkrytyczny CO2 w połączeniu z etanolem może wyekstrahować znaczne ilości związków fenolowych, w tym izoramnetyny. Analiza ilościowa HPLC-MS określiła pewne flawonole, takie jak heksozyd izoramnetyny (0,26 gg-I ekstraktu) i prostą izoramnetynę (14,29 mg:gI ekstraktu). Jako współrozpuszczalnik zastosowano etanol. Oznaczenie ilościowe przeprowadzono za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej wyposażonej w detektor z matrycą fotodiodową. Izorhamnetyna 3-O-glukozyloramnozyd, izoramnetyna 3-O-glukozyloramnozylopentanolan, izoramnetyna 3-O-glukozyloramnozyd i izoramnetyna 3-O-glukozyl -pentoxide były najliczniejszymi flawonolami wyekstrahowanymi z ekstraktów nadkrytycznych O. ficus-indica. Jak wspomniano wcześniej, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa lub HPLC jest powszechnie stosowaną metodą analizy związków fenolowych. W soku jabłkowym i gruszkowym wykryto 3-O-glukozyd izoramnetyny. W rzeczywistości oddzielenie glikozydów flawonolu w ekstrakcie jabłkowym „Brettacher” za pomocą HPLC i spektrometrii masowej ujawniło obecność dwóch form glikozydów, takich jak izorhamnetyna 3-O-glukoza i izoramnetyna 3-O-galaktozyd [ 58].