Piceatannol promuje wątrobową i nerkową ścieżkę AMPK/SIRT1/PGC-1 mitochondrialną u szczurów narażonych na działanie rezerpiny lub promieniowanie gamma

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakcyjny

Ekspozycja człowieka na radioterapeutyczne dawki promieniowania gamma może powodować późne skutki, które negatywnie wpływają na jakość życia pacjentów z rakiem, perspektywy pracy i ogólny stan zdrowia. Badanie to przeprowadzono w celu zbadania roli Piceatannolu (PIC) w procesie sygnalizacji „biogenezy mitochondrialnej” jako możliwego zarządzania zaburzeniami wywołanymi w modelu (modelach) zwierzęcych zestresowanych przez promieniowanie gamma (IR) lub podawanie rezerpiny ( OZE); jako inhibitor mitochondrialnego kompleksu I. PIC (10 mg/kg BW/dzień; doustnie) podawano szczurom przez 7 dni, po ekspozycji na ostrą dawkę promieniowania (6 Gy) lub po pojedynczym wstrzyknięciu rezerpiny (1 g/kg BW; sc). W porównaniu z rezerpiną lub promieniowaniem, PIC jest osłabionywątrobianyoraznerkowy utleniacz mitochondrialnystres rozumiany jako istotne zmniejszenie zawartości nadtlenków lipidów i NO przy istotnej indukcji aktywności SOD, CAT, GSH-PX i GR. PIC znacząco złagodził również wzrost markerów stanu zapalnego, TNF- i IL-6 oraz markerów apoptozy, cytochromu ci kaspazy-3. Zmniejszenie stresu oksydacyjnego, stanu zapalnego i odpowiedzi apoptotycznych wiązało się ze znaczną poprawą biogenezy mitochondriów wykazaną przez zwiększoną ekspresję i zawartość białek w tkankach szlaku sygnałowego SIRT1/p38-AMPK, PGC-1. Wyniki są poparte znaczącą poprawą funkcji mitochondriów, potwierdzoną wyższym poziomem zawartości ATP i aktywności kompleksu I, poza poprawąwątrobianyorazfunkcje nerek. Dodatkowo badania histopatologicznewątrobianyoraztkanki nerekwykazali, że PIC moduluje architekturę tkanki po uszkodzeniu tkanek wywołanym przez rezerpinę lub promieniowanie gamma. Piceatannol poprawia funkcje mitochondriów poprzez regulację nierównowagi oksydacyjnej/przeciwutleniającej, reakcji zapalnych i apoptotycznych, co sugeruje, że może być stosowany jako terapia adjuwantowa w protokołach radioterapeutycznych w celu złagodzeniawątrobianyorazurazy nerek.

Słowa kluczowe:promieniowanie gamma, zaburzenia mitochondriów, piceatannol, rezerpina, wątroba, nerki

costanche na czynność nerek

WstępRadioterapia lub radioterapia to zastosowanie promieniowania jonizującego do niszczenia komórek nowotworowych i kontrolowania wybranych przerzutów. Zdecydowana większość pacjentów z rakiem przechodzi radioterapię w ramach leczenia raka, w tym raka piersi, prostaty, szyjki macicy, głowy i szyi, płuc i mózgu, a także mięsaki.1 Skutki uboczne wynikają z uszkodzenia zdrowych komórek i tkanek w pobliżu obszaru zabiegowego. Terapeutyczne napromienianie jamy brzusznej w leczeniu raka jelita wiąże się zwykle z wyższymi wskaźnikami niespecyficznego bólu brzucha niż obserwowane u pacjentów nie napromienianych po latach.2 Goldberg i Lehnert3 stwierdzili, że unikanie uszkodzeń tkanek nienowotworowych poza obszarem strefa docelowa jest głównym priorytetem w stosowaniu promieniowania jonizującego (IR). Stres oksydacyjny wywołany promieniowaniem obejmuje szereg szkodliwych uszkodzeń komórek, w tym zmiany w ekspresji genów, zwiększone wewnątrzkomórkowe wytwarzanie ROS, uszkodzenia mitochondriów i apoptozę. Podobnie różne doniesienia dotyczyły indukowanych przez ksenobiotykiwątrobianyuszkodzenie różnych rodzajów czynników, w tym stresu oksydacyjnego, reakcji zapalnej i śmierci komórek.

Kompleks mitochondrialny I, największy i najbardziej skomplikowany enzym łańcucha transportu elektronów i punkt wejścia elektronów do łańcucha oddechowego, jest uważany za etap ograniczający tempo ogólnego oddychania, a zatem odgrywa kluczową rolę w metabolizmie energetycznym.4 w swoich podjednostkach prowadzą do wielu dziedzicznych zaburzeń nerwowo-mięśniowych i metabolicznych.5 Udowodniono, że rezerpina hamuje kompleks I, stymuluje reaktywne formy tlenu/azotu związane ze stanem zapalnym i dysfunkcję mitochondriów w różnych ważnych narządach.6

Objętość mitochondriów komórkowych stanowi około 4% -25% całkowitej objętości komórek; w zależności od typu i stanu komórki mitochondria stanowią zatem istotny cel dla napromieniania cytoplazmy.7 Mitochondria odgrywają kluczową rolę w stanie bioenergetycznym tkanek; dlatego jego dysfunkcja jest uważana za główny wyzwalacz chorób.8 Koaktywator receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów-gamma-1 (PGC-1) jest ważnym koaktywatorem transkrypcyjnym, który indukuje zarówno metabolizm mitochondrialny, jak i biogenezę w poziom molekularny. Istnieją doniesienia, że ​​PGC-1 odgrywa kluczową rolę w różnych chorobach, w których po chemio- i radioterapii wykazuje zmienioną ekspresję w wielu narządach.9 Jednak jej rola w wywołanej promieniowaniem dysfunkcji mitochondriów jest nadal niejasna. Aktywacja PGC-1 była kontrolowana przez receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów (PPAR), kinazę białkową aktywowaną przez AMP (AMPK) i Sirtuin1 (SIRT1). W skrócie, fosforylacja AMPK promuje ekspresję i aktywację PGC-1; podobnie, SIRT1 deacetyluje i aktywuje PGC-1, regulując biogenezę mitochondriów.10 Zatem środki aktywujące szlaki sygnałowe PGC-1, w których pośredniczy SIRT1- mogą mieć istotne znaczenie w regulacji przeciwutleniaczy i funkcji mitochondriów stany po toksycznej destrukcji powodowanej przez niektóre egzo lub endotoksyny.11 Przykładem takich środków jest piceatannol (PIC), polifenol należący do grupy stylbenów; analog resweratrolu, naturalnie występujący w roślinach. Na przykład, zarówno czerwone, jak i białe winogrona zawierają PIC w stężeniu odpowiednio 374 i 43 ng/g.11 Ponadto marakuja i jagody Vaccinium są bogate w PIC.12,13 Doniesiono, że PIC posiada szerokie spektrum działania, w tym przeciwcukrzycowe, neuroprotekcyjne, kardioprotekcyjne, przeciwalergiczne i przeciwstarzeniowe.14-16 Chroni również komórki nabłonka barwnikowego siatkówki przed promieniowaniem UV-B.17 W świetle powyższych szczegółowych informacji badanie to miało na celu modulację dysfunkcja mitochondriów za pośrednictwem promieniowania w porównaniu z indukowaną przez klasyczną toksynę mitochondrialną; rezerpina, z naciskiem na potencjalny wpływ piceatannolu na uszkodzenia wątroby i nerek wywołane przez stresory.

Materiały i metody

Materiały:Rezerpinę (kwas 3,4,5-trimetoksybenzoesowy metylu), piceatannol (3,3′,4,5′-tetrahydroksystilben) i wszystkie inne odczynniki chemiczne, rozpuszczalniki i bufory otrzymano od Sigma Aldrich Chemical Co. ( Louis, MO, USA). Zwierzęta: W niniejszym badaniu wykorzystano samce szczurów Wister Albino o wadze 150-180 g; zostały zakupione od jednostki hodowlanej Egipskiego Holdingu Produktów Biologicznych i Szczepionek. Zwierzęta trzymano w standardowych klatkach i miały swobodny dostęp do wody i standardowej diety laboratoryjnej; wszystkie zwierzęta poddano standardowym warunkom temperatury i cyklu światło-ciemność. Niniejsze badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Etyki Badań Naukowych Narodowego Centrum Badań i Technologii Radiacyjnych (NCRRT), Kair, Egipt (sygn.: 195/7/2020), które były zgodne z wytycznymi międzynarodowymi w celu właściwej opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz przestrzegania odpowiednich przepisów prawnych zawartych w Przewodniku opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja PZH nr 85–23, 1996).

Proces napromieniania:Pojedyncza dawka promieniowania gamma 6 Grey (Gy) została dostarczona do całego ciała szczurów w dawce 0,67 Gy/min, została przeprowadzona w NCRRT (Kair, Egipt) przy użyciu kanadyjskiego promieniowania gamma komórka-40 (137Cez). Dawka promieniowania została obliczona przez specjalistów ds. dozymetrii w NCRRT na podstawie mocy dawki emitowanej przez źródło 137 cezu, która wynosiła 0,67 Gy/min, co zostało potwierdzone w rutynowych, planowych badaniach NCRRT dotyczących mapowania dawki i walidacji.

Projekt eksperymentalny:Aby ocenić wpływ PIC na dysfunkcję mitochondrialną wywołaną przez rezerpinę/promieniowanie, szczury losowo przydzielono do sześciu grup eksperymentalnych; każda grupa składała się z ośmiu zwierząt. Grupa kontrolna (C): normalne szczury. Grupa PIC: szczury otrzymywały piceatannol przez siedem kolejnych dni w dawce 10 mg/kg/dzień doustnie. Grupa IR: napromieniowane szczury wystawione na ostrą dawkę 6 Gy. Grupa IR plus PIC: szczury doustnie otrzymały PIC, jak wspomniano powyżej, po napromieniowaniu (6 Gy). grupa OZE; szczury otrzymały pojedynczy zastrzyk rezerpiny; sc, w dawce 1 g/kg. grupa OZE plus PIC; szczury otrzymywały doustnie PIC po wstrzyknięciu rezerpiny (jak wspomniano wcześniej). Dawki PIC, IR i RES podawane w niniejszym badaniu opierały się odpowiednio na wcześniejszych badaniach18-20.

Pobieranie próbek krwi i tkanek:Pod koniec okresu doświadczalnego szczury znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie uretanu (1,2 g/kg mc),21, a następnie uśmiercono przez dekapitację szyjki macicy. Krew zbierano do heparynizowanych i nieheparynizowanych probówek w celu oddzielenia osocza i surowicy; odpowiednio, przez wirowanie przy 3000 × g przez 15 min przy użyciu wirówki Hettich Mikro 22R UP8U'I (Tuttlingen, Niemcy). Wypreparowane próbki tkanek wątroby i nerek zebrano i podzielono na dwie części każda; pierwszy z nich przechowywano w temperaturze -80 stopni do dalszej oceny biomarkerów antyoksydacyjnych, mediatorów prozapalnych, markerów apoptozy i ekspresji genów. Drugą porcję próbek wątroby i nerek utrwalono w 10% obojętnej formalinie i przygotowano do badania histopatologicznego.

Metody

Separacja frakcji mitochondrialnej:Frakcje mitochondrialne wątroby i nerek przygotowano zgodnie z metodą opisaną przez Lampla i wsp.22 W skrócie, tkanki homogenizowano na lodzie przy użyciu homogenizatora z tłuczkiem teflonowym w pożywce zawierającej 250 mM sacharozy, 10 mM Tris-HCl i 1 mM etylenu kwas diaminotetraoctowy (EDTA), pH 7,2 w 4 stopniach. Homogenat wirowano przy 600 x g przez 10 min, a następnie supernatant wirowano przez 5 min przy 15 000 x gw celu uzyskania osadu mitochondrialnego. Zawartość białka we frakcjach mitochondrialnych oznaczono metodą Bradforda.23

Ocena stanu mitochondrialnego stresu oksydacyjnego:Stopień peroksydacji lipidów oceniano za pomocą testu kwasu tiobarbiturowego dla dialdehydu malonowego (MDA), stosowanego zgodnie z opisem Yoshioki i wsp.24 Tlenek azotu (NO) mierzono zgodnie z metodą Mirandy i wsp.25 Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), Poziomy katalazy (CAT), reduktazy glutationowej (GR) i peroksydazy glutationowej (GSH-Px) oznaczono zgodnie z metodami Kakkara i wsp.,26 Bergmeyer i wsp.,27 Goldberg i Spooner,28 oraz Gross i wsp., 29 odpowiednio.

Ocena funkcji mitochondriów:Aktywność I kompleksu łańcucha oddechowego oznaczono spektrofotometrycznie i wyrażono w µmolach zredukowanego lub utlenionego substratu na minutę na miligram białka mitochondrialnego. Aktywność kompleksu I (oksydoreduktazy NADH-ubichinon) oznaczano przy użyciu 100 μmol l−1 decyloubichinonu jako akceptora elektronów i 200 μmol l−1 NADH jako donora, w buforze 10 mmol l−1 KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5, 3,75 mg·mL−1 BSA, 2 mmol·l-1 KCN i 7,5 μmol·l-1 antymycyny A. Następnie zmierzono utlenienie NADH przy 340 nm.30 Stężenie ATP zmierzono za pomocą zestawu (nr kat. S0027, Beyotime Biotechnology, Jiangsu, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta. Ocena czynności wątroby i nerek: Aktywność aminotransferazy asparaginianowej (AST, nr kat. 261 002), aminotransferazy alaninowej (ALT, nr kat. 263 002) i fosfatazy alkalicznej (ALP, nr kat. No. 217 002) określono jako biomarkery funkcji wątroby przy użyciu komercyjnych zestawów (Spectrum Diagnostics Co., Kair, Egipt) zgodnie z protokołem producenta. Podobnie; aby ocenić czynność nerek, poziomy mocznika i kreatyniny w surowicy oznaczono ilościowo przy użyciu zestawów diagnostycznych Bio-Mid (nr kat. URE118100 i CRE106100, Kair, Egipt), odpowiednio zgodnie z instrukcjami producenta.

Ocena markerów stanu zapalnego:W surowicy szczurów prozapalne cytokiny; czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-, nr kat. RTA00) i interleukinę 6 (IL-6, nr kat. SR6000B) badano przy użyciu zestawów zakupionych od R&D Systems, Inc., Minneapolis , USA.

Ocena markerów apoptozy:Poziomy białka cytochromu-c (Cyt-c, nr kat. MITOISO1, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) i kaspazy-3 (CSB, nr kat. -E08857r, Cusabio Biotech, Ltd , Chiny) w homogenatach wątroby i nerek oznaczano ilościowo techniką ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

Molekularna ocena mitochondrialnego PGC- 1 :Zawartość białka PGC-1 w homogenatach wątroby i nerek szczurów określono przy użyciu zestawu ELISA (CSB-EL018425RA, Cusabio Biotech, Ltd., Chiny), wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta.

Wykrywanie ekspresji genów SIRT1 i PGC-1 mRNA w tkankach wątroby i nerek metodą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR):Całkowity RNA został wyekstrahowany zwątrobianyoraztkanka nerekhomogenat przy użyciu RNeasy Purification Reagent (Qiagen, Valencia, CA), zgodnie z instrukcjami producenta. Do oceny jakości wyekstrahowanego RNA zastosowano elektroforezę żelową. cDNA pierwszej nici zsyntetyzowano z 4 ug całkowitego RNA przy użyciu startera Oligo (dT)12-18 i odwrotnej transkryptazy Superscript™ II-RNazy. Tę mieszaninę następnie inkubowano w 42°C przez 1 h, zestaw zakupiono z SuperScript Choice System (Life Technologies, Breda, Holandia). Stosując real-time PCR (RT–PCR) z SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA USA) zgodnie z metodą podaną przez Livak i Schmittgen31, ekspresję genów dla każdej próbki znormalizowano do ekspresji - działają w następujący sposób:

Analiza immunoblottingowa:Homogenaty wątroby i nerek szczura zastosowano do analizy Western blot, jak wcześniej zdefiniowali Mingone i wsp.32, stosując bufor do lizy homogenizacyjnej (Sigma-Aldrich, St. Louis, MD, USA). Do ilościowego oznaczenia całkowitej zawartości białka w lizacie użyto zestawu testowego BCA (Thermo Fisher Scientific), a następnie każdą próbkę załadowano do elektroforezy w 8-procentowym żelu dodecylosiarczan sodu-poliakrylamid (SDS-PAGE) i przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Amersham Bioscience, Piscataway, New Jersey, USA) przy użyciu półsuchego aparatu do transferu (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia). Membrany inkubowano z 5% odtłuszczonym buforem blokującym mleko, zawierającym 10 mmol Tris–HCl (pH 7,4), 150 mmol NaCl i sól fizjologiczną buforowaną Tris z 0,05% Tween- 20 (TBST). w 4 stopniach, przez noc. Błony następnie przemyto TBST i inkubowano z przeciwciałami każdego z przeciwciał anty-SIRT1, anty-p-38 i anty-pp-38 (Thr180/Tyr182) (1:500, Cell Signaling Technologies , Danvers, MA), przez noc na wytrząsarce rolkowej w 4 stopniach. Immunoblotting przeprowadzono z użyciem wskazanego przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie odpowiedniej immunoglobuliny koziej sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) (Amersham Biosciences). Detekcję chemiluminescencji przeprowadzono przy użyciu zestawu do wykrywania Amersham, zgodnie z protokołami producenta, i wystawiono na kliszę rentgenowską. Poziomy białka określono ilościowo przez analizę densytometryczną autoradiogramów przy użyciu skaningowego densytometru laserowego (Biomed Instruments). Wyniki określono po normalizacji ekspresji białka β-aktyny (jako białka porządkowego).

Badanie histopatologiczne

Próbki tkanek wątroby i nerek utrwalano w 10% roztworze formaldehydu i umieszczano w parafinie standardowymi metodami. Pocięte tkanki o grubości 3- μm poddano działaniu barwnika hematoksyliną-eozyną (H&E). Pod mikroskopem świetlnym zbadano wybarwione skrawki.33. Zmiany histopatologiczne hepatocytów i stopień okołowrotnej infiltracji limfocytów zostały zarejestrowane według Ramosa i wsp.34 Wyniki histopatologicznenerkowyzmiany oceniano według Zhanga i wsp.35

Thewątrobianyzmiany oceniano według następujących kryteriów:

Analizy statystyczne

Porównania między różnymi grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Jest to parametryczna analiza statystyczna, która porównuje wariancję między grupami i wewnątrz grup w celu pomiaru różnic między dwiema lub większą liczbą grup. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego SPSS (Statistical Program for Social Science) (SPSS® Chicago, IL, USA) wersja 15.0 oprogramowania. Każda wartość reprezentuje średnią ± odchylenie standardowe zebrane od ośmiu zwierząt w każdej grupie. Różnicę między średnimi uznano za istotną przy P <>

Wyniki

Wpływ PIC na mitochondrialny stres oksydacyjny wątroby i nerek:Jeśli chodzi o efekty OZE i IR nawątrobianystan stresu oksydacyjnego, znaczny wzrost zawartości MDA w wątrobie jest związany z wyraźnym zahamowaniem aktywności mitochondrialnej SOD, CAT, GSH-Px i GR zaobserwowano w grupach RES i IR w porównaniu z grupą kontrolną. Leczenie PIC znacząco osłabiło wzrost zawartości MDA w wątrobie wywołany przez RES i IR i przywróciłowątrobianyaktywności mitochondrialne SOD, CAT, GSH-Px i GR obserwowane w grupach PIC plus RES i PIC plus IR w porównaniu z grupami nieleczonymi RES i IR (Tabela 1).

Jeśli chodzi o wpływ PIC na RES i indukowane IRuszkodzenie nerek,biomarkery nefrotoksyczności; oceniano stężenie mocznika i kreatyniny w surowicy. Wyniki przedstawione w Tabeli 1 wykazały znaczny wzrost stężenia mocznika i kreatyniny w surowicy, któremu towarzyszył wzrost zawartości MDA w nerkach, wraz z zahamowaniemnerkowymitochondrialne aktywności SOD, CAT, GSH-Px i GR w grupach RES i IR w porównaniu z grupą kontrolną. Z drugiej strony, PIC odwrócił te efekty, ponieważ znacząco obniżył poziom mocznika i kreatyniny w surowicy oraz zawartość MDA w nerkach. Co więcej, podanie PIC wywołało istotne zwiększenie aktywności mitochondrialnych mitochondriów SOD, CAT, GSH-Px i GR w grupach PIC plus RES i PIC plus IR w porównaniu z grupami RES i IR (tab. 1).

Wpływ pikeatannolu na markery stanu zapalnego oraz funkcje wątroby i nerek

Aktywność enzymów wątrobowych w surowicy; AST, ALT i ALP przeprowadzono w celu określenia stopnia uszkodzenia wątroby wywołanego podaniem rezerpiny (RES) i ekspozycją na promieniowanie jonizujące (IR). W Tabeli 2 znaczący wzrost aktywności AST, ALT i ALP w surowicy w grupach RES i IR; w porównaniu do kontroli. Z drugiej strony, leczenie szczurów RES i IR za pomocą PIC znacząco poprawiłouszkodzenie wątrobyindukowane przez każdy z toksyn w aktywnościach AST i ALT w surowicy w porównaniu z nietraktowanymi grupami RES i IR (Tabela 2). Jak przedstawiono w Tabeli 2, grupy RES i IR wykazały znaczny wzrost poziomu IL-6 i TNF- w surowicy w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Co godne uwagi, podanie PIC grupom RES i IR znacząco zmniejszyło poziomy IL-6 i TNF w surowicy w grupach PIC plus RES i PIC plus IR, w porównaniu z odpowiednią grupą kontrolną.

Wpływ leczenia PIC na zmiany mitochondrialne wątroby i nerek u szczurów narażonych na RES lub promieniowanie

Aktywność enzymu mitochondrialnego kompleksu I oraz zawartość ATP oceniono jako markery zarówno wątroby, jak ifunkcje mitochondrialne nerek. Każdy z iniekcji rezerpiny i naświetlania

ekspozycja wywołała znaczne zmniejszenie czynności wątroby imitochondrialny nerkowyZawartość ATP i aktywność kompleksu I w porównaniu do grup nieleczonych (Tabela 3). Jednak grupy leczone PIC wykazały znaczny wzrost zarówno aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej (kompleks-1), jak i zawartości ATP.

Wpływ PIC na wątrobowe i nerkowe markery apoptozyDysfunkcja mitochondriów znalazła również odzwierciedlenie w oczywistym statusiewątrobianyoraznerkowyapoptoza komórkowa. Dane przedstawione w tabeli 4 wskazują, że każdy z RES i IR istotnie zwiększał zawartość tkanek wątroby inerkowycytochrom c i kaspaza-3 w porównaniu z grupą kontrolną. Znaczące spadki odnotowano w grupie PIC plus IR (tab. 4). W przypadku grupy PIC plus OZE zaobserwowano częściową, ale statystycznie istotną poprawę w porównaniu z grupą OZE.

Leczenie PIC spowodowało zwiększenie aktywności wątrobowokomórkowych cząsteczek sygnałowych PGC-1 /p38, Jak pokazano na Ryc. 1a do d, każdy z RES i IR indukował głęboką redukcję ekspresji białek w wątrobie inerkowyaktywne p38 (p-p38Thr180/Tyr182), na co wskazuje spadek ekspresji p-p38/t-p38. Towarzyszył temu znaczny spadek czynności wątroby inerkowyEkspresja genu PGC-1 i poziom białka widoczne w grupach RES i IR w porównaniu z grupą kontrolną. Leczenie PIC poprawiło indukowaną przez RES i IR ekspresję zaburzonej ekspresji wątrobowych i nerkowych aktywnych białek p38 i PGC-1 w porównaniu z grupami nietraktowanymi RES i IR; odpowiednio (rysunek 2a–d). Na poziomie molekularnym poziomy ekspresji mRNA i białka SIRT-1 były znacznie obniżone w grupach leczonych RES i IR w porównaniu z grupą kontrolną. Warto zauważyć, że podanie PIC wywołało poprawę czynności wątroby inerkowyEkspresja genu SIRT-1 i poziomy białka w porównaniu z grupami RES lub IR (Rysunek 3a–e).

Dyskusja

Obecne badanie dotyczyło zmian w maszynerii biogenezy mitochondriów wywołanych pojedynczą dawką promieniowania, w porównaniu z tą wytwarzaną przez klasyczną toksynę mitochondrialną; rezerpina, zatrucie poprzez wywołanie stanu stresu oksydacyjnego wraz z późniejszymi zmianami funkcji mitochondrialnych zarówno wątroby, jak i nerek. Poza stresem oksydacyjnym istnieje wiele proponowanych mechanizmów, które mogą powodować uszkodzenia tkanek, takich jak nasilanie reakcji zapalnych, zmiana ekspresji genów i komórkowych szlaków sygnałowych oraz indukcja apoptozy.36

W niniejszym badaniu istotnie wyższe zawartości nadtlenków lipidów i NO w tkankach przy znacznym zahamowaniu aktywności SOD, CAT, GPX i GR wskazywały zarówno na promieniowanie, jak i wywołane rezerpiną toksyczność fizjologiczną w tkankach wątroby i nerek. Takie zakłócenia w statusie sygnalizacji redoks indukowały w konsekwencji dysfunkcję w każdej wątrobie i nerce, co znajduje odzwierciedlenie w obserwowanych zmianach biomarkerów funkcji wątroby; ALT, AST i ALP orazczynność nerek; mocznika w surowicy i kreatyniny w porównaniu z grupą kontrolną. Porównywalne wyniki uzyskano w badaniu Moustafa i wsp.37

Możliwym mechanizmem tych podwyższeń jest wywołane przez RES zakłócenie przepuszczalności błony komórkowej przez hepatocyty, wyciek tych enzymów do surowicy.38 Na tej samej linii, niedawne badanie39 wykazało, że nefrotoksyczność wywołana promieniowaniem była wyzwalana przez depresję ekspresji cykliny D1 za pośrednictwem ROS. wnerkowyjądra i komórki, indukując w ten sposób zmiany w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w konsekwencjiuszkodzenie nerek.

Po podaniu ogólnoustrojowym rezerpina jest dystrybuowana do tkanek w oparciu o ich przepływ krwi i łatwo przenika przez błony komórkowe, a następnie wiąże się ze składnikami błony wewnątrzkomórkowej, szczególnie bogatymi w fosfolipidy, tworząc addukty indukujące niestechiometryczne hamowanie wychwytu monoamin40, co w konsekwencji prowadzi do utleniania. stan stresu z powodu procesów utleniania tych monoamin przez oksydazy monoaminowe.41 Ponadto nagromadzenie nadtlenków lipidów w tkankach wywołuje stan zapalny zakłócający funkcje mitochondriów w wielu narządach, w tym w wątrobie i nerkach.

W obecnej pracy nadprodukcja ROS; wynikające z radiolizy wody tkankowej indukowanej IR i oksydacyjnego uszkodzenia mitochondriów indukowanego przez RES, mogą reagować z makrocząsteczkami i innymi istotnymi celami, indukując wyraźną autolizę w mitochondriach42, co skutkuje apoptozą hepatocytów za pośrednictwem mitochondriów43, co potwierdza znaczny wzrostwątroby i nerekAktywność cytochromu c i kaspazy-3 pokazana w niniejszych wynikach. Ponadto hepatotoksyczność i nefrotoksyczność u szczurów traktowanych RES i IR potwierdzono niniejszym przez wyniki histopatologiczne (Figury 4 i 5).

Zgodnie z powyższym wykazaliśmy w tym badaniu, że rezerpina znacząco obniżyła poziom ATP i aktywność zależnego od bursztynianu kompleksu I, Sirt-1, PGC-1 i p38 MAPK, co wskazuje upośledzona funkcja w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym w wątrobie oraztkanki nerek.Można to przypisać zwiększonej akumulacji lipidów, wywołującej regulację w dół SIRT1, co z kolei zmniejsza ekspresję genów -oksydacji w wątrobie i nerkach.

Kinazy białkowe aktywowane mitogenem (MAPK) są zaangażowane w pętlę aktywacyjną składającą się z ERK-1, ERK-2, JNK i kinazy p38, pętli regulowanej przez mechanizm zależny od środowiska komórkowego przez potencjalnie szkodliwe bodźce stresu abiotycznego.45 Ostatnie badania Park i wsp.46 wykazały, że RES znacząco indukował MAPK, ale hamował fosforylację p38, co zostało zauważone w aktualnych danychtkanki wątroby i nerek.

Zmienione poziomy krążących cytokin mogą być nieinwazyjnymi biomarkerami prognostycznymi dla wywołanej radioterapią i wyników klinicznych u pacjentów z nowotworami.47 Różne badania wykazały, że w stanach zapalnych cytokiny odgrywają kluczową rolę w zmiennych poziomach osi p38/PGC-1. 48 W naszym badaniu RES i IR stymulowały odpowiedź zapalną odzwierciedloną przez wzrost cytokin TNF- i IL-6 przy obniżonych poziomach p38/PGC-1 w porównaniu z odpowiednią kontrolą, co sugeruje udział p38 AMPAK wuszkodzenie wątroby i nerek. Thabet i wsp.49 donieśli, że hamowanie PPAR-/p38 w hepatocytach powodowało zwiększoną aktywację cytokin, co w konsekwencji prowadziło do wzrostu ekspresji chemokiny w celu rekrutacji komórek zapalnych, co prowadzi do apoptozy hepatocytów. proponowane mechanizmy; RES może indukować uszkodzenie hepatocytów poprzez

integracja proliferacji gładkiej retikulum endoplazmatycznego, rybosomów i uszkodzeń mitochondriów.38 PGC-1 odgrywa kluczową rolę w biogenezie mitochondriów w mięśniach szkieletowych50 i wątrobie.51 Jego usunięcie prowadzi do zmniejszenia zawartości mitochondriów.52 Funkcje PGC-1 jako aktywujący czynnik transkrypcyjny i bierze udział w skoordynowanej regulacji genów jądrowych i mitochondrialnych, takich jak jądrowe czynniki oddechowe 1 i 2 oraz mitochondrialny czynnik transkrypcyjny-A.53 W bieżącym badaniu zbadano działanie piceatannolu pod kątem jego regulacyjnego i indukującego wpływu na Sirt -1/PGC-1 uczestniczą w biogenezie mitochondriów, wpływając tym samym na ich integralność i funkcje. Wyniki wykazały, że piceatannol zmniejszał peroksydację lipidów i zawartość NO oraz zwiększał aktywność GSH-PX, GR, SOD i CAT w wątrobie

i nerek. Te efekty działania piceatannolu można przypisać jego podobieństwu strukturalnemu do resweratrolu i pterostilbenu, których podobne efekty opisano w różnych badaniach. Na przykład, doniesiono, że resweratrol i pterostilben wzmacniają status antyoksydacyjny u zwierząt z cukrzycą.54,55 Podobnie, przeciwutleniające działanie pterostilbenu przypisano jego unikalnej strukturze z jedną grupą hydroksylową i dwiema grupami metoksylowymi, które usuwają ROS56; które są zaangażowane w inicjację i patogenezę kilku chorób

Wyniki ujawniły również, że piceatannol był w stanie osłabić reakcje zapalne i apoptotyczne przeciwko toksyczności IR i RES w wątrobie i nerkach. Piceatannol zmniejszał wzrost markerów stanu zapalnego, TNF- i IL-6 oraz markerów apoptozy, cytochromu ci kaspazy-3. Ponadto piceatannol zwiększył ekspresję i zawartość białek w tkankach p-p38, SIRT1, PGC-1 . W tym kontekście stwierdzono, że pterostilben strukturalnie podobny do piceatannolu chroni szczury przed cukrzycowym stresem oksydacyjnym mięśnia sercowego i apoptozą poprzez zwiększoną fosforylację kinazy białkowej aktywowanej przez monofosforan adenozyny (AMPK). AMPK/czynnik jądrowy erytroidalny 2-czynnik związany -2 (Nrf2)/heme-oksygenaza (HO-1),58 oraz mieć właściwości neuroprotekcyjne przeciwko zapaleniu wywołanemu przez amyloid poprzez hamowanie NLRP3/kaspazy-1 szlak inflamasomu w mózgu.59

PGC-1 jest „głównym kluczem” biogenezy mitochondriów, który stymuluje ekspresję mitochondrialnych genów i replikację mitochondrialnego DNA.10 W bieżącym badaniu wyniki wykazały, że leczenie PIC indukuje deacetylację PGC-1 i ekspresję genów docelowych , ze zwiększonym poziomem białka PGC-1, którego szlak aktywacji zależnej od SIRT1-, taki jak analog resweratrolu na aktywację mRNA SIRT1 w nerkach szczurów z nefropatią cukrzycową.53

Zwiększona ekspresja PGC-1 wywołana przez piceatannol; tutaj była związana ze zwiększoną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych. Zgodnie z tą obserwacją Rius-Pérez i wsp.,60 Valera Alberni i Canto59 donieśli, że PGC-1 bierze udział w indukcji enzymów detoksykujących ROS. W związku z tym spekulowaliśmy, że zdolność piceatannolu do tłumienia ROS poprawiła działanie przeciwutleniaczy i zmniejszyła reakcje zapalne i apoptotyczne, może działać poprzez szlak sygnałowy SIRT1/p38-AMPK

U szczurów leczonych PIC po ekspozycji na IR i RES zmniejszeniu markerów stresu oksydacyjnego, zapalnych i apoptotycznych towarzyszyła poprawa biogenezy mitochondriów. Wyższe poziomy zawartości ATP i aktywność kompleksu I wskazują na poprawę funkcji mitochondriów. Modulatorowa rola PIC w uszkodzeniu wątroby i nerek została potwierdzona poprawą funkcji wątroby i nerek oraz badaniami histopatologicznymi. Ze względu na swoją wyjątkową funkcję przeciwutleniającą, piceatannol (PIC) jest korzystnym związkiem. PIC wywodził swoje właściwości przeciwutleniające z podwójnych wiązań etylenowych i fenolowych grup hydroksylowych.61 Li i wsp.62 odkryli, że PIC wykazywał silną aktywność przeciwutleniającą w zmiataniu rodników hydroksylowych, ze względu na cztery fenolowe grupy hydroksylowe w pierścieniu benzenowym. Setoguchi i wsp.63 wykazali, że piceatannol wykazał wyższą stabilność metaboliczną niż resweratrol, ponieważ w ich eksperymencie; krzywa farmakokinetyczna dla piceatannolu była 2,1 razy wyższa niż dla resweratrolu.

Wyniki uzyskane w niniejszym badaniu są zgodne z wcześniejszymi odkryciami, które donosiły, że owoce truskawki są bogatym źródłem fitochemikaliów aktywujących szlak sygnałowy kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMPK), zaangażowany w biogenezę mitochondriów i obronę antyoksydacyjną.64-66 Ponadto Wahdan i wsp.67 wykazali, że PIC w dawce 10 mg/kg był skuteczny w leczeniu uszkodzenia nerek, a uzyskane wyniki potwierdzają również, że leczenie PIC (10 mg/kg masy ciała) szczurów narażonych na toksyczność indukowaną kadmem hamowanie stresu oksydacyjnego poprzez podwyższenie poziomu ekspresji mRNA i białek szlaku Nrf2.18 W tym badaniu przedstawiamy nowy mechanizm ochrony za pośrednictwem PIC, wykazując, że PIC może chronić przed stresem oksydacyjnym wywołanym promieniowaniem gamma, dysfunkcją mitochondriów i apoptozą poprzez zmniejszenie zawartości nadtlenków lipidów w tkankach, NO oraz indukowanie aktywności SOD, CAT, GPX i GR wraz z regulacją SIRT1/p38-AMPK, PGC-1 si droga zgryzania. Jednak nasze badania mają pewne ograniczenia; na przykład ocena przejścia przez przepuszczalność mitochondriów, ocena zawartości kompleksu II i cytokin zapalnych w tkankach, biochemiczna i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) morfologii mitochondriów byłyby parametrami pomocniczymi do bardziej szczegółowego opisu mechanizmów działania PIC.

Wniosek

Można wywnioskować, że piceatannol poprawia biogenezę i funkcje mitochondriów poprzez regulację nierównowagi oksydacyjno-przeciwutleniającej, odpowiedzi zapalnej i apoptotycznej, co sugeruje, że ochronne działanie piceatannolu może być krokiem naprzód w rozwoju terapii adiuwantowej u pacjentów poddawanych radioterapii.