Ekstrakt z łożyska świni zwiększa poziomy NAD w ludzkich keratynocytach naskórka

Najlepsze zioła przeciwstarzeniowe-ziołowe Cistanche

Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy(NAD) jest klasycznym kofaktorem wielu reakcji redoks i występuje we wszystkich żywych komórkach w postaci utlenionej (NAD plus) i zredukowanej (NADH). NAD plus jest również znany jako niezbędny kosubstrat dla enzymów zużywających NAD plus, takich jak sirtuina (SIRT) i polimeraza poli ADP-rybozy (PARP). Ponieważ enzymy te odgrywają kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, w tym w naprawie DNA, metabolizmie mitochondriów i odporności na stres, niezrównoważona homeostaza NAD wpływa na ich kluczowe procesy1. Poziomy NAD w tkankach/narządach spadają wraz z wiekiem, co powoduje niezrównoważoną homeostazę NAD2-6. W związku z tym istnieje obecnie zgoda co do tego, że utrzymywanie poziomów NAD prowadzi do zapobiegania i leczenia starzenia się i chorób związanych z wiekiem7. NAD jest biosyntetyzowany różnymi szlakami, w tym biosyntezą de novo z tryptofanu, szlakiem Preissa-Handlera z kwasu nikotynowego i szlakiem ratunkowym z amidu nikotynowego (NAM)8. U ssaków szlak ratunkowy jest głównym szlakiem utrzymywania komórkowych poziomów NAD9. Na tym szlaku NAM jest przekształcany w mononukleotyd nikotynamidu (NMN) przez fosforybozylotransferazę NAM (NAMPT), a następnie przekształcany w NAD przez adenylotransferazy NMN. Rybozyd nikotynamidu (NR) jest przekształcany w NMN przez kinazy NR, a następnie włączany do szlaku ratunkowego. Wykazano, że pośrednie metabolity NAD, takie jak NMN i NR, podnoszą poziomy NAD w różnych komórkach i tkankach oraz łagodzą choroby związane z wiekiem10,11.

Ekstrakt z łożyska (PE) był szeroko stosowany w medycynie tradycyjnej do gojenia ran. PE jest bogatym źródłem wielu składników bioaktywnych, w tym aminokwasów, kwasów nukleinowych, kwasów tłuszczowych, minerałów, witamin, hormonów, bioaktywnych peptydów, cytokin i czynników wzrostu. Wiadomo, że ma różne działania farmakologiczne, takie jak działanie przeciwzapalne, przeciwutleniające, regeneracyjne i immunomodulujące12. Tak więc podskórne i domięśniowe zastrzyki ludzkiej PE (HPE) były stosowane klinicznie w leczeniu kilku chorób, w tym objawów menopauzy i przewlekłej choroby wątroby13. Ponadto HPE jest stosowany klinicznie jako środek przeciwzmarszczkowy głównie w krajach azjatyckich ze względu na jego wpływ na wzrost komórek i syntezę kolagenu14. Ponieważ stosowanie HPE jest ograniczone do zastosowań medycznych w niektórych krajach, takich jak Japonia, niedawno opracowano wieprzowy PE (PPE) jako alternatywę dla HPE i zastosowano go jako surowiec w zdrowej żywności i kosmetykach. Badanie in vivo z wykorzystaniem mysiego modelu kontaktowego zapalenia skóry wykazało, że stosowane miejscowo środki ochrony indywidualnej mają działanie przeciwzapalne i przeciwutleniające na skórę15. Badania kliniczne wykazały, że miejscowe środki ochrony indywidualnej są korzystne w leczeniu przewlekłych niegojących się ran i zapobieganiu powstawania zmarszczek16,17. Ponadto przeprowadzono randomizowane, podwójnie ślepe, kontrolowane placebo badanie kliniczne z udziałem zdrowych dorosłych kobiet w celu potwierdzenia korzyści dla skóry wynikających z doustnego przyjmowania środków ochrony indywidualnej i wykazano, że stan skóry w grupie przyjmującej środki ochrony indywidualnej uległ znacznej poprawie18. Raporty te potwierdzają koncepcję, że leczenie PPE może złagodzić lub zapobiec starzeniu się skóry.

PE był konwencjonalnie używany jakośrodek przeciwstarzeniowy, a liczne badania kliniczne potwierdziły jego skutecznośćwłaściwości przeciwstarzeniowe. Jednak mechanizm leżący u podstaw przeciwstarzeniowego działania PE pozostaje niejasny. Ten raport wykazał, że PPE zawiera kilka prekursorów NAD, takich jak NMN i NR, i zwiększa wewnątrzkomórkowe poziomy NAD w normalnych ludzkich keratynocytach naskórka (NHEK). Nasze odkrycia dostarczają nowych informacji na temat mechanizmu, dzięki któremu PE wywiera działanie przeciwstarzeniowe poprzez utrzymanie wewnątrzkomórkowej homeostazy NAD.

Wyniki

PPE zwiększa wewnątrzkomórkowe poziomy NAD. Aby zbadać, czy PPE zmienia komórkowe stany NAD, hodowaliśmy NHEK w pożywce uzupełnionej PPE i określiliśmy ilościowo ich wewnątrzkomórkowe poziomy NAD plus i NADH. Wyniki pokazały, że PPE znacznie zwiększyło ilość zarówno NAD plus, jak i NADH w NHEK w sposób zależny od dawki (ryc. 1A). Całkowity poziom NAD (NAD plus plus NADH) w komórkach traktowanych 1 mg/ml PPE był około 1,5 razy wyższy niż w komórkach nietraktowanych (ryc. 1A). Ponadto, w eksperymencie z przebiegiem w czasie, po 4 godzinach leczenia 1 mg/ml PPE (ryc. 1B) zaobserwowano znaczny wzrost poziomów NAD plus, NADH i całkowitego NAD. Test {{10}}(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego bromku (MTT) potwierdził, że {{20} },5–2 mg/ml PPE nie miało wpływu na aktywność metaboliczną komórek, podczas gdy 5 mg/ml PPE lub kontrola pozytywna (0,2% Triton X-100 [TX-100]) wykazywały znaczną toksyczność komórkową (Rys. 1C). Ponieważ NAD był prawie nie wykrywany w samym PPE (dane nie pokazane), efekt PPE wytwarzający NAD nie wydawał się być spowodowany napływem NAD pochodzącego z PPE do NHEK. Zatem wyniki te sugerują, że PPE może zwiększać wewnątrzkomórkowe poziomy NAD. Składniki aktywne ŚOI to małe cząsteczki, a nie białka. Aby określić, czy PPE wzmacnia komórkową biosyntezę NAD poprzez reakcję NAMPT w ścieżce ratunkowej NAD, przeprowadziliśmy test odzyskiwania NAD przy użyciu inhibitora NAMPT FK 866 (ryc. 2A). FK 866 znacznie zmniejszył całkowite poziomy NAD 24 godziny po dodaniu (ryc. 2B).

Co ciekawe, pomimo braku aktywności NAMPT w NHEK, PPE tłumił indukowane przez FK {0}} wyczerpanie NAD w sposób zależny od dawki (ryc. 2B). Wiele doniesień wykazało, że PE zawiera białka, takie jak cytokiny i czynniki wzrostu13,19,20. Dlatego przypuszczaliśmy, że niektóre bioaktywne białka lub NAMPT świni zawarte w PPE mogą zwiększać wewnątrzkomórkową biosyntezę NAD w NHEK. Aby potwierdzić naszą hipotezę, podzieliliśmy PPE na frakcje o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej (HMW, LMW) za pomocą odśrodkowego urządzenia filtrującego (odcięcie: 3 kDa). Ponieważ test odzyskiwania NAD przy użyciu FK{10}} wykazał wpływ PPE na biosyntezę NAD wyraźniej niż w przypadku braku FK{11}} (ryc. 1A i 2B), przystąpiliśmy do identyfikacji aktywnych składników w PPE za pomocą tego testu. Nieoczekiwanie, HMW-PPE wymagało wysokiego stężenia 1 mg/ml do znaczącego przywrócenia poziomów NAD, podczas gdy LMW-PPE wyraźnie poprawiło wywołane przez FK wyczerpanie NAD nawet przy niskim stężeniu 0,25 mg/ml (ryc. 2C i D). Tak więc wyniki te sugerują, że głównymi składnikami aktywnymi w PPE są raczej małe cząsteczki o masie poniżej 3 kDa niż białka, takie jak czynniki wzrostu i cytokiny.

PPE zawiera prekursory NAD, takie jak NMN i NR. Dalej frakcjonowaliśmy LMW-PPE na 12 frakcji przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w układzie faz odwróconych i badaliśmy, która frakcja przyczyniła się do przywrócenia wyczerpania NAD indukowanego przez FK{4}}. Typowy chromatogram HPLC LMW-PPE pokazano na fig. 3A. Test odzyskiwania NAD wykazał, że tylko frakcja 3 wyraźnie zwiększała poziomy NAD w NHEK traktowanych FK{8}} (ryc. 3B). Prekursory NAD, takie jak NMN i NR, podnoszą wewnątrzkomórkowe poziomy NAD bez interwencji NAMPT w różnych liniach komórkowych, w tym w NHEK10,21. Ponieważ LMW-PPE nadal zwiększał zawartość NAD w NHEK, nawet gdy NAMPT był hamowany przez FK 866, postawiliśmy hipotezę, że prekursory NAD zawarte w PPE zwiększają wewnątrzkomórkową produkcję NAD. Aby przetestować tę hipotezę, przeanalizowaliśmy frakcję 3 za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC – MS / MS) w celu wykrycia prekursorów NAD. Wyniki pokazały, że trzy piki jonowe zgodne z NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) i NAM (m/z 123→8{27}}) wykryto we frakcji 3 ( Rys. 3C). Analizy ilościowe wykazały, że stężenie NMN, NR i NAM w całym ŚOI wynosiło odpowiednio 0,22, 17,62 i 0,14 ng/mg (tab. 1). Wyniki te sugerują, że co najmniej trzy prekursory NAD, NMN, NR i NAM, są obecne w PPE i uczestniczą w wewnątrzkomórkowym wzmacnianiu NAD.

Rysunek 2. PPE łagodzi wyczerpywanie się NAD przez FK 866 w NHEK. ( A ) Ścieżka ratunkowa biosyntezy NAD. Te NHEK traktowano wstępnie FK866 przez 30 minut i inkubowano z całym PPE (B), HMW-PPE (C) lub LMW-PPE (D) we wskazanych stężeniach przez 24 godziny. Całkowite poziomy NAD określono stosując zestaw testowy NAD plus/NADH. †P<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Miejscowe podawanie środków ochrony indywidualnej na zrekonstruowany naskórek człowieka zwiększa poziom NAD w tkankach. Głównymi składnikami aktywnymi PPE wzmacniającymi NAD są małe cząsteczki, od których można oczekiwać, że będą miały wyższą wchłanialność przezskórną niż większe białka, takie jak czynniki wzrostu. Dlatego miejscowe stosowanie środków ochrony indywidualnej na skórę wydaje się być odpowiednią opcją zwiększania poziomów NAD w tkankach skóry. Aby zbadać, czy miejscowe podawanie PPE wpływa na poziomy NAD w naskórku poniżej warstwy rogowej naskórka, 3- wymiarowo zrekonstruowany ludzki naskórek (RHE) traktowano PPE po stronie warstwy rogowej naskórka i hodowano w pożywce z obecnością lub nieobecnością FK{2}} (ryc. 4A). Miejscowe stosowanie PPE zwiększyło poziomy NAD odpowiednio o 9,1% (nieistotne) lub 7,3% (znaczące) przy braku lub obecności FK{8}} (ryc. 4B). PPE nie miał wpływu na aktywność metaboliczną komórek przy testach do 10 mg/ml, podczas gdy 1 procent TX-100 znacznie się zmniejszył (ryc. 4C). Te wyniki sugerują, że aktywne składniki środków ochrony indywidualnej mogą infiltrować skórę podrogową i zwiększać poziom NAD w skórze bez powodowania szkodliwych skutków.

Zapytaj o więcej:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950