Ochronne działanie kwasu alfa-liponowego przeciwko 5-zapaleniu błony śluzowej przewodu pokarmowego wywołanemu przez fluorouracyl u szczurów, część 1

Abstrakcyjny: Kwas alfa-liponowy (ALA) jest szeroko stosowany w preparatach multiwitaminowych i produktach przeciwstarzeniowych. Celem tego badania było zbadanie potencjalnych korzyści ochronnych ALA w zapaleniu błony śluzowej przewodu pokarmowego wywołanym 5-fluorouracylem (5-}FU) u szczurów rasy Wistar albinos. Tkanki z żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego wycięto i uzyskano surowice krwi w celu identyfikacji wskaźników biochemicznych, takich jak TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 i TIMP-1. Wykonano również badanie histopatologiczne. Wyniki ujawniły podwyższone w zapaleniu błony śluzowej poziomy TNF-, IL-1, MDA, MMP{14}}, -2, -8 i TIMP-1 zarówno w tkankach, jak i w surowicach a wartości te drastycznie spadły po leczeniu ALA. Zmniejszone aktywności SOD i GPx w grupach z zapaleniem błony śluzowej zostały odwrócone w grupach leczonych ALA. Zgodnie z oceną histopatologiczną uszkodzenia spowodowane zapaleniem błony śluzowej żołądka i jelita cienkiego cofnęły się w grupie leczonej ALA. W związku z tym wdrożenie suplementacji ALA w terapii 5-FU może działać jako interwencja ochronna u chorych na raka z zapaleniem błony śluzowej przewodu pokarmowego. W świetle wyników ALA, przeciwutleniacz pochodzący z żywności o właściwościach plejotropowych, może być skutecznym sposobem leczenia zapalenia błony śluzowej przewodu pokarmowego wywołanego przez 5-FU i zapobiegać stresowi oksydacyjnemu, stanom zapalnym i uszkodzeniom tkanek u pacjentów z rakiem otrzymujących {{ 24}}terapia FU.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniami DNA spowodowanymi przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silną zdolność wychwytywania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA i mają pewien ochronny wpływ na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i może wychwytywać reaktywne formy tlenu, zapobiegać degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ naprawczy na uszkodzenia anionów wolnych rodników tyminy.

Kliknij Cistanche Tubulosa

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Wstęp

Kwas alfa-liponowy (ALA) występuje w wielu produktach spożywczych, w tym w warzywach (szpinak, brokuły, pomidory) i mięsie (zwłaszcza wnętrzności), a także w kilku suplementach diety [1,2]. ALA wykazuje liczne działanie przeciwutleniające, w tym aktywację endogennych mechanizmów antyoksydacyjnych oraz chelatację jonów metali, takich jak żelazo, cynk i miedź [3,4]. Jako cząsteczka siarki organicznej, ALA może usuwać reaktywne formy tlenu (ROS) i zwiększać aktywność tkankowych enzymów antyoksydacyjnych, takich jak peroksydaza glutationowa (GPx) i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) [5-7]. Ze względu na swoje właściwości przeciwutleniające stwierdzono, że ALA zmniejsza zależną od ALA śmierć komórek w raku płuc [8], raku piersi [9] i raku okrężnicy [10]. Ponadto wcześniejsze badania wykazały, że ALA ma właściwości przeciwzapalne [11–16]. ALA zmniejsza stan zapalny poprzez modulowanie ekspresji cytokin zapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-) i interleukina -1 (IL-1) [17,18]. Farmakologiczne korzyści ALA zostały udowodnione w wielu różnych dziedzinach związanych z medycyną, w tym w modelach sercowo-naczyniowych, neuroprotekcyjnych, kognitywnych i przeciwstarzeniowych [19].

Rak jest główną przyczyną śmiertelności w każdym kraju i główną przeszkodą dla długowieczności [20]. Skutki uboczne leków chemioterapeutycznych są jednym z najważniejszych czynników osłabiających w walce z rakiem, a zapalenie błony śluzowej jest jedną z najczęstszych chorób spotykanych u chorych na nowotwory [21]. Zapalenie błony śluzowej jest patologicznym stanem zapalnym charakteryzującym się owrzodzeniem i stanem zapalnym błony śluzowej przewodu pokarmowego [22]. Zapalenie błony śluzowej zwiększa stosowanie opioidowych leków przeciwbólowych z powodu bólu i przyspiesza przejście na całkowite żywienie pozajelitowe z powodu problemów żywieniowych [23]. Mucositis i związane z nim trudności pogarszają jakość życia chorego, a rozwój stanów zagrażających życiu i negatywne reakcje na terapię są powodem do niepokoju ze względu na złe leczenie zmian [24].

Najczęściej stosowanym lekiem chemioterapeutycznym w nowotworach przewodu pokarmowego jest analog pirymidyny 5-fluorouracyl (5-FU). 5-FU wywiera działanie przeciwnowotworowe poprzez hamowanie syntazy tymidylanowej (TS) i integrowanie jej metabolitów z RNA i DNA [25]. Jednak środek ten wywołuje zapalenie błony śluzowej przewodu pokarmowego, co jest poważnym, wyniszczającym działaniem niepożądanym [26]. W szczególności degradacja równowagi oksydacyjno-przeciwutleniającej, wzrost poziomu cytokin prozapalnych i aktywność enzymów proteolitycznych odgrywają główną rolę w rozwoju tych działań niepożądanych. Chociaż w celu rozwiązania tego problemu stosowano leki przeciwutleniające i przeciwzapalne, nie została jeszcze zidentyfikowana szczególnie solidna metoda terapeutyczna [27,28].

Do chwili obecnej w kilku badaniach opisano jednoczesne stosowanie 5-FU i ALA w różnych nowotworach; obejmują one guzy szyjki macicy i jelita grubego [29,30]. Ponadto korzystne byłyby leki pomocnicze, które można włączyć do procedur leczenia, aby zapobiegać niepożądanym skutkom zapalenia błony śluzowej przewodu pokarmowego u pacjentów z rakiem wywołanym przez 5-FU. Zatem celem tego badania było określenie skutków biologicznych stosowania ALA u szczurów z modelem zapalenia błony śluzowej stworzonym przez 5-FU, oprócz zbadania jego możliwego zastosowania jako kandydata na środek w protokołach leczenia.

2. Materiały i metody

2.1. Zwierząt

Zwierzęta zostały zabrane z Animal Experiments Units Uniwersytetu Bliskiego Wschodu. Szczury (Wistar albinos, obu płci) utrzymywano od początku w cyklu ciemności/światła 12:12 hw temperaturze pokojowej 22 ± 2°C w obiekcie o kontrolowanej wilgotności (50 ± 5 procent). Karmiono ad libitum bez żadnych ograniczeń w stosunku do ich standardowej karmy dla szczurów i wody pitnej. Szczury trzymano w klatkach z pleksiglasu (4 szczury na klatkę o wymiarach 60 × 40 × 40 cm). Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Lokalnych Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Bliskiego Wschodu (zatwierdzenie nr 2019/01 w dniu 17 stycznia 2019 r. i 2020/11 w dniu 27 listopada 2020 r.) oraz wytyczne etyczne wymienione w Deklaracji Helsińskiej z 1964 r. i jej późniejszych poprawkach były śledzone.

Trzydzieści dwa szczury Wistar Albino obu płci o wadze 200–250 g podzielono na cztery grupy po osiem szczurów (n {3}}): grupy kontrolne, ALA, Mucositis i Mucositis plus ALA. Grupa kontrolna otrzymywała tylko dootrzewnową (ip) sól fizjologiczną (SF) raz dziennie przez jeden tydzień. Grupa ALA otrzymywała tylko ALA w dawce 100 mg/kg dootrzewnowo raz dziennie przez tydzień od dnia 1. [31,32]. Grupę z zapaleniem błony śluzowej leczono SF (ip) w dniu 1 i 400 mg/kg 5-FU ip od dnia 2 do końca eksperymentu [33]. Grupa Mucositis plus ALA otrzymywała 100 mg/kg ip ALA w dniu 1 i 400 mg/kg ip 5-FU w dniu 2. Następnie podawanie 100 mg/kg/dzień ip ALA kontynuowano do końca eksperymentu . Zwierzęta monitorowano przez jeden tydzień iw tym czasie nie wystąpiła żadna śmiertelność. Zwierzęta we wszystkich grupach poddano eutanazji pod koniec okresu badawczego przez podanie kombinacji przedawkowania ketaminy/ksylazyny. Testy laboratoryjne przeprowadzono w Laboratorium Diagnostycznym i Laboratorium Histopatologicznym Szpitala dla Zwierząt, Near East University.

2.2. Pobieranie próbek krwi i tkanek

Pobrano próbki krwi i przekazano je do laboratorium w probówkach do oddzielania surowicy. Próbki surowicy rozdzielano przy 2000 x g przez 10 minut i trzymano w temperaturze -80 ◦C do czasu dalszej analizy. W celu wyeliminowania dodatkowej krwi pobrano tkanki żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego i przemyto roztworem buforu fosforanowego (pH=7,4). Następnie po dostarczeniu do laboratorium poddano je procedurze homogenizacji. Homogenizację tkanek przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta przy użyciu buforu RIPA (nr pozycji 10010263, nr partii 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) i zestawu do rozdrabniania tkanek Dounce (D8938, seria 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) na lodzie. Po homogenizacji próbki wirowano przy 1600 x g przez 10 min w temperaturze plus 4°C. Technikę oznaczania białka Bradforda wykorzystano do ilościowego określenia poziomów białka w próbkach tkanek, a następnie supernatanty zamrożono w temperaturze -80°C do dalszych badań.

2.3. Pomiary wskaźników biochemicznych

Aktywność transaminazy alaninowej (ALT), transaminazy asparaginianowej (AST), fosfatazy alkalicznej (ALP), dehydrogenazy mleczanowej (LDH), lipazy (LIP), amylazy (AMY), kreatyniny, azotu mocznikowego we krwi (BUN), białka całkowitego (TP) , a poziomy albumin mierzono jako wskaźniki biochemiczne w próbkach surowicy przy użyciu automatycznego analizatora chemii klinicznej BS-240 VET (Mindray, Shenzhen, Chiny).

2.4. Pomiar cytokin w surowicach i tkankach

Stężenia TNF- i IL-1 w surowicach i próbkach tkanek mierzono przy użyciu dostępnych w handlu zestawów testowych ELISA (ELR-TNF- i ELR-IL{7}}, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta.

2.5. Pomiar metaloproteinaz macierzy (MMP) i tkankowych inhibitorów metaloproteinazy-1 (TIMP-1) w surowicach i tkankach

MMP i TIMP{0}}, które biorą udział w różnych procesach biologicznych, takich jak nowotwory i stany zapalne, mierzono zarówno w homogenatach tkankowych, jak iw surowicach, korzystając z instrukcji producenta i zaleceń dotyczących dostępnych na rynku testów ELISA swoistych dla szczurów (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, Chiny; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA). Stężenia MMP i TIMP{15}} w surowicy wyrażono jako pg/ml, podczas gdy poziomy w tkankach wyrażono jako pg/mg białka.

2.6. Pomiar dialdehydu malonowego (MDA), GPx i SOD w tkankach

Poziomy MDA w tkankach oceniano przy użyciu dostępnych w handlu zestawów testowych do określania stanu peroksydacji lipidów (zestaw TBARS Assay, pozycja nr 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Zasada pomiaru opiera się na reakcji z kwasem tiobarbiturowym (TBA) we wrzącej wodzie przez 60 min w środowisku kwaśnym i pomiarze absorbancji mieszaniny reakcyjnej przy 532 nm (Ohkawa i in., 1979). Do pomiaru absorbancji zastosowano przestrajalny czytnik mikropłytek VersaMax (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Stężenia MDA w tkankach wyrażono jako nmol MDA/mg białka.

W tkankach oceniono aktywność GPx i SOD przy użyciu gotowych do użycia zestawów testowych. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Wielka Brytania) za pomocą automatycznego analizatora chemii klinicznej BS{4}} VET (Mindray, Shenzhen, Chiny). Ilości GPx i SOD w próbkach tkanek (żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego) wyrażono jako U/mg białka.

2.7. Ocena histopatologiczna

Tkanki żołądka, jelita cienkiego i grubego otrzymane bezpośrednio po okresie doświadczalnym utrwalano w 10% (v/v) obojętnej formalinie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu tkanki umieszczono na urządzeniu do śledzenia tkanek, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy). Tkanki pobrane z urządzenia do śledzenia tkanek zostały następnie zatopione w parafinie. Z tkanek wycięto skrawki o grubości 5- µm za pomocą mikrotomu Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy) i przeprowadzono rutynowe barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Skrawki badano histomorfologicznie za pomocą mikroskopu świetlnego Leica DM500 połączonego ze zintegrowanym cyfrowym systemem do analizy obrazowania Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite wersja 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Niemcy).

2.8. Analizy statystyczne

Do analizy statystycznej użyto oprogramowania GraphPad Prism (wersja 7.{2}}4, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (X ± SD). Do porównania grup danych zastosowano test analizy wariancji (ANOVA), a następnie test porównań wielokrotnych Tukeya. Ponadto do porównania wyników histomorfologicznych między grupami zastosowano test Kruskala-Wallisa. Za istotną statystycznie uznano różnicę p < 0,05.

3. Wyniki

3.1. ALA pozytywnie wpływa na wskaźniki biochemiczne

Tabela 1 przedstawia aktywność enzymów w surowicy i stężenia metabolitów. W porównaniu z grupą kontrolną, grupa z zapaleniem błony śluzowej miała znacznie wyższy poziom albuminy, ALT, AST, ALP, LDH, amylazy, lipazy, BUN, kreatyniny i TP (p <{1}}.05 –0.0001). Wystąpiła jednak znacząca różnica w poziomach albumin, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, kreatyniny, amylazy, BUN i kreatyniny między grupą ALA plus zapalenie błony śluzowej a grupą z zapaleniem błony śluzowej (p < 0,05–0,001). Poziomy ALP, ALT, AST, LDH i amylazy również różniły się zasadniczo między grupami z zapaleniem błony śluzowej i ALA (p < 0,05–0,0001). W związku z tym zaobserwowano, że poziomy enzymów wątrobowych, enzymów trzustkowych i metabolitów drastycznie spadły w grupie z zapaleniem błony śluzowej, gdy do leczenia dodano ALA.

3.2. ALA zmniejsza produkcję cytokin prozapalnych

Poziomy cytokin prozapalnych TNF- i IL-1 w próbkach surowicy, żołądka, jelita cienkiego i grubego można zobaczyć na rycinie 1. Poziomy TNF- i IL-1 w surowicach i we wszystkich tkanki zwierząt w grupie z zapaleniem błony śluzowej były znacząco wyższe w porównaniu z grupami kontrolnymi, ALA i mucositis plus ALA (p <0.05–{12}}.0{ {17}}{{20}}1). Jednak poziomy TNF- i IL-1 w surowicy i we wszystkich tkankach zmniejszyły się znacząco w grupie z zapaleniem błony śluzowej plus ALA w porównaniu z grupą z zapaleniem błony śluzowej (p <{25}},05–0,0001). Pomiędzy grupą kontrolną a grupami z zapaleniem błony śluzowej i ALA występowała zasadnicza różnica w poziomach TNF- w jelicie cienkim i grubym. (p < 0,01). Wystąpiły również znaczące różnice w poziomach TNF w jelicie grubym i cienkim pomiędzy grupami ALA i Mucositis plus ALA. (odpowiednio p < 0,01, p < 0,001). Ponadto istniały statystycznie istotne różnice między grupami kontrolnymi i grupami z zapaleniem błony śluzowej plus ALA pod względem poziomów IL{24}} w żołądku (p < 0,05). Dlatego wydaje się, że ALA znacząco obniża poziomy cytokin prozapalnych w zapaleniu błony śluzowej.

3.3. Leczenie ALA zmniejsza peroksydację lipidów i zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych w tkankach

Poziomy MDA, aktywności GPx i SOD określono ilościowo w celu oceny stanu peroksydacji i przeciwutleniaczy na poziomie tkankowym (ryc. 2). Poziomy MDA w żołądku, jelicie cienkim i jelicie grubym grupy z zapaleniem błony śluzowej były znacznie wyższe niż w grupach kontrolnej, ALA i z zapaleniem błony śluzowej plus ALA (p <0.05–{5}} 0,0001). Ponadto, poziomy MDA w jelicie grubym w grupie Mucositis plus ALA były zasadniczo różne od tych w grupach Kontrolnej i ALA (p < 0,0001).

Szczury w grupach kontrolnych i ALA miały znacznie wyższe poziomy SOD we wszystkich tkankach niż szczury w grupie z zapaleniem błony śluzowej (p <{0}}.05–{6}}.{{8 }}{{10}}01). Poziomy SOD w próbkach jelita grubego były istotnie różne w grupach ALA i Mucositis plus ALA (p < 0,01). W próbkach żołądka poziomy SOD były istotnie niższe w grupach ALA i Mucositis plus ALA (p < 0,05). Ponadto poziomy SOD w jelicie cienkim szczurów z grupy Mucositis były znacznie niższe niż poziomy SOD w grupie ALA (p < 0,05). Jednak poziomy SOD w żołądku i jelicie grubym zwierząt w grupach Mucositis i Mucositis plus ALA były zasadniczo różne (p < 0,05–0,0001).

3.4. Leczenie ALA zwiększa poziom tkankowych MMP i TIMP-1

Aktywności MMP{0}}, MMP{1}}, MMP{2}} i TIMP-1 (Tabela 2) w surowicy, żołądku, jelicie cienkim i jelicie grubym były istotnie wyższy w grupie Mucositis w porównaniu z grupą kontrolną i ALA (p < 0,05–0,0001). Wzrost poziomów MMP{9}}, MMP{10}}, MMP{11}} i TIMP-1 w surowicach szczurów z zapaleniem błony śluzowej oraz w żołądku, jelicie cienkim i jelicie grubym był znacznie stłumiony w Szczury Mucositis plus ALA (p < 0,05–0,0001), chociaż nie było istotnej różnicy w poziomach MMP{17}} w surowicy między grupami Mucositis plus ALA i Mucositis.