Proteomiczne mapowanie krajobrazu choroby Behçeta wyleczonej narządowo z wykorzystaniem dogłębnej proteomiki plazmy do identyfikacji ekspresji białka wiążącego hialuron 2 związanej z zajęciem naczyń

Cel.

Badanie to podjęto w celu wyjaśnienia patogenezy i heterogeniczności choroby Behçeta (ChAD) obejmującej różne narządy, przy użyciu dogłębnej proteomiki w celu identyfikacji biomarkerów na potrzeby oceny klinicznej i leczenia pacjentów z ChAD.

Metody.

Zmierzyliśmy poziomy ekspresji białek w próbkach osocza od 98 pacjentów z ChAD i 31 zdrowych osób z grupy kontrolnej, korzystając z naszej zaawansowanej platformy proteomicznej ze spektrometrem mas do pozyskiwania niezależnych od danych i mikromacierzą przeciwciał. Przeprowadziliśmy analizy bioinformatyczne procesów biologicznych i szlaków sygnalizacyjnych, które uległy zmianie w grupie osób z ChAD, i skonstruowaliśmy proteomiczny krajobraz patogenezy ChAD zależnej od narządów. Następnie dokonaliśmy walidacji biomarkerów ciężkości choroby i podzbioru naczyń w niezależnej kohorcie 108 pacjentów z ChAD i 29 zdrowych osób z grupy kontrolnej, stosując test immunoenzymatyczny.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Wyniki.

Grupa z ChAD zawierała 220 białek o różnej ekspresji, co pozwalało na rozróżnienie pomiędzy pacjentami z ChAD (88,6%) i zdrowymi kontrolami (95,5%). Analizy bioinformatyczne ujawniły różne procesy biologiczne powiązane z patogenezami ChAD, w tym aktywację dopełniacza, gojenie się ran, angiogenezę i odporność zależną od leukocytów. Co więcej, w ramach skonstruowanego krajobrazu proteomicznego ChAD zidentyfikowanego na narządach zidentyfikowano cechy proteomiczne ChAD powiązane z różnymi narządami i docelowymi białkami, które można wykorzystać do opracowania leczenia. Białko wiążące hialuron 2, tenascyna i serpina A3 zostały poddane walidacji jako potencjalne biomarkery do oceny klinicznej naczyniowej postaci BD i celów leczenia.

Wniosek.

Nasze wyniki dostarczają cennego wglądu w patogenezę ChAD przenoszonego na narządy pod względem charakterystyki proteomicznej i potencjalnych biomarkerów do oceny klinicznej i potencjalnych terapii ChAD naczyniowych.

WSTĘP

Choroba Behçeta (ChAD) to wieloukładowe, przewlekłe zapalenie naczyń, które jest bardzo rozpowszechnione w populacji wzdłuż starożytnego szlaku handlowego zwanego Jedwabnym Szlakiem. Badanie z 2016 roku wykazało, że częstość występowania ChAD w Turcji wynosiła 602 na 100000 w populacji młodzieży i dorosłych (1). ChAD jest wysoce heterogenna, a u pacjentów występują zmiany wielonarządowe, w tym owrzodzenia jamy ustnej, owrzodzenia narządów płciowych, zapalenie błony naczyniowej oka i zmiany skórne; ChAD może być śmiertelna w wyniku pęknięcia tętniaka naczyniowego lub ciężkich powikłań neurologicznych. Charakterystyka molekularna ChAD związana z różnymi narządami jest nieznana. Kliniczne metody diagnostyki i późniejsze możliwości leczenia zależą głównie od objawów klinicznych. Nie są jednak dostępne żadne biomarkery umożliwiające różnicowanie ChAD na podstawie zajęcia różnych narządów. W porównaniu z genomiką proteomika oferuje alternatywne podejście do zdobywania obfitych informacji na temat patogenezy ChAD i znajdowania biomarkerów na potrzeby diagnostyki i terapii ChAD. Lee i wsp. odkryli 22 białka o różnej ekspresji przy użyciu 2-elektroforezy wymiarowej połączonej z tandemową spektrometrią mas z czasem przelotu i desorpcją laserową wspomaganą matrycą (2). Trzy unikalne białka jelitowej choroby ChAD (fibryna, apolipoproteina A-IV i amyloid A w surowicy) poddano dalszej walidacji w niezależnej kohorcie za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Korzystając z macierzy kulek cytokin Bio-Rad zawierających 25 cytokin zapalnych, Lopalco i wsp. odkryli, że receptor gp130/wydzielany interleukiny-6 (IL-6), wydzielany receptor IL-6, IL{{19} }, a stężenie limfopoetyny zrębowej grasicy w surowicy było istotnie zwiększone w podgrupie ChAD z objawami śluzówkowo-skórnymi i zajęciem oczu w porównaniu z podgrupą, w której występowały jedynie zmiany śluzówkowo-skórne (3). Jednakże informacje uzyskane w tych badaniach były ograniczone, ponieważ grupy białkowe i grupy pacjentów były małe, a zidentyfikowane biomarkery nie zostały dobrze potwierdzone. Na potrzeby tego badania przeprowadziliśmy, według naszej wiedzy, pierwsze kompleksowe profilowanie proteomu osocza w przypadku ChAD, wykorzystując naszą dogłębną platformę proteomiczną zintegrowaną ze spektrometrem mas do pozyskiwania niezależnych od danych (DIA-MS) z konfigurowalnymi mikromacierzami przeciwciał (4). Korzystając z danych proteomicznych, przeanalizowaliśmy białka, które ulegały zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z ChAD i zdrową grupą kontrolną, a także procesy biologiczne i szlaki tych białek dotyczące patogenezy ChAD. Ponadto skonstruowaliśmy krajobraz BD rozdzielony narządami i zidentyfikowaliśmy cechy proteomiczne każdego narządu. W niezależnej kohorcie zweryfikowano biomarkery naczyniowej postaci ChAD i ciężkości choroby.

PACJENCI I METODY

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Lekarskiej szpitala Peking Union Medical College Hospital (JS-2049). Artykuł ten nie zawiera danych umożliwiających identyfikację żadnego pacjenta z ChAD ani zdrowego uczestnika grupy kontrolnej. Kohorta odkrywcza obejmowała 98 pacjentów z ChAD i 31 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Proteom osocza mierzono dogłębnie przy użyciu DIA-MS i mikromacierzy przeciwciał. Analizy bioinformatyczne wykorzystano do zidentyfikowania zmienionych mechanizmów biologicznych w grupie osób z ChAD i do skonstruowania krajobrazu proteomicznego ChAD z rozpoznaniem narządowym. Biomarkery osocza kandydatów zostały zweryfikowane przy użyciu testu ELISA w niezależnych kohortach obejmujących zdrową grupę kontrolną oraz pacjentów z ChAD i zapaleniem tętnic Takayasu. Charakterystyka kliniczna i informacje dotyczące leczenia kohort odkrywających i walidacyjnych przedstawiono w tabelach uzupełniających 1-6, a szczegółowe procedury eksperymentalne opisano w materiałach uzupełniających dostępnych na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348.

WYNIKI

Charakterystyka pacjenta. Charakterystykę kliniczną pacjentów z ChAD oraz stosowanie przez nich glukokortykoidów (GC) i leków immunosupresyjnych w momencie pobierania krwi przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1, dostępnej na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi /10.1002/art.42348. W naszej analizie proteomicznej nie zaobserwowano znaczących różnic pod względem płci i wieku między 98 pacjentami z ChAD a 31 zdrowymi osobami z grupy kontrolnej (kohorta odkrycia) (tabela uzupełniająca 1). W grupie chorych na ChAD u 45, 38 i 15 pacjentów występowała odpowiednio łagodna, umiarkowana i ciężka ChAD. U wszystkich pacjentów z ChAD występowały owrzodzenia jamy ustnej, a > 20% miało owrzodzenia narządów płciowych (80,6%), zmiany skórne (65,3%), zmiany w oku (23,5%) i zajęcie naczyń (22,4%). Zajęcie naczyń u pacjentów z ChAD w kohorcie odkrywczej pokazano w tabeli uzupełniającej 2, a charakterystykę kohort walidacyjnych, które zastosowano w celu sprawdzenia ekspresji kandydatów na biomarkery, przedstawiono w tabelach uzupełniających 3–5 (dostępnych na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology Nahttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Dogłębne profilowanie proteomu osocza u pacjentów z ChAD przy użyciu DIA-MS i mikromacierzy przeciwciał. Schematyczną ilustrację badania profilowania białek przedstawiono na rycinie 1A i rycinie uzupełniającej 1, dostępnych na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1{{11} }02/art.42348. Wszystkie próbki osocza od pacjentów z ChAD i zdrowych osób kontrolnych zostały zmierzone przy użyciu naszej dogłębnej platformy proteomiki osocza składającej się z DIA-MS i mikromacierzy przeciwciał o wysokiej powtarzalności. Współczynniki korelacji Spearmana przy wykrywaniu białek osocza przy użyciu mikromacierzy przeciwciał wyniosły odpowiednio 0, 98 i 0, 93 odpowiednio w obrębie różnych tablic i pomiędzy nimi (dodatkowe rysunki 2A i 2B, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https ://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Współczynnik korelacji Spearmana dla wykrywania białek osocza przy użyciu DIA-MS wyniósł 0, 92 (zakres 0, 87–0, 96; rysunek uzupełniający 2C). Reprezentatywne obrazy zeskanowane za pomocą mikromacierzy przeciwciał dla pacjentów z ChAD i zdrowych osób kontrolnych pokazano na dodatkowym rysunku 3, dostępnym pod adresem https://linelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348. Wyniki wykazały, że ogólnie poziom białek osocza pacjentów z ChAD był podwyższony w porównaniu z białkami osocza zdrowych osób z grupy kontrolnej. Dzięki naszej dogłębnej platformie proteomiki osocza zidentyfikowaliśmy 759 białek (rysunki uzupełniające 1, 4 i 5, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348), które były rozmieszczone w około 10 rzędach wielkości w osoczu (ryc. 1B). Białka te obejmowały 410 biomarkerów białkowych (Baza danych biomarkerów plazmy chorób ludzkich, dostępna online pod adresem http://biokb.ncpsb. org. cn/hdpp/#/) i 388 celów terapeutycznych, które są obecnie zatwierdzone lub są w trakcie badań w trwających badaniach klinicznych (Therapeutic Target Database, dostępna online pod adresem http://db.idrblab.net/ttd/) (rysunek 1B). Funkcjonalne adnotacje tych biomarkerów i celów terapeutycznych wskazują, że białka te należą do różnych chorób autoimmunologicznych i autozapalnych, w tym BD, toczniowego zapalenia nerek, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa i zapalenia naczyń (ryc. 1C i 1D oraz tabele uzupełniające 7 i 8, dostępne na stronie Arthritis & Rheumatology stronie internetowej pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Wyniki te sugerują, że białka osocza wykryte za pomocą naszej platformy są ściśle powiązane z występowaniem i rozwojem ChAD.

Rycina 1. Profilowanie proteomów próbek osocza od pacjentów z chorobą Behçeta (BD) przy użyciu dogłębnej platformy proteomicznej z niezależną od danych akwizycyjną spektrometrią mas (DIA-MS) i analizą mikromacierzy przeciwciał. Przebieg naszego badania proteomicznego dotyczącego ChAD. B, Rozkład stężeń białek osocza wykrytych za pomocą DIA-MS i mikromacierzy przeciwciał zgodnie ze stężeniami referencyjnymi w bazie danych proteomów ludzkiego osocza (http://www.plasmaproteomedatabase.org/). C, Choroby powiązane z wykrytymi biomarkerami białkowymi, które zidentyfikowano przy użyciu bazy danych biomarkerów ludzkich chorób osocza (HDPP) (http://biokb.ncpsb.org.cn/hdpp/#/). D, Choroby związane z wykrytymi docelowymi białkami terapeutycznymi, które zidentyfikowano przy użyciu bazy danych celów terapeutycznych (TTD) (http://db.idrblab.net/ttd/). Rozmiary kół w C i D odpowiadają liczbie białek wzbogaconych w każdej chorobie. HC=zdrowa kontrola; przygotowanie próbki FASP=wspomagane filtrem; QE-HF=Exactive HF Hybrid Quadrupole Orbitrap (ThermoFisher) spektrometr mas; Strep-PE=streptawidyna-fikoerytryna; Test immunoenzymatyczny ELISA =; IgA=immunoglobulina A.

Analiza całego proteomu białek osocza o różnej ekspresji związanych z ChAD. Dodatkowy rysunek 1, dostępny pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348, przedstawia schemat blokowy sposobu identyfikacji i integracji białek ulegających różnej ekspresji z wyników DIA-MS i mikromacierzy przeciwciał. W sumie DIA-MS celowało w 493 białka, z czego 379 białek zostało zatrzymanych<29 missing values in the BD group and < 7 missing values in the healthy control group. After 36 proteins with potential contaminations from blood cells (5) were removed, we analyzed 343 additional proteins for hypothesis testing, of which 166 proteins showed a statistically significant difference between the BD and healthy control groups. The antibody microarray detected 549 proteins. After 5 control proteins were removed, we retained 544 proteins for further analysis; of these, 74 proteins showed statistically significant differences between the BD group and the healthy control group (Supplementary Figure 1). In total, 220 (29.0%) of 759 proteins were significantly differently expressed between the BD group and the healthy control group (P < 0.05), as shown using our in-depth proteomics platform comprising DIA-MS and the antibody microarray (Figure 2A and Supplementary Figures 1 and 5, available at https:// onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). The number of differentially expressed proteins is 10-fold more than previously reported (2,3,6). Among these proteins, 5 were identified as potential plasma or serum biomarkers in proteomics research for patients with BD, including haptoglobin, apoprotein, transthyretin, immunoglobulin light chain, and immunoglobulin heavy chain. Furthermore, growth arrest–specific 6, resistin, von Willebrand factor (VWF), and others were also identified to be increased in the BD group (Figure 2B). We identified 215 new proteins associated with BD, including serpin A3 (SERPINA3), glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1 (GPLD1), and attractin (ATRN) (Figure 2C).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Aby ustalić, czy pacjentów z ChAD można odróżnić od zdrowych osób kontrolnych, przeprowadziliśmy bezstronną analizę hierarchicznego grupowania 220 białek o różnej ekspresji (P < 0.05), w których: Zgrupowano {3}},0% pacjentów z ChAD i 86,4% zdrowych osób z grupy kontrolnej (rysunek uzupełniający 6, dostępny na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1002/art.42348). Spośród 130 białek ulegających różnej ekspresji (P <0,01) odkryliśmy, że skupiło się 88,6% pacjentów z ChAD i 95,5% zdrowych osób z grupy kontrolnej (ryc. 2D). Dalsza częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów ujawniła, że ​​pacjentów z grupy ChAD można było wyraźnie odróżnić od zdrowych osób kontrolnych zgodnie z klasyfikacją białek o różnej ekspresji (Uzupełniający Rysunek 7, dostępny na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348). Wzbogacanie chorób przy użyciu platformy DisGeNET (7) ponadto wskazało, że te białka o różnej ekspresji są znacząco powiązane ze stanem zapalnym oraz chorobami autoimmunologicznymi i naczyniowymi, w tym ChAD i zapaleniem naczyń (Rysunek 2E i tabela dodatkowa 9, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https ://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). W naszej analizie bioinformatycznej przy użyciu Cytoscape i CluGo zidentyfikowaliśmy następujące 8 głównych procesów biologicznych w ChAD: 1) aktywacja dopełniacza, 2) regulacja poziomu cząstek lipoprotein w osoczu, 3) gojenie się ran, 4) angiogeneza, 5) odporność za pośrednictwem leukocytów, 6 ) aktywność peptydazy, 7) pozytywna regulacja aktywacji komórek i 8) migracja leukocytów (Rysunek 2F i tabela uzupełniająca 10, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348 ). Te procesy biologiczne zbiegają się z patologicznym mechanizmem zapalenia i krzepnięcia podczas rozwoju ChAD, w którym profile lipidowe i modyfikacja pod wpływem stresu oksydacyjnego podczas zapalenia prowadzą do dysfunkcji śródbłonka i zdarzeń naczyniowych (8–11).

Konsekwentnie, najważniejszym szlakiem z bazy danych KEGG (dostępnej pod adresem http://www.genome.ad.jp/kegg) były kaskady dopełniacza i krzepnięcia (ryc. 3A), w których występuje 38 białek (P <{2}}.05 ) zidentyfikowano, w tym 19 składników dopełniających (C) (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, C4B, łańcuch alfa białka wiążącego C4b [C4BPA], C5, C6, C7, łańcuch alfa C8, łańcuch C8 beta, C8 gamma łańcuch [C8G], C9, czynnik dopełniacza [CF] B, CFH, białko 4 związane z CFH [CFHR4], CFI i białko składowe podobne do receptora 1), 5 czynników krzepnięcia (F11, F12, F13B, F5 i F9 ), 4 białka związane z krzepnięciem (tkankowy aktywator plazminogenu [PLAT], białko C, białko przeciwzakrzepowe S [PROS1] i VWF) i 5 białek z rodziny serpin (SERPINA1, SERPINC1, SERPIND1, SERPINF2 i SERPING1). Dwadzieścia pięć białek w kaskadzie było celami nadającymi się do leczenia terapeutycznego (Figura 3B). Co ciekawe, większość białek wchodzących w skład szlaku KEGG oraz kaskad dopełniacza i krzepnięcia pokrywała się z białkami zaangażowanymi w najbardziej wzbogacone procesy biologiczne krzepnięcia krwi/gojenia się ran (ryc. 3B i tabela dodatkowa 10, dostępne pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/ doi/10.1002/art.42348.). Za pomocą analizy szlaków KEGG w badaniu zidentyfikowano kilka patogennych szlaków infekcji, w tym zakażenie Staphylococcus aureus, chorobę prionową, krztusiec, zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego, zakażenie wirusem opryszczki pospolitej 1 oraz interakcje białek wirusowych z cytokinami i receptorem cytokin, co podkreśla rolę infekcji patogennej w BD (rysunek uzupełniający 8A, dostępny na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresemhttps://biblioteka internetowa.

Rycina 2. Ekspresja białek była różna u pacjentów z ChAD i zdrowych grup kontrolnych zidentyfikowanych za pomocą DIA-MS i mikromacierzy przeciwciał. Wykres wulkanu ilustrujący rozregulowanie białek u pacjentów z ChAD w porównaniu ze zdrowymi grupami kontrolnymi. Białka o znacząco zwiększonej i obniżonej regulacji (P <{3}}.05) oznaczono odpowiednio czerwoną i niebieską kropką. B, Wykresy punktowe pokazujące intensywność ekspresji reprezentatywnych białek w osoczu pacjentów z ChAD i zdrowych osób kontrolnych. Symbole reprezentują poszczególne próbki; poziome linie wskazują medianę. C, diagram Venna porównujący liczbę białek ulegających zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z ChAD zidentyfikowanych w naszym badaniu z białkami zidentyfikowanymi w poprzednich badaniach. D, Hierarchiczna analiza skupień białek o różnej ekspresji (P <{13}}.01) pomiędzy grupą z ChAD i zdrową grupą kontrolną, gdzie skupiono 88,6% pacjentów z ChAD i 95,5% HC. Przerywany prostokątny obszar wskazuje każdą grupę wraz z odpowiednimi białkami o wysokiej ekspresji. E, Wzbogacenie chorób (pochodzących z platformy DisGeNET) związanych z rozregulowanymi białkami u pacjentów z ChAD w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną (log10 [wartość q] < -15). F, Znacząco wzbogacone procesy biologiczne zidentyfikowane przy użyciu białek o zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z ChAD w porównaniu z grupą kontrolną (P <{22}}.05). *=P < 0,05; **=P < 0,01; ***=P < 0,001; ****=P < 0,0001. GAS6=specyficzny dla zatrzymania wzrostu 6; RETN=rezystyna; czynnik VWF=von Willebranda; SERPINA3=serpina A3 (1-antychymotrypsyna); GPLD1=fosfolipaza D1 specyficzna dla glikozylofosfatydyloinozytolu; Przyciąganie ATRN=(inne definicje można znaleźć na rysunku 1).

Rycina 3. Szlaki sygnalizacyjne związane z patogenezą ChAD. A, Znacząco wzbogacone szlaki sygnalizacyjne powiązane z białkami o zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z ChAD w porównaniu ze zdrowymi kontrolami zidentyfikowanymi przy użyciu baz danych KEGG i Reactome (P < 0.01). Czerwona czcionka wskazuje ścieżki związane z krzepnięciem krwi i aktywacją dopełniacza. B, Kaskady dopełniacza i krzepnięcia, zidentyfikowane przy użyciu bazy danych KEGG, wykazujące najbardziej znaczące powiązania z białkami o zróżnicowanej ekspresji u pacjentów z ChAD w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną. Wskazano białka sygnaturowe, na które mogą być ukierunkowane znane, zatwierdzone leki. C i D. Znacząco wzbogacona domena białkowa (C) i składniki komórkowe (D) zidentyfikowane przez białka ulegające znacznej ekspresji u pacjentów z ChAD w porównaniu ze zdrowymi kontrolami (P < 0,01). W A, C i D długości słupków wskazują podstawę logarytmiczną 10 wartości P, a liczby obok słupków wskazują liczbę białek zaangażowanych w każdą kategorię. IGF=insulinopodobny czynnik wzrostu; IGFBP=białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu; C.=uzupełnienie; siateczka śródplazmatyczna ER =; macierz zewnątrzkomórkowa ECM =; CUB=uzupełnia C1r/C1s, Uegf i Bmp1; EGF=naskórkowy czynnik wzrostu; W górę=regulacja w górę; W dół=regulacja w dół (inne definicje można znaleźć na rysunku 1).

wiley.com/doi/10.1002/art.42348) (12–17). Szlak KEGG zakażenia Staphylococcus aureus obejmujący 13 białek o różnej ekspresji ( P <0, 05) został znacznie wzbogacony (niektóre z nich zaznaczono na dodatkowym rysunku 8B), co sugeruje rolę zakażenia Staphylococcus aureus w patogenezie ChAD (18,19). Na koniec analiza wzbogacenia zidentyfikowała domeny dopełniacza, w tym domenę obfitującą w białka kontrolne dopełniacza, powtórzenie Sushi, kompleks ataku błonowego/perforynę, domenę składnika dopełniacza C1q i domenę CUB (dla dopełniaczy C1r/C1s, Uegf i Bmp1 ) (Rysunek 3C). Analiza wzbogacenia składników komórkowych ujawniła, że ​​białka o zwiększonej ekspresji zostały wzbogacone między innymi w macierz zewnątrzkomórkową zawierającą kolagen, światło ziarnistości wydzielniczych, ziarnistości alfa płytek krwi i cząstki lipoprotein osocza, ale białka o zwiększonej ekspresji zostały wzbogacone głównie w przestrzeń zewnątrzkomórkowa i egzosom (ryc. 3D).

Aby zbadać wpływ leczenia na białka osocza, pogrupowaliśmy pacjentów z ChAD według leczenia GC i lekami immunosupresyjnymi. Pacjentów z ChAD, leczonych lub nieleczonych, można było wyraźnie odróżnić od zdrowych osób z grupy kontrolnej (rysunek uzupełniający 9A, dostępny na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art. 42348). Analiza wykazała, że ​​większość procesów biologicznych, które uległy zmianie u pacjentów z ChAD, leczonych w porównaniu z pacjentami z ChAD, którzy nie byli leczeni GC i lekami immunosupresyjnymi, była związana z regulacją odpowiedzi immunologicznych (rysunek uzupełniający 9B). Porównaliśmy także zróżnicowaną ekspresję białek osocza u pacjentów z ChAD nieleczonych i pacjentów z ChAD, którzy otrzymywali GC i leczenie immunosupresyjne. W wynikach zidentyfikowano 68 białek o różnej ekspresji (P <0,05) zaangażowanych na przykład w regulację poziomu cząstek lipoprotein w osoczu i klirens oraz aktywność endopeptydazy typu serynowego (rysunek uzupełniający 10, dostępny na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https:// onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348).

Krajobraz proteomiczny BD rozdzielonego narządowo. ChAD jest wysoce heterogenną chorobą obejmującą wiele narządów i objawiającą się różnymi objawami fenotypowymi (tabela uzupełniająca 1, dostępna pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art .42348). W badaniach próbowano podzielić ChAD na podkategorie na podstawie objawów klinicznych (20–23). Aby zbadać heterogeniczność wśród pacjentów z ChAD w oparciu o dane proteomiczne, przeprowadziliśmy bez nadzoru grupowanie konsensusowe na 220 białkach ulegających różnej ekspresji (Rysunek 4A). Analiza głównych składowych ujawniła wyraźną odrębność podtypu I i podtypu II od podtypu III (ryc. 4B). Białka specyficzne dla podtypu I biorą głównie udział w krzepnięciu krwi i aktywacji dopełniacza, białka specyficzne dla podtypu II biorą udział głównie w metabolizmie glukozy i białkowo-lipidów, a białka specyficzne dla podtypu III biorą udział w odpowiedzi zapalnej (ryc. 4D i ryc. dodatkowy 11, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Chociaż nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic dotyczących charakterystyki klinicznej pomiędzy grupami BD z podtypami proteomiki, odkryliśmy, że podtyp I i ​​podtyp II były podobne (ryc. 4B), co było zgodne z wynikami analizy głównych składowych. U pacjentów z ChAD z podtypem I i podtypem II odsetek ciężkich objawów był większy, w tym zajęcia układu nerwowego (13,8% w podtypie I i 8,2% w podtypie II w porównaniu z 0% w podtypie III) i zajęcia naczyń (27,6% w podtypie I i 22,4%). % wśród podtypu II w porównaniu z 0% wśród podtypu III). Chociaż pacjenci z ChAD z podtypem III mieli objawy stosunkowo łagodne do umiarkowanych, wykazywali wyższy odsetek zmian skórnych (87,5% w podtypie III w porównaniu z 51,7% w podtypie I i 65,3% w podtypie II) (ryc. 4E, tabela uzupełniająca 11, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Zgromadzone dowody wskazują na zmiany w wielu procesach biologicznych podczas rozwoju ChAD, w tym zapalenie autozapalne, brak równowagi redoks, zmiany metabolomiczne, dyslipidemię i zaburzenia krzepnięcia (8,24–27). Dlatego nasze wyniki sugerują, że chociaż pacjenci z ChAD należący do grup proteomicznych podtypu I i podtypu II mają większe nasilenie ChAD, mechanizmy biologiczne w obu grupach mogą być różne.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Przeprowadziliśmy analizę skupień kohorty ChAD w oparciu o dane kliniczne (płeć, wiek, stopień nasilenia i objawy kliniczne), stosując {{0}}etapową analizę skupień (23). Jak pokazano na rycinie 4E, pacjentów z ChAD podzielono na 2 grupy (grupy 1 i 2), przy czym pacjentów podzielono na kategorie według objawów, takich jak owrzodzenia jamy ustnej, zmiany skórne, zmiany oczu i owrzodzenia narządów płciowych. U pacjentów z ChAD w skupieniu 1 znacznie częściej występował fenotyp zapalenia stawów obejmujący objawy bólu stawów (40,0%) oraz zajęcia układu żołądkowo-jelitowego (8,9%), naczyniowego (48,9%) i nerwowego (22,2%) w porównaniu z pacjentami z ChAD w grupie 1. skupisko 2. Następnie porównaliśmy klasyfikację kliniczną i proteomiczną w tej samej kohorcie ChAD. Wyniki wykazały, że pacjenci zakwalifikowani do podtypu I i II proteomiki oraz do klastra klinicznego 1 mieli podobne cechy kliniczne, przy czym pacjenci wykazywali zajęcie wielu narządów (tj. przewodu pokarmowego, naczyń i układu nerwowego) oraz większe nasilenie choroby (ryc. 4E). I odwrotnie, pacjenci w klasyfikacji podtypu III proteomiki i w skupieniu klinicznym 2 wykazali podobne cechy kliniczne, przy czym żaden nie wykazywał zajęcia przewodu pokarmowego, naczyń i układu nerwowego. Odkrycia te mogą być dodatkowo poparte bezstronnymi analizami grupowania hierarchicznego (ryc. 4F), w których pacjentów z podtypu proteomiki III połączono z klastrem klinicznym 2, a pacjentów z podtypu I i II proteomiki z klastrem klinicznym 1. Wyniki te pokazują potencjalną użyteczność klasyfikacji proteomicznej we wskazywaniu heterogeniczności i ciężkości ChAD. Strategia terapeutyczna u pacjentów z ChAD w dużej mierze zależy od cech klinicznych i zajętego narządu. Jednakże charakterystyka proteomiczna ChAD przenoszonego na narządy jest nieznana.

Rycina 4. Klasyfikacja pacjentów z ChAD z wykorzystaniem proteomiki osocza i zmiennych klinicznych. A, Mapa cieplna macierzy konsensusu pokazująca współwystępujące proporcje pacjentów z ChAD z każdym podtypem proteomicznym. B, Analiza głównych składowych podtypów proteomiki I, II i III u pacjentów z ChAD, wykazująca niezwykłe różnice między klastrami. C, Hierarchiczna analiza skupień białek o różnej ekspresji (P <{2}}.05, średnia różnica ekspresji P > 0,2) w 3 podtypach proteomicznych u pacjentów z ChAD. D, Grupy funkcjonalne procesów biologicznych według specyficznych białek związanych z 3 podtypami. E, Rozkład cech demograficznych i klinicznych pacjentów z ChAD według podtypów proteomicznych i klastrów klasyfikacji klinicznej. F, Rozkład każdej cechy klinicznej według podtypów proteomiki i klastrów klasyfikacji klinicznej w kohorcie ChAD, w oparciu o bezstronną analizę skupień hierarchicznych. Definicje można znaleźć na rysunku 1.

Rycina 5. Mapowanie krajobrazu ChAD rozwiązanego narządowo przy użyciu proteomiki plazmy. A, Krajobraz proteomiczny BD rozwiązanego narządowo. Po lewej: Diagram ilustrujący krotność zmiany ekspresji białka u pacjentów z ChAD w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną, zgodnie z fenotypem. Trzy bloki reprezentują, od lewej do prawej, zdrową grupę kontrolną, pacjentów z ChAD bez (wo) odpowiednich objawów i pacjentów z ChAD z odpowiednimi objawami. Intensywność koloru każdego bloku jest proporcjonalna do krotności zmiany ekspresji białka pomiędzy grupą BD i zdrową grupą kontrolną. Kolor czerwony i niebieski wskazują odpowiednio białka o zwiększonej i obniżonej regulacji. Po prawej, proces biologiczny związany z każdym białkiem ulegającym różnej ekspresji, z intensywnością szarości kwadratów wskazującą wartość P opartą na log10-, a liczbą wskazującą liczbę białek zaangażowanych w każdą kategorię. B, Korelacja (Pearsona lub Spearmana) pomiędzy ekspresją białka wiążącego hialuronian 2 (HABP2), tenascyny C (TNC) i serpiny A3 (1-antychymotrypsyny) (SERPINA3) a punktacją ciężkości pacjentów z ChAD. Cieniowanie wskazuje 95% CI. C, Wykresy skrzypcowe pokazujące intensywność ekspresji HABP2, TNC i SERPINA3 w funkcji ciężkości choroby w zdrowej grupie kontrolnej oraz w grupach z łagodną, ​​umiarkowaną i ciężką chorobą BD. Symbole reprezentują poszczególne próbki; przerywana czerwona pozioma linia wskazuje medianę, a górna i dolna przerywana czarna linia oznaczają rozstęp międzykwartylowy. *=P. < 0.{{20}}5; **=P < 0.01; ***=P < 0,001; ****=P < 0,0001. Definicje można znaleźć na rysunku 1.

W ten sposób zidentyfikowaliśmy 58 białek specyficznie wyrażanych w różnych grupach pacjentów z ChAD, którzy wykazali różne fenotypy narządów (ryc. 5A). Nasze wyszukiwanie w bazie danych DrugBank (dostępnej pod adresem https://go.drugbank.com/) ujawniło, że 26 białek, a mianowicie apolipoproteina A-IV, CFI, ceruloplazmina (CP), dehydrogenaza glutaminianowa 1 (GLUD1), białko wiążące hialuron 2 (HABP2), F5, SERPINC1, SERPINA3, białko receptora transferyny 1 (TFRC), VWF, SERPINF2, CD44, receptor regionu Fc III-A, aminotransferaza alaninowa 1, hydrolaza leukotrienu A-4, konwertaza probiałkowa typu subtylizyna/keksyna 9, angiotensynogen, C8G, haptoglobina, peptydyloprolilowa cis-trans izomeraza A, selenoproteina P, SERPIND1, SERPING1, C4BPA, limfotoksyna alfa, C4B i łańcuch ciężki intertrypsyny 4 są celami leków terapeutycznych stosowanych w klinikach lub w fazie rozwoju (Tabela uzupełniająca 12, dostępna na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348.). Wśród fenotypów fenotyp zapalenia stawów obejmujący objawy bólu stawów jest wzbogacony procesami biologicznymi związanymi z autoimmunizacją, w tym regulacją humoralnej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem krążących immunoglobulin, regulacją odporności za pośrednictwem limfocytów B i regulacją odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem immunoglobulin ; fenotyp żołądkowo-jelitowy jest powiązany z regulacją aktywacji dopełniacza i odporności zależnej od limfocytów B; fenotyp zajęty sercem jest powiązany z aktywnością receptora cytokin, regulacją procesu metabolicznego kolagenu i demontażem macierzy zewnątrzkomórkowej; fenotyp zapalenia najądrza jest powiązany z reakcją ostrej fazy; a fenotyp zmian skórnych jest powiązany z aktywnością inhibitora endopeptydazy typu serynowego, krzepnięciem krwi, humoralną odpowiedzią immunologiczną za pośrednictwem krążącej immunoglobuliny i innymi procesami (ryc. 5A i tabela dodatkowa 13, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary .wiley.com/doi/10.1002/art.42348).

Fenotyp naczyniowy charakteryzuje się największą liczbą białek ulegających zróżnicowanej ekspresji, w tym GLUD1, tenascyna C (TNC), ligand chemokiny motywu XC 2, naskórkowy czynnik wzrostu zawierający białko macierzy zewnątrzkomórkowej 1 fibulinę, HABP2, F5, ATRN, SERPINC1, GPLD1, insulinopodobne białko wiążące czynnik wzrostu 6, lektyna wiążąca mannozę 2, SEPRINA3, TFRC, VWF, SERPINF2 i członek rodziny rybonukleaz A 4 (Figura 5A). Analiza bioinformatyczna ujawniła ponadto, że te białka ulegające zróżnicowanej ekspresji biorą udział między innymi w degranulacji płytek krwi, krzepnięciu krwi, potranslacyjnej fosforylacji białek, działaniu inhibitora endopeptydazy typu serynowego i ostrej odpowiedzi zapalnej. Wszystkie te wyniki ukazują krajobraz proteomiczny ChAD przenoszony na narządy, na podstawie którego można opracować spersonalizowane leki dla docelowych białek w każdym fenotypie narządowym.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Identification of plasma proteins related to BD severity. Among the 220 unique differentially expressed proteins (P < 0.05), 28 were positively correlated with the severity of BD (Figures 5B and 5C and Supplementary Figure 12, available on the Arthritis & Rheumatology website at https://onlinelibrary. wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Seven proteins displayed a linear correlation with the severity score, namely, TNC, HABP2, SERPINA3, F5, ATRN, C4B, and CFH (Figure 5B and Supplementary Figure 12A). The expression of these 7 proteins was up-regulated in the severe BD group compared with the mild and moderate BD groups and the healthy control group, as indicated in the scatter plot in Figure 5C (see also Supplementary Figure 12A). Next, we selected and validated 7 protein candidates (TNC, HABP2, SERPINA3, ATRN, C4BPA, GPLD1, and C5) in an independent cohort composed of 108 patients with BD and 29 healthy controls by using quantitative ELISA (Supplementary Table 3, available at https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348). The reproducibility of the ELISA for the validation of plasma proteins was >0.9 (rysunek uzupełniający 13, dostępny pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Potwierdzono podwyższone poziomy HABP2, TNC i SERPINA3 w osoczu w grupie chorych na ChAD w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną (ryc. 6A) oraz ich korelację z ciężkością choroby (ryc. 6B i 6C). Porównaliśmy także ekspresję HABP2, ocenianą za pomocą testu ELISA, pomiędzy pacjentami z ChAD (n=39) a grupami kontrolnymi pacjentów z zapaleniem tętnic Takayasu (n=8) i zdrowymi kontrolami (n=10 ) (Dodatkowy rysunek 14 i Dodatkowa tabela 5, dostępne na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://linelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348.). Wyniki wykazały, że stężenie HABP2 było znacznie wyższe w grupie z ChAD niż stężenie w grupie z zapaleniem tętnic Takayasu i zdrowymi grupami kontrolnymi (rysunek uzupełniający 14), co wskazuje na specyficzność HABP2 jako potencjalnego biomarkera w diagnostyce ChAD.

Według skali nasilenia Krause’a objawy naczyniowe mają maksymalną wagę. W związku z tym podzieliliśmy pacjentów na grupy BD naczyniowych i nienaczyniowych BD w zależności od obecności zakrzepicy żylnej, zwężenia tętniczego, okluzji, poszerzenia lub tętniaka (tabela uzupełniająca 4, dostępna pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/1 0.10{{20}}2/art.42348). Porównaliśmy poziomy ekspresji HABP2, TNC i SERPINA3 wśród chorych na BD naczyniowych, BD nienaczyniowych i zdrowych grup kontrolnych. Wyniki pokazały, że poziom tych 3 białek był znacząco podwyższony w grupie z ChAD naczyniowym (Figura 6D). Przeprowadzono również analizę krzywej charakterystyki działania odbiornika dla HABP2, TNC i SERPINA3, w której określono wartość odcięcia, czułość i specyficzność (tabela uzupełniająca 14, dostępna pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/1{{24 }}.1002/art. 42348.). Wyniki wykazały, że HABP2 (pole pod krzywą [AUC] 0,68, czułość 0,69 i swoistość 0,69) i TNC (AUC 0,71, czułość 0,58 i swoistość 0,77) mogą odróżnić BD naczyniową od nienaczyniowej. Porównano poziomy 3 biomarkerów u pacjentów z nieaktywną i aktywną chorobą naczyniową. Wyniki pokazały, że poziomy ekspresji HABP2, TNC i SERPINA3 były konsekwentnie wyższe u pacjentów z ChAD, niezależnie od aktywności ChAD naczyniowej (Uzupełniający Ryc. 15, dostępny na stronie internetowej Arthritis & Rheumatology pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi /10.1002/art.42348).

Rycina 6. Walidacja biomarkerów naczyniowych BD ocenianych metodą ELISA w niezależnej kohorcie. A, C i D, Stężenia w osoczu (Conc) białka wiążącego hialuronan 2 (HABP2), tenascyny C (TNC) i serpiny A3 (1-antychymotrypsyny) (SERPINA3) w zdrowej grupie kontrolnej w porównaniu do wszystkich osób z ChAD pacjentów (A), w porównaniu z pacjentami z ChAD w grupach z łagodną, ​​umiarkowaną i ciężką chorobą (C) oraz w porównaniu z pacjentami z BD nienaczyniowymi (N-VBD) i BD naczyniowymi (VBD) (D). B, Korelacja (Pearsona lub Spearmana) pomiędzy stężeniami HABP2, TNC i SERPINA3 a wynikami ciężkości ChAD. Cieniowanie wskazuje 95% CI. *=P. < 0.05; **=P. < 0.01; ***=P < 0,001; ****=P < 0,0001. Definicje można znaleźć na rysunku 1.

Analiza korelacji między białkami osocza, wynikiem w formularzu aktualnej aktywności choroby Behçeta i danymi klinicznymi. HABP2, TNC i SERPINA3 wykazały podwyższone poziomy w grupie z aktywną ChAD w porównaniu z nieaktywną ChAD i zdrowymi grupami kontrolnymi (P <0.001) (Uzupełniający Ryc. 16A, dostępny na stronie Arthritis & Rheumatology stronie internetowej pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Poziom SERPINA3 był podwyższony w grupach z wysokimi wynikami w formularzu aktualnej aktywności choroby Behçeta (BDCAF) (rysunek uzupełniający 16B). Ponadto u pacjentów z ChAD poziomy SERPINA3 i BDCAF były dodatnio skorelowane (r=0,39, p=0,0036), natomiast poziomy HABP2 i TNC nie wykazywały dodatniej korelacji z wynikami Wyniki BDCAF. Następnie przeanalizowaliśmy korelację między poziomami w osoczu pacjenta a danymi klinicznymi (rysunek uzupełniający 17A i tabela uzupełniająca 15, dostępne pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348.). Na wykresie cięciwy podkreślono współczynnik korelacji r > 0,3. Reprezentatywne wykresy punktowe pokazano na rysunkach uzupełniających S17B – G. Wyniki wykazały, że poziomy HABP2, TNC i SERPINA3 były dodatnio skorelowane z poziomem białka C-reaktywnego, liczbą neutrofili, szerokością dystrybucji czerwonych krwinek, stosunkiem neutrofili do limfocytów, liczbą płytek krwi i szerokością dystrybucji płytek krwi. Wszystkie te wyniki pokazują, że HABP2, TNC i SERPINA3 są funkcjonalnie powiązane ze stanem zapalnym, funkcją śródbłonka i aktywacją płytek krwi i mogą służyć jako biomarkery wskazujące ciężkość i aktywność ChAD, co należy w przyszłości zweryfikować w innej kohorcie klinicznej .

DYSKUSJA

ChAD jest układowym zapaleniem naczyń o niejednorodnym obrazie klinicznym, który odzwierciedla różne mechanizmy chorobotwórcze odpowiedzialne za wywoływanie stanu zapalnego w tętnicach i żyłach każdej wielkości w ludzkich tkankach i narządach. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy duży zestaw rozregulowanych białek (n=220) w grupie pacjentów z ChAD, które uczestniczą w różnych procesach biologicznych, a następnie wykorzystaliśmy analizę bioinformatyczną do określenia interakcji układu odpornościowego-zapalnego, obecności zakrzepicy i patologiczną rolę, w której pośredniczy układ dopełniacza w ChAD. Analiza KEGG ujawniła ponadto związek ChAD z kaskadami dopełniacza i krzepnięcia oraz infekcją bakteryjną. Układ dopełniacza pośredniczy we wrodzonej odporności i zapaleniu w obronie przed patogenami poprzez degranulację, chemotaksję, fagocytozę, szlak sygnałowy receptora komórek B i lizę komórek przez kompleks ataku na błonę, podczas gdy kaskady krzepnięcia biorą udział w odpowiedzi przeciwzapalnej, rozszerzeniu naczyń, zwiększona przepuszczalność śródbłonka i aktywacja płytek krwi. Wykorzystując dane asocjacyjne obejmujące cały genom, Bakir-Gungor i wsp. wykazali, że kaskady dopełniacza i krzepnięcia to jedna z 6 wspólnych ścieżek u tureckich i japońskich pacjentów z ChAD, co potwierdza nasze wyniki na tle genetycznym i dodatkowo demonstruje mechanizm zapalny i waskulopatię/ trombofilia w patogenezie ChAD (28). Odporność zależna od leukocytów, pozytywna regulacja aktywacji komórek i migracja leukocytów wskazują na aktywną odpowiedź immunologiczną i zapalną w ChAD. Neutrofile są aktywowane w celu wytwarzania wolnych rodników tlenowych i zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, powodując uszkodzenia zapalne w komórkach śródbłonka naczyń, zakrzepicę żylną i tętniaki. Reaktywne formy tlenu wytwarzane przez aktywne neutrofile mogą również powodować utlenianie i modyfikację lipidów i lipoprotein, zwłaszcza lipoprotein o małej gęstości, jak wykazano w przypadku zwiększonej peroksydacji lipidów (9,11), co w konsekwencji zwiększa ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (9,10), a w z kolei zwiększa reakcję zapalną (10). Zdarzenie to jest zgodne z obserwowanymi w naszym badaniu biologicznymi procesami regulacji poziomu cząstek lipoprotein w osoczu i przebudową kompleksu białkowo-lipidowego. Dowody z naszego badania są zgodne z ustaleniami Emmi i wsp. łączącymi wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez leukocyty z peroksydacją lipidów w osoczu (8).

Analiza skupień konsensusu z wykorzystaniem proteomiki ujawniła heterogeniczność pacjentów z ChAD. U pacjentów z podtypem I objawy były bardziej nasilone, co można wiązać z aktywnym biologicznym procesem krzepnięcia krwi i aktywacją dopełniacza. Natomiast pacjenci z podtypem III mieli stosunkowo łagodne objawy, a odpowiedź zapalna mogła być głównym procesem patologicznym w tej podgrupie. Ponadto zidentyfikowaliśmy charakterystykę proteomiczną pacjentów z ChAD z zajęciem różnych narządów. Nasze analizy bioinformatyczne skutecznie ilustrują funkcje cech białkowych każdego fenotypu narządu, czego przykładem jest związek między autoimmunizacją a fenotypem zapalenia stawów z objawami bólu stawów (29–31). Głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności są poważne zdarzenia naczyniowe, zmiany w oku i zmiany neurologiczne (16). Leczenie ChAD zależy od rodzaju zajętego narządu i ciężkości choroby w obrębie tego układu narządów. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, dotychczas nie jest dostępna żadna celowana terapia ChAD. Nasze wyniki sugerują, że procedury diagnostyczne i metody leczenia poszczególnych ChAD mogą się różnić ze względu na heterogeniczność mechanizmów chorobotwórczych. Niektóre kluczowe białka mogą być lekami docelowymi dla fenotypów, w tym zmian żołądkowo-jelitowych, nerwowych, ocznych, stawowych i naczyniowych.

Odsetek pacjentów z ChAD wśród różnych ras i grup etnicznych waha się od 7,7% do 43% (32); choroba prawie zawsze wiąże się z zakrzepicą tętniczo-żylną i/lub tętniakiem wysokiego ryzyka, dużym nasileniem choroby i skumulowanym 5-rocznym współczynnikiem nawrotów wynoszącym 38,4% (33). Uważa się, że czynniki odpornościowe i zapalne przyczyniają się do zajęcia naczyń i objawów ChAD. Wiadomo, że uszkodzenie komórek śródbłonka powoduje skłonność do ryzyka zakrzepicy (34). Co więcej, uszkodzenie ścian naczyń w następstwie zwłóknienia może prowadzić do osłabienia ścian tętnic i ich rozszerzenia, co może skutkować powstaniem tętniaków (35,36). Nieregularności, zwężenia i okluzja mogą być również wywołane podczas ostrego zapalenia i po zwłóknieniu (37), podczas gdy przewlekłe zapalenie dodatkowo sprzyja dysfunkcjonalnym właściwościom rozszerzającym naczynia śródbłonka (38). HABP2, zwana także proteazą aktywującą czynnik VII, została pierwotnie odkryta dzięki jego zdolności do wiązania się z kwasem hialuronowym, glikozaminoglikanem odgrywającym rolę w regulacji bariery komórek śródbłonka (39) i bierze udział w krzepnięciu krwi i fibrynolizie (40). Wcześniejsze badania donosiły, że HABP2 może aktywować zapalenie, apoptozę i wzrost komórek w mięśniach gładkich naczyń i komórkach śródbłonka (41–43) i może służyć jako regulator integralności naczyń i przepuszczalności przez receptory aktywowane proteazami (PAR; podobne do trombiny )/RhoA/Szlak sygnałowy kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (44). Wyciszanie (przy użyciu małego interferującego RNA) HABP2 lub PAR/RhoA/ROCK hamuje przerwanie bariery komórek śródbłonka za pośrednictwem HABP2-(44). TNC to prozapalna glikoproteina macierzy zewnątrzkomórkowej, która przyczynia się do tworzenia i pękania blaszek poprzez aktywację płytek krwi lub regulację w dół tkankowego aktywatora plazminogenu (45). Poziomy TNC w surowicy korelowano z ciężkością miażdżycy (46) i wykazano, że przejściowa ekspresja TNC jest zwiększona podczas uszkodzenia naczyń, ale ustępuje po zakończeniu naprawy (45).

SERPINA3, znana również jako 1-antychymotrypsyna, hamuje kilka proteaz serynowych, zwłaszcza katepsynę G (47). Oprócz komórek zapalnych, mniej kurczliwe komórki mięśni gładkich można odróżnicować w kierunku fenotypu podobnego do makrofagów, który może być również źródłem cytokin i SERPINA3 w miejscu uszkodzenia ściany naczynia (48). Poprzednie badania wykazały, że aktywna rola SERPINA3 w negatywnej regulacji proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń (49) lub hamowaniu akumulacji neutrofili (47) może przewidywać wystąpienie niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych. Jednakże nie jest jasne, czy SERPINA3 odgrywa rolę w patogenezie zapalenia naczyń u pacjentów z ChAD, czy też jest produktem procesu chorobotwórczego. W szczególności kwas hialuronowy będący lekiem HABP2 jest anionowym, niesiarczanowanym glikozaminoglikanem wykazującym działanie przeciwzapalne, gojenie się ran, regenerację tkanek i inne ważne właściwości; Kwas hialuronowy badano w leczeniu raka, okulistyce, artrologii, pneumonologii, rynologii i urologii oraz w innych zastosowaniach (50). Istnieje kilka małych cząsteczek (octan cynku, siarczan cynku, cynk, chlorek cynku) ukierunkowanych na SERPINA3 (tabela uzupełniająca 12, dostępna pod adresem https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Wyniki te pokazują, że biomarkery zidentyfikowane w naszej pracy mogą również służyć jako cele w opracowywaniu nowych terapii dla pacjentów z ChAD. Nasze badanie ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, ograniczono liczbę próbek osocza; biomarkery zidentyfikowane w naszym badaniu należy zweryfikować w innej i większej kohorcie z różnymi chorobami autozapalnymi i autoimmunologicznymi jako grupą kontrolną. Po drugie, wyniki należy zweryfikować w kohortach pacjentów z ChAD, którzy nie byli wcześniej leczeni. Po trzecie, w przyszłych badaniach z wykorzystaniem modeli komórkowych i zwierzęcych należy zbadać funkcje biologiczne białek biomarkerowych w patogenezie ChAD.

Podsumowując, jest to, według naszej wiedzy, pierwsze badanie kompleksowo analizujące charakterystykę proteomiczną ChAD przenoszonego na narządy. Wyniki dostarczają fundamentalnych informacji na temat heterogeniczności i patogenezy ChAD oraz podkreślają białka osocza (HABP2, TNC i SERPINA3) jako potencjalne biomarkery do przyszłej oceny klinicznej i leczenia ChAD naczyniowych.

BIBLIOGRAFIA

1. Bas¸ Y, Seçkin HY, Kalkan G i in. Badanie choroby Behçeta i częstości nawracającego aftowego zapalenia jamy ustnej: najwyższa częstość występowania w Turcji. Balkan Med J 2016;33:390–5.

2. Lee HJ, Kim JH, Kim SW i in. Analiza proteomiczna amyloidu surowicy jako potencjalnego markera jelitowej choroby Behçeta. Dig Dis Sci 2017;62:1953–62.

3. Lopalco G, Lucherini OM, Lopalco A i in. Sygnatury cytokin w chorobie Behçeta błon śluzowych i oczu. Przedni Immunol 2017; 8:200.

4. Xu M, Deng J, Xu K i in. Dogłębna proteomika surowicy ujawnia biomarkery ciężkości łuszczycy i reakcji na tradycyjną medycynę chińską. Teranostyka 2019;9:2475–88.

5. Geyer PE, Voytik E, Treit PV i in. Profilowanie proteomu osocza w celu wykrywania i unikania błędów związanych z próbką w badaniach biomarkerów. EMBO Mol Med 2019;11:e10427.

6. Mao L, Dong H, Yang P i in. MALDI-TOF/TOF-MS ujawnia podwyższony poziom haptoglobiny i amyloidu A w surowicy w chorobie Behceta. J Proteome Res 2008;7:4500–7.

7. Piñero J, Ramírez-Anguita JM, Saüch-Pitarch J i in. Platforma wiedzy DisGeNET dotycząca genomiki chorób: aktualizacja 2019. Kwasy nukleinowe Res 2020;48:D845–55.

8. Emmi G, Bagni G, Lastraioli E i in. Unikalny profil krążącego miRNA podkreśla zapalenie zakrzepowe w zespole Behçeta. Ann Rheum Dis 2022;81:386–97.

9. Orem A, Yandi YE, Vanizor B i in. Ocena autoprzeciwciał przeciwko oksydacyjnie modyfikowanej lipoproteinie o małej gęstości (LDL), podatności LDL na utlenianie, poziomu lipidów w surowicy i wodoronadtlenku lipidów, całkowitego statusu antyoksydacyjnego, aktywności enzymów antyoksydacyjnych i dysfunkcji śródbłonka u pacjentów z chorobą Behçeta. Clin Biochem 2002; 35:217–24.

10. Kayatas K, Karatoprak C, Cebeci F i in. Obecność niskiego poziomu lipidów u pacjentów z chorobą Behceta jako ochraniacz przed miażdżycą. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2013;17:2330–4.

11. Buldanlioglu S, Turkmen S, Ayabakan HB i in. Tlenek azotu, peroksydacja lipidów i system obrony antyoksydacyjnej u pacjentów z aktywną lub nieaktywną chorobą Behçeta. Br J. Dermatol 2005;153:526–30.

12. Cho SB, Zheng Z, Ahn KJ i in. Reaktywność IgA surowicy przeciwko GroEL Streptococcus sanguinis i ludzkiej heterogennej jądrowej rybonukleoproteiny A2/B1 u pacjentów z chorobą Behçeta. Br J. Dermatol 2013;168:977–83.

13. Zheng Z, Sohn S, Ahn KJ i in. Reaktywność surowicy wobec białka UL48 wirusa opryszczki pospolitej typu 1 u pacjentów z chorobą Behçeta i mysim modelu choroby Behçeta. Acta Derm Venereol 2015;95:952–8.

14. Lule S, Colpak AI, Balci-Peynircioglu B i in. Surowica z chorobą Behçeta jest immunoreaktywna w stosunku do podłoża neurofilamentowego, które ma wspólne epitopy z bakteryjnym HSP-65, przypuszczalnym czynnikiem wyzwalającym. J Autoimmun 2017; 84: 87–96.

15. Tong B, Liu X, Xiao J i in. Immunopatogeneza choroby Behceta. Przedni Immunol 2019;10:665.

16. Greco A, De Virgilio A, Ralli M i in. Choroba Behçeta: nowe spojrzenie na patofizjologię, cechy kliniczne i możliwości leczenia. Autoimmun Rev 2018;17:567–75.

17. Marta M, Santos E, Coutinho E i in. Rola infekcji w chorobie Behçeta i zespole neuro-Behçeta. Autoimmun Rev 2015;14:609–15.

18. Hatemi G, Bahar H, Uysal S i in. Krostkowe zmiany skórne w zespole Behceta nie są jałowe. Ann Rheum Dis 2004;63:1450–2.

19. Galeone M, Colucci R, D'Erme AM i in. Potencjalna etiologia zakaźna choroby Behçeta. Patolog Res Int 2012;2012:595380.

20. Karaca M, Hatemi G, Sut N i in. Skupisko zmian grudkowo-krostkowych/zapalenia stawów w zespole Behçeta również skupia się w rodzinach. Reumatologia (Oxford) 2012;51:1053–60.

21. Tascilar K, Melikoglu M, Ugurlu S i in. Zajęcie naczyń w zespole Behçeta: retrospektywna analiza skojarzeń i przebiegu w czasie. Reumatologia (Oxford) 2014;53:2018–22.

22. Zou J, Luo JF, Shen Y i in. Analiza skupień fenotypów pacjentów z zespołem Behçeta: duże badanie kohortowe przeprowadzone w ośrodku referencyjnym w Chinach. Zapalenie stawów Res Ther 2021;23:45.

23. Soejima Y, Kirino Y, Takeno M i in. Zmiany w proporcji klastrów klinicznych przyczyniają się do ewolucji fenotypowej choroby Behçeta w Japonii. Zapalenie stawów Res Ther 2021;23:49.

24. Leiba M, Seligsohn U, Sidi Y i in. Czynniki trombofilowe nie są główną przyczyną zakrzepicy w chorobie Behçeta. Ann Rheum Dis 2004;63:1445–9.

25. Becatti M, Emmi G, Silvestri E i in. Aktywacja neutrofili sprzyja utlenianiu fibrynogenu i tworzeniu się skrzeplin w chorobie Behçeta. Nakład 2016;133:302–11.

26. Zheng W, Wu X, Goudarzi M i in. Zmiany metaboliczne związane z chorobą Behçeta. Zapalenie stawów Res Ther 2018;20:214.

27. Xu J, Su G, Huang X i in. Analiza metabolomiczna cieczy wodnistej pozwala zidentyfikować nieprawidłowy metabolizm aminokwasów i kwasów tłuszczowych w chorobie Vogta Koyanagi-Harady i Behceta. Przedni Immunol 2021;12:587393.

28. Bakir-Gungor B, Remmers EF, Meguro A i in. Identyfikacja możliwych szlaków chorobotwórczych w chorobie Behçeta przy użyciu danych z badań asocjacyjnych obejmujących cały genom, pochodzących z dwóch różnych populacji. Eur J. Hum Genet 2015;23:678–87.

29. Tong D, Lönnblom E, Yau AC i in. Wspólny epitop kolagenu typu XI i typu II jest rozpoznawany przez patogenne przeciwciała u myszy i ludzi chorych na zapalenie stawów. Przedni Immunol 2018;9:451.

30. Durlik-Popinska K, _ Żarnowiec P, Lechowicz Ł, et al. Przeciwciała wyizolowane od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów przeciwko lipopolisacharydowi Proteus mirabilis O3 (S1959) zawierającemu lizynę mogą reagować z kolagenem typu I. Int J Mol Sci 2020;21:9635.

31. Jung JH, Han KD, Lee YB i in. Choroba Behçeta jest powiązana ze stwardnieniem rozsianym i reumatoidalnym zapaleniem stawów: koreańskie badanie populacyjne. Dermatologia 2021:1–6.

32. Düzgün N, Ates A, Aydintug OT i in. Charakterystyka zajęcia naczyń w chorobie Behçeta. Scand J Rheumatol 2006; 35: 65–8.

33. Tascilar K, Melikoglu M, Ugurlu S i in. Zajęcie naczyń w zespole Behçeta: retrospektywna analiza skojarzeń i przebiegu w czasie. Reumatologia (Oxford) 2014;53:2018–22.

34. Le Joncour A, Martos R, Loyau S i in. Krytyczna rola zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilów (NET) u pacjentów z chorobą Behceta. Ann Rheum Dis 2019;78:1274–82.

35. Al-Basheer M, Hadadin F. Typ powstawania tętniaka w chorobie naczyniowej - choroba Behceta. Krąg płuc serca 2007; 16: 407–9.

36. Chambers JC, Haskard DO, Kooner JS. Funkcja śródbłonka naczyń i mechanizmy stresu oksydacyjnego u pacjentów z zespołem Behçeta. J Am Coll Cardiol 2001; 37: 517–20.

37. Demirtürk OS, Tünel HS, Alemdaroglu U. Naczyniowe objawy choroby Behçeta. W: Gonul M, Kartal S, red. Choroba Behceta. Londyn: IntechOpen; 2017.

38. Aksu K, Donmez A, Keser G. Zakrzepica wywołana stanem zapalnym: mechanizmy, powiązania chorobowe i leczenie. Curr Pharm Des 2012;18:1478–93.

39. Choi-Miura NH, Tobe T, Sumiya J i in. Oczyszczanie i charakterystyka nowego białka wiążącego hialuronian (PHBP) z ludzkiego osocza: zawiera ono trzy EGF, domenę kringle i proteazę serynową, podobne do aktywatora czynnika wzrostu hepatocytów. J Biochem 1996;119: 1157–65.

40. Kanse SM, Parahuleva M, Muhl L i in. Proteaza aktywująca czynnik VII (FSAP): funkcje naczyniowe i rola w miażdżycy. Thromb Haemost 2008;99:286–9.

41. Byskov K, Boettger T, Ruehle PF i in. Proteaza aktywująca czynnik VII (FSAP) reguluje ekspresję genów zapalnych w mięśniach gładkich naczyń i komórkach śródbłonka. Miażdżyca 2017;265: 133–9.

42. Parahuleva MS, Maj R, Hölschermann H i in. Regulacja funkcji monocytów/makrofagów przez proteazę aktywującą czynnik VII (FSAP). Miażdżyca 2013;230:365–72.

43. Kannemeier C, Al-Fakhri N, Preissner KT i in. Proteaza aktywująca czynnik VII (FSAP) hamuje proliferację komórek za pośrednictwem czynnika wzrostu i migrację komórek mięśni gładkich naczyń. FASEB J 2004;18: 728–30.

44. Mambetsariev N, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B i in. Białko wiążące kwas hialuronowy 2 jest nowym regulatorem integralności naczyń. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010;30:483–90.

45. Midwood KS, Hussenet T, Langlois B i in. Postępy w biologii tenascyny-C. Cell Mol Life Sci 2011;68:3175–99.

46. ​​Gao W, Li J, Ni H i in. Tenascyna C: potencjalny biomarker do przewidywania ciężkości miażdżycy naczyń wieńcowych. J Miażdżycowy Thromb 2019;26:31–8.

47. Sanchez-Navarro A, Gonzalez-Soria I, Caldiño-Bohn R i in. Zintegrowane spojrzenie na serpiny w zdrowiu i chorobie: wkład SerpinA3. Am J Physiol Cell Physiol 2021;320:C106–18.

48. Sorokin V, Woo CC. Rola Serpiny3 w biologii naczyń. Int J. Cardiol 2020;304:154–5.

49. Qian LL, Ji JJ, Guo JQ i in. Ochronna rola serpiny3c jako nowego inhibitora trombiny przeciwko miażdżycy u myszy. Clin Sci (Londyn) 2021;135:447–63.

50. Fallacara A, Baldini E, Manfredini S i in. Kwas hialuronowy w trzecim tysiącleciu. Polimery (Bazylea) 2018;10.