Markery jakości Cistanches Herba oparte na zależności widma przeciwutleniaczy

Abstrakcyjny

Cel: Opracowanie metody badawczej w zakresie markerów jakości (Q-markerów).Cistanches Herba(CH)na podstawieZwiązek spektrum przeciwutleniaczy z efektem, stanowiąc podstawę do badań jego substancji farmakologicznych i kontroli jakości. Metody: Do ustalenia profili odcisków palców dla 10 partii CH zastosowano ultrawysokosprawną chromatografię cieczową (UPLC). Ustalono model uszkodzeń oksydacyjnych komórek przy użyciu H2O2, a zdolność przeciwutleniającą CH określono na podstawie połowy maksymalnego hamującego stężenia reaktywnych form tlenu, a także poziomów ponadtlenkowej mutazy i katalazy jako wskaźników farmakologicznych. Zależność widmo-efekt skonstruowano za pomocą analizy składowych głównych, analizy korelacji Pearsona i analizy regresji metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów. Składniki aktywne poddano walidacji farmakologicznej. Wyniki: Przy użyciu UPLC ustalono profile odcisków palców dla CH, identyfikując 17 typowych pików. Na podstawie analizy korelacji widma i efektu wybrano dziewięć składników. Wyniki walidacji farmakologicznej wykazały, że kwas genipozydowy, 8-kwas epiloganowy,echinakozyd, akteozyd,izoakteozyd, Itubulozyd Awykazywał działanie przeciwutleniające w sposób zależny od stężenia. Wniosek: W badaniu tym zbadano markery Q dla CH w oparciu o zależność widmo-efekt, dostarczając informacji referencyjnych na temat podstaw substancji farmakologicznej i poprawy standardów jakości.

Słowa kluczowe:Cistanches Herba; znacznik Q;zależność widmo-efekt; przeciwutleniacz

ORGANICZNY EKSTRAKT Z CISTANCHE Z 30% ECHINAKOZYDEM I 12% AKTEOZYDEM NA FUNKCJĘ NEREK

Cistancheto suszona mięsista łodyga z łuskowatymi liśćmi Cistanche Deserticola YCMa lub Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, rośliny należącej do rodzaju Cistanche z rodziny Orobanchiaceae. Po raz pierwszy została odnotowana w „Materia Medica Shen Nong” i jest wymieniona jako najwyższa [1]. Jest ciepły z natury, słodki i słony w smaku; wraca do meridianów nerek i jelita grubego; ma działanie odżywcze Yang nerek, uzupełnia esencję i krew, nawilża jelita i jest środkiem przeczyszczającym, a także jest ważnym lekiem tonizującym nerki i uzupełniającym esencję [2-3). Nerki przechowują esencję, a esencja i krew pochodzą z tego samego źródła. Jeśli brakuje esencji i krwi, będzie to miało wpływ na ogólną aktywność życiową ludzkiego ciała; szpik wytwarzający esencję jest przechowywany w kościach, a mózg jest morzem szpiku. Jeśli esencja nerkowa jest niewystarczająca, kości stracą składniki odżywcze, a mózg będzie niedoborowy, co spowoduje zmiany zwyrodnieniowe kości, takie jak luźna tekstura, utrata zębów, utrata pamięci, demencja i obniżona funkcja odpornościowa [4-6). Cistanche desericola zawiera glikozydy fenyloetanolu, irydoidy, lignany i inne składniki strukturalne, w tym echinaceazyd, werbaskozyd, isorbaskozyd, kwas genipinowy i kwas 8-episstryanowy. , tubulina A itp. [7]. Obecna kontrola jakości Cistanche Deserticola w wydaniu „Farmakopei Chińskiej Republiki Ludowej” na rok 2020 określa jedynie zawartość echinaceazydu i werbaskozydu, co nie może w pełni odzwierciedlać wieloskładnikowych i wielokierunkowych właściwości tradycyjnej medycyny chińskiej. , co nie sprzyja jego kontroli i ocenie jakości.

W celu podniesienia poziomu kontroli jakości tradycyjnej medycyny chińskiej i optymalizacji oceny jakości tradycyjnej medycyny chińskiej, akademik Liu Changxiao zaproponował nową koncepcję markera jakości (Q-marker) tradycyjnej medycyny chińskiej [8]. Wśród nich „skuteczność” jest głównym elementem „Pięciu zasad” markera Q [9] i stanowi także rdzeń oceny jakości tradycyjnych chińskich leków.

W świetle obecnego stanu badań nad słabą korelacją między standardami jakości a skutecznością leku, badanie markerów Q tradycyjnych chińskich leków i ustanawianie bardziej naukowych i rozsądnych standardów jakości ma ogromne znaczenie dla poprawy jakości tradycyjnych chińskich leków. Zależność widma od efektu polega na powiązaniu pików chromatograficznych odcisków palców tradycyjnej medycyny chińskiej z konkretnymi danymi farmakodynamicznymi w celu znalezienia skutecznych substancji tradycyjnej medycyny chińskiej, odzwierciedlając w ten sposób nieodłączną jakość tradycyjnej medycyny chińskiej [10]. Utworzenie matematycznego modelu wydajności widmowej może wyjaśnić QMarker tradycyjnej medycyny chińskiej z perspektywy „holistycznego spojrzenia”, zapewniając więcej odniesienia do późniejszej kontroli jakości tradycyjnej medycyny chińskiej, formułowania standardów jakości i sprawdzania składników aktywnych. W badaniu tym wykorzystano odciski palców w połączeniu ze współczynnikiem połowy hamowania reaktywnych form tlenu (ROS IC50), zawartością dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) w celu zbadania zależności widma od efektu w tradycyjnej medycynie chińskiej oraz wykorzystano analizę głównych składowych (PCA)), analizę korelacji Pearsona (PCC) i analizę regresji metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów (PLS) w celu kompleksowej analizy markera Q Cistanche Deserticola w celu zapewnienia podstawy do kontroli jakości.

1 materiał

1.1 Próbka

Cistanche desericolazebrano w hrabstwie Yutian w Xinjiangu i na obszarze sadzenia Cistanche Deserticola Dobrej Praktyki Rolniczej (GAP) w Mongolii Wewnętrznej. Został zidentyfikowany przez badacza Zhanga Tiejuna z Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. jako Cistanche tubulosa (Schenk) Wight i Cistanche Deserticola.

YC Ma, szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1.

1.2 Testuj lekarstwa

Echinaceazyd (numer serii: 111670-201907, czystość: 91,8%) i werbaskozyd (numer serii: 111530-201914, czystość: 95,2%) zakupiono od China Institute of Food and Drug Control; izoreskozyd (numer serii: 61303-13 -7), salidrozyd (numer serii: 10338-51-9), 8-kwas epistrychnowy (numer serii: 82509-41-9), kwas genipinowy (numer serii: Z24A10X95926) , tuberozynę B (numer serii: 112516-04-08), 2-glikozyd acetyloeugenolu (numer serii: 94492-24-7) zakupiono od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., czystość większa lub równa 98%; Glikozyd cistanche A (numer serii: MUST -20062806, czystość: 98,51%) i waskulinę A (numer partii: MUST19110102, czystość: 98,57%) zakupiono od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; chromatograficznie czysty acetonitryl i kwas mrówkowy zakupiono od firmy Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Woda oczyszczona (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Witamina E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

Sulfotlenek dimetylu (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, USA); CellTiter 96® AQueous zestaw do wykrywania proliferacji komórek w pojedynczym roztworze (G3580, Promega Company, USA); Zestaw do wykrywania CAT (S0051), zestaw do wykrywania aktywności SOD S0101M) i zestaw do wykrywania ROS (S0033S) zakupiono od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumenty

Ultrawysokosprawny chromatograf cieczowy Waters PDA klasy H (Waters Company, USA); waga elektroniczna Sartorius BT25S (Sartorius Company, Niemcy); szybka wirówka stołowa H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Czytnik mikropłytek (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Mikroskop biologiczny WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 komórki

W tym eksperymencie wykorzystano ludzkie embrionalne komórki nerek HEK 293, które zakupiono z banku komórek Chińskiej Akademii Nauk.

2 metody

2.1 Ustalenie mapy linii papilarnych

2.1.1 Przygotowanie roztworu testowego: Odważyć 2 g materiału leczniczego Cistanche Deserticola, dodać 10-krotną ilość wody, podgrzać i 3 razy podgrzać pod chłodnicą zwrotną, każdorazowo przez 1 godzinę, wirować przy 1.0 ×105r·min-1 przez 15 minut (promień odśrodkowy wynosi 300 mm), połączyć supernatanty i zatężyć, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu masowym 100 mg·mL-1, rozcieńczyć go 10 razy, i przefiltrować przez mikroporowatą membranę filtrującą o średnicy porów 0,22 µm, aby ją otrzymać.

2.1.2 Przygotowanie mieszanego roztworu odniesienia

Weź 8-kwas epistrynowy, salidrozyd, echinaceazyd, glikozyd cistanche A, kwas genipinowy, werbaskozyd, antocyjanozyd A, isorbaskozyd i 2'-acetyloeugenol. Glikozyd i angiozyd B odmierzono w odpowiednich ilościach i dokładnie zważono. Dodać 50% roztwór metanolu do rozpuszczenia i przygotować mieszany roztwór substancji odniesienia o stężeniu masowym 20 µg·mL–1.

2.1.3 Warunki chromatograficzne

Kolumna ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); fazą ruchomą jest acetonitryl (A) ~ 0.1% roztwór kwasu mrówkowego (B), program elucji gradientowej (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6~10 min, 8% ~ 15%A ; 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); długość fali detekcji wynosi 237 nm; natężenie przepływu wynosi 0,4 mL·min –1; temperatura kolumny wynosi 40 stopni; objętość wstrzyknięcia wynosi 3 µl.

2.1.4 Wybór piku odniesienia

W chromatogramie Cistanche Deserticola za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) jako pik odniesienia widma odcisków palców wybrano pik o największym stosunku powierzchni piku, umiarkowanym czasie retencji i dobrym rozdzieleniu.

2.1.5 Przegląd metodologiczny

Test precyzji: Pobrać próbkę T1 i przygotować roztwór testowy zgodnie z metodą opisaną w 2.1.1. Wstrzyknąć próbkę 6 razy w sposób ciągły i zapisać odcisk palca. Wyniki pokazują, że względna powierzchnia piku RSD każdego piku wynosi 0,10% ~ 4,61%, a względny czas retencji RSD wynosi 0,08% ~ 1,32%, co wskazuje, że instrument ma dobre precyzja.

Badanie powtarzalności: Pobrać próbkę T1 i przygotować równolegle 6 próbek roztworu testowego zgodnie z metodą opisaną w 2.1.1 i wstrzyknąć próbkę w sposób ciągły. Wyniki pokazują, że względna powierzchnia piku RSD każdego piku chromatograficznego wynosi 1,35% ~ 4,80%, a względny czas retencji RSD wynosi 0,10% ~ 1,80%, co spełnia wymagania odcisku palca i pokazuje, że powtarzalność instrumentu jest dobry.

Test stabilności: Pobrać próbkę T1 i przygotować roztwór testowy zgodnie z metodą opisaną w 2.1.1, wstrzyknąć próbki do badania po 0, 2, 4, 8 i 12 godzinach i zarejestrować odcisk palca. Obliczony RSD względnej powierzchni piku każdego piku chromatograficznego wynosi 0,53% ~ 4,82%, a RSD względnego czasu retencji wynosi 0,09% ~ 2,17%, co spełnia wymagania odcisku palca i wskazuje, że badany produkt jest stabilny w ciągu 12 godzin.

2.2 Badania nad działaniem przeciwutleniającym Cistanche desericola

2.2.1 Przygotowanie ługu macierzystego Cistanche desericola

Pobrać ług macierzysty zgodnie z ppkt 2.1.1, przefiltrować i wysterylizować, a przed użyciem rozcieńczyć pożywką hodowlaną do wymaganego stężenia.

2.2.2 Cistanche Deserticola i kontrola pozytywna

Wpływ VE na żywotność komórek HEK 293 ustalono jako grupa normalna (zawiesina komórek), grupa, której podawano Cistanche desericola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), grupa VE (20, 40, 60 , 80, 100 µmol·L–1), ustawić 6 duplikatów dołków dla każdego stężenia, hodować przez 24 h, dodać 20 µl odczynnika CellTiter 96® AQueous do każdego dołka w celu sprawdzenia żywotności komórek, kontynuować hodowlę przez 2 h, i użyć czytnika mikropłytek do wykrycia żywotności komórek przy 490 nm. Wartość absorbancji (OD) każdej studzienki wykorzystano do obliczenia współczynnika przeżycia komórek zgodnie ze wzorem (1). Współczynnik przeżycia (%)=(grupa eksperymentalna OD/grupa ślepa OD) × 100% (1)

2.2.3 Cistanche Deserticola po indukcji H2O2

Wpływ ROS na komórki HEK 293. Komórki podzielono na grupę normalną (zawiesina komórkowa) i grupę, której podawano Cistanche Deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche Deserticola i 60 µm·L–1 H2O2) i hodowano przez 24 godziny. W kolejnych operacjach postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do wykrywania ROS, bezpośrednio obserwuj barwienie komórek pod mikroskopem i użyj czytnika mikropłytek, aby wykryć intensywność fluorescencji każdej grupy. W ustawieniach parametrów wykorzystano długość fali wzbudzenia 488 nm i długość fali emisji 525 nm. Doświadczenie powtórzono trzykrotnie.

2.2.4 Para Cistanche Deserticola

Wpływ H2O2 na SOD w ogniwach HEK 293. Komórki podzielono na grupę normalną (zawiesina komórkowa), grupę modelową (60 µm·L–1 H2O2), grupę VE (60 µm·L–1 VE i 60 µm·L–1 H2O2), grupę, której podawano Cistanche Deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche desericola i 60 µm·L–1 H2O2), zebrać komórki po 24 godzinach hodowli, dodać roztwór do przygotowania próbki SOD w celu lizy komórek i wirować w temperaturze 4 stopni i 12000 obr./min{{22} } min (promień wirowania wynosi 300 mm), pobrać supernatant jako próbkę do badania i postępować zgodnie z instrukcjami zestawu do wykrywania SOD w kolejnych operacjach. Doświadczenie powtórzono trzykrotnie.

2.2.5 Cistanche desericola po indukcji H2O2

Wpływ CAT na komórki HEK 293 potraktowano zgodnie z metodą opisaną w 2.2.4 i pogrupowano w grupy. Po zabiegu dodać roztwór do lizy, wirować przy 4 stopniach i 12 000 obr./min-1 przez 10 minut (promień odśrodkowy wynosi 300 mm), pobrać supernatant i postępować zgodnie z instrukcjami zestawu do detekcji CAT w przypadku kolejnych operacji . Doświadczenie powtórzono trzykrotnie.

2.2.6 Analiza statystyczna

Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SPSS 26.0. Każdą grupę danych reprezentowano za pomocą (±±(). Jednoczynnikową analizę wariancji przeprowadzono na danych zgodnych z rozkładem normalnym. Jeżeli wariancje były równe, stosowano metodę najmniejszej znaczącej różnicy. Jeżeli wariancje były nierówne, do tworzenia wykresów wykorzystano metodę T3 firmy Dunnett, a do tworzenia wykresów wykorzystano program GraphPad Prism 8, a P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analiza korelacji widma i efektu przeciwutleniacza Cistanche desericola

2.3.1 PCA Powierzchnie pików wspólnych pików 10 partii Cistanche Deserticola, w których stwierdzono odciski palców, znormalizowano według wartości Z i przekształcono w macierz danych rzędu 10×17, która została zaimportowana do oprogramowania SPSS 26.0 dla PCA.

2.3.2 PCC

Do przeprowadzenia analizy dwuwymiarowej w celu zbadania zależności wydajności widmowej między odciskami palców Cistanche Deserticola a przeciwutleniaczami wykorzystano program SPSS 26.0. Testowanie istotności przeprowadzono za pomocą testu dwustronnego (T), w którym P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Zaimportuj wyniki eksperymentalne standaryzowanej powierzchni piku Cistanche Deserticola i przeciwutleniacza do oprogramowania SIMCA-P 14.1, ustaw powierzchnię piku jako zmienną X i ustaw indeks farmakodynamiczny jako zmienną Y, aby wykonać PLS.

2.4 Weryfikacja aktywności przeciwutleniającej markera Q Cistanche Deserticola

2.4.1 Przygotowanie roztworu macierzystego składników aktywnych. Dokładnie odważ odpowiednie ilości kwasu genipinowego, 8-kwasu epistrynowego, echinaceazydu, werbaskozydu, izorebaskozydu i antocyjanozydu A i dodaj DMSO w celu rozpuszczenia ich w 10 mmol·L-1 roztworze referencyjnym.

2.4.2 Wpływ składników aktywnych na cytotoksyczność HEK 293.

Po inkubacji komórek HEK 293 przez 24 godziny dodać roztwory substancji czynnej o różnym stężeniu zgodnie z 2.4.1 do każdej studzienki (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µl, ciągła stymulacja

Po inkubacji komórek przez 24 godziny dodano odczynnik CellTiter 96® AQueous w postaci pojedynczego roztworu w celu sprawdzenia żywotności komórek.

2.4.3 Działanie antyoksydacyjne składników aktywnych na komórki HEK 293 indukowane H2O2-.

Komórki są pogrupowane w następujący sposób: grupa normalna, grupa modelowa i grupa VE są pogrupowane zgodnie z 2.2.4. Grupa eksperymentalna (0.781, 1,563, 3,125 µm·L–1 skład aktywności i 60 µm·L–1 H2O2), hodowana przez 24 godziny. Oznaczyć wewnątrzkomórkowe poziomy ROS, zawartość enzymów SOD i CAT zgodnie z metodami odpowiednio w punktach 2.2.3, 2.2.4 i 2.2.5.

Wsparcie dla Wecistanche

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kup więcej szczegółów specyfikacji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop