więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Część: II Objawy nerkowe i pozanerkowe u dorosłej zebry Model cystynozy

2.3.5. Ctns-/- Danio pręgowany ma zwiększoną grubość rogówki

Cystynozawpływa na oczy, powodując nagromadzenie cystyny ​​w kilku tkankach, takich jak tęczówka, spojówka i nabłonek siatkówki, jednak rogówka jest najbardziej dotknięta z powodu gromadzenia się cystyny ​​[19] i wykazuje zwiększoną grubość [20]. Stosując barwienie H&E, zauważyliśmy, że danio pręgowane-/- danio pręgowane wykazywały zwiększoną grubość warstwy zrębowej rogówki w porównaniu z danio pręgowanym typu dzikiego (ryc. 10A, B, E). Jednak nie wykazaliśmy widocznych nieprawidłowości w nabłonku siatkówki u danio pręgowanego (ryc. 10C, D).

Rysunek 9. Średnia prędkość pływania u dzikich i danio pręgowanego. Średnia prędkość jest zmniejszona u danio pręgowanego-/- w porównaniu z dzikim u obu płci. Średnia prędkość pływania jest mierzona w pikselach na sekundę. Każda kropka reprezentuje jedną danio pręgowaną, co daje łącznie n=6 danio pręgowanego typu dzikiego i n=6 ctns−/−18-miesięcznych danio pręgowanego. Dwuczynnikowa ANOVA z testem najmniejszej istotnej różnicy Fishera (PLSD): ** p <>

Rysunek 10. Histologia oka u danio pręgowanego typu dzikiego i ctns−/−. (A, B) Reprezentatywne obrazy rogówki typu dzikiego (A) i ctns-/- (B) 18-miesięcznego danio pręgowanego. Warstwa zrębu rogówki (czarne groty strzałek i czarne linie). Barwienie H&E. Słupki skali reprezentują 50 µm. (C,D) Reprezentatywne obrazy siatkówki danio pręgowanego typu dzikiego (A) i ctns-/- (B). Barwienie H&E. Słupki skali reprezentują 50 µm. (E) Względna kwantyfikacja grubości warstwy zrębowej rogówki. Każda kropka reprezentuje jedną fikcję grubości warstwy zrębowej rogówki. Niesparowany test t z poprawką Welcha, dwustronny: * p <>

2.3.6. Dodatkowe fenotypy zebry Ctns-/-

Oprócz fenotypów wspomnianych powyżej, przeprowadziliśmy analizę histologiczną mózgu i jajnika, nie znajdując różnic między danio pręgowanymi i dzikimi. Co więcej, oceniliśmy długość i wagę danio pręgowanego i typu dzikiego w wieku 18 miesięcy i stwierdziliśmy zwiększoną masę ciała u danio pręgowanego i danio pręgowanego obu płci w porównaniu z danio pręgowanym (rysunek uzupełniający S1).

3. Dyskusja

W ciągu ostatnich dziesięciolecicystynozaprzekształciła się ze śmiertelnej choroby wieku dziecięcego w uleczalne zaburzenie metaboliczne, z którym pacjenci mogą przetrwać do dorosłości i osiągnąć zaawansowany wiek [21, 22]. Dłuższe przeżycie pacjentów ujawniło nowe fenotypy chorób i wywołało nowe pytania dotyczące patogenezy i długofalowych skutków terapii. W związku z tym coraz bardziej istotne staje się badanie dorosłych modeli zwierzęcych cystynozy.

W obecnym badaniu zbadaliśmy nerki i pozanerki przejawy cystynozy w modelu dorosłej ryby w wieku 18 miesięcy, co odpowiada wiekowi człowieka 40–50 lat [23,24]. Po pierwsze, potwierdziliśmy, że model dorosłego danio pręgowanego ctns−/− przedstawia akumulację cystyny ​​w całym ciele i różnych narządach. wnerka, na poziomie histologicznym zaobserwowaliśmy oznaki uszkodzenia PTEC odzwierciedlające się w obecności licznych szklistych kropelek eozynofilowych, wakuoli cytoplazmatycznych i częściowej utraty rąbków szczoteczkowych. Co więcej, samiec danio pręgowanego z grupy CNS-/- rozwinął przerost kłębuszkowy. Na koniec wykazaliśmy, że ekspresja rozszczepionej kaspazy 3 była zwiększona w nerkowym PTEC u danio pręgowanego, co wskazuje, że apoptoza bierze udział w patogenezie cystynozy nefropatycznej u danio pręgowanego. Odkądcystynozapacjenci występują również pozanerkowo objawów, zbadaliśmy wpływ mutacji ctns−/− w innych narządach w naszym modelu danio pręgowanego. Co ciekawe, odkryliśmy, że mutacja ctns-/- powodowała upośledzenie anatomii skóry i wpływała na płodność, aktywność lokomotoryczną i oczy.

Lizosomy są miejscami trawienia wewnątrzkomórkowego i są uważane za żywotnych koordynatorów metabolizmu komórkowego [25]. Będąc lizosomalną chorobą spichrzania, kluczową cechącystynozajest akumulacja cystyny ​​w lizosomach [26,27]. Co ciekawe, stwierdziliśmy 54-krotny wzrost cystyny ​​w całym ciele18-miesięcznej ryby scystynotycznej w porównaniu z typem dzikim, podczas gdy w naszym poprzednim badaniu [10] cystynoza larw danio pręgowanego 6 dni po zapłodnieniu wykazała 13-krotny wzrost. Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że cystyna gromadzi się podczas życia u danio pręgowanego cystynoza. Analiza metodą chromatografii cieczowej i spektrometrią mas potwierdziła, że ​​wśród wszystkich narządównerkasą preferowanym miejscem gromadzenia cystyny. Obrzęk lizosomalny i szklistopodobne kropelki eozynofilowe wewnątrz lizosomów odnotowano w PTEC z ładunkiem cystyny ​​[28, 29], a w ludzkich biopsjach kryształy cystyny ​​pojawiają się jako polimorficzne przestrzenie kształtu w śródmiąższowych makrofagach i cytoplazmie PTEC [27]. W tkance ludzkiej akumulacja i krystalizacja cystyny ​​jest procesem kumulacyjnym zachodzącym w ciągu życia. Inline kryształy cystyny ​​nie zostały wykryte u danio pręgowanego w stadium larwalnym [10], podczas gdy w naszych eksperymentach pilotażowych stwierdziliśmy, że polimorficzny kształt kryształów cystyny ​​pojawia się w wieku 3 i 6 miesięcy i jest wyraźnie widoczny w wieku 18-miesięcy, co sugeruje postępujące pogorszenie skutków cystynozy wnerka.

Kliknij, abyWpływ Cistanche na chorobę nerek

Aby ocenić zmiany histologiczne kłębuszków, zmierzyliśmy pola powierzchni torebki Bowmana, kępki kłębuszków i przestrzeń Bowmana dla danio pręgowanego na przekrojach barwionych PAS. Odkryliśmy, że danio pręgowane i danio pręgowane rozwinęły przerost kłębuszkowy, co sugeruje nadmierną filtrację. Łagodne uszkodzenia kłębuszków obserwowane u danio pręgowanego można przypisać zdolnościom regeneracyjnym danio pręgowanegonerka, możliwość dodawania nowych nefronów, a także naprawy istniejących nefronów [30].

Wykazano, że poza uszkodzeniem histologicznym akumulacja cystyny ​​aktywuje kinazę białkową wywołującą apoptozę w PTEC [12]. W ten sposób oceniliśmy ekspresję rozszczepionej kaspazy-3 w PTEC i stwierdziliśmy, że ctns−/− danio pręgowane wykazują zwiększoną kaspazę-3 i fragmentację jądra. Obecność rozszczepionej kaspazy-3 stwierdzono głównie w komórkach, które akumulowały wakuole cytoplazmatyczne, co sugeruje, że w uszkodzonym PTEC zachodzi apoptoza. Dodatkowym mechanizmem, który może wyjaśniać zwiększoną apoptozę, może być obecność reaktywnych form tlenu z powodu zmniejszonego glutationu związanego z akumulacją cystyny ​​[31]. Konieczne są jednak dalsze badania, aby ocenić, czy ten mechanizm występuje również u danio pręgowanego.

Mimo żenerkisą pierwszymi i najciężej dotkniętymi organami,cystynozato choroba wieloukładowa, w którą zaangażowane są różne narządy, takie jak skóra, gonady, oczy i mięśnie. Z literatury wiadomo, że pacjenci z cystynozą często wykazują przedwczesne starzenie się skóry, blond włosy i jasny kolor skóry [13]. Ten ostatni fenotyp wynika z zaangażowania transportera cystynozyny w regulację syntezy melaniny [32] oraz w utrzymywanie ciemniejszej pigmentacji dzięki nowo odkrytemu transporterowi cysteiny MFSD12 [33]. Co ciekawe, nasz model dorosłej ryby danio pręgowanej ctns−/− wykazał odbarwiony i plamisty wzór skóry oraz zaburzony rozkład melaniny, którego nie zaobserwowano w stadium larwalnym [10].

Dodatkowo,cystynozapowoduje niepłodność u mężczyzn, podczas gdy kobiety są płodne [14]. Najnowsze dane sugerują, że niepłodność może być spowodowana postępującym zwyrodnieniem jąder, prowadzącą do zmiany jakości nasienia, lub niedrożnością niezdefiniowanej części męskiego układu wydalniczego. Zatkane struktury mogą wpływać na jakość nasienia, zwłaszcza w rejonach, w których kanaliki mają bardzo małą średnicę, na przykład retetestis[16]. Ryby bezzbrojne, plemniki do wyrostków genetycznych są bardzo podobne do ssaków; jednak jedną z głównych różnic jest to, że spermatogeneza zachodzi w torbielach [34]. W naszym badaniu stwierdziliśmy zwiększoną liczbę plemników w torbieli plemnikowej u danio pręgowanego, jednak nie znaleźliśmy oznak zwyrodnienia jąder. Opisany fenotyp może więc sugerować niedrożność na poziomie jąder, która prowadzi do mniejszego uwalniania plemników do środowiska, jednak dalsze badania są konieczne, aby potwierdzić tę hipotezę. Na poziomie funkcjonalnym zmniejszona liczba jaj i zmniejszona liczba zapłodnionych jaj wydaje się odzwierciedlać upośledzenie płodności danio pręgowanego.

Kolejna manifestacja klinicznacystynozaNajczęściej dotykającą pacjentów począwszy od drugiej dekady życia jest miopatia, charakteryzująca się zanikiem i osłabieniem mięśni [1]. Co ciekawe, odkryliśmy, że dorosła danio pręgowany w kolorze ctns-/- wykazuje zmniejszoną aktywność lokomotoryczną w porównaniu z grupą kontrolną, co sugeruje upośledzenie funkcji mięśni. Warto zauważyć, że ten fenotyp nie był obecny u larw [10], co sugeruje, że wpływa on na danio pręgowanego w późniejszym stadium choroby. Mimo to w mięśniach nie wykryto widocznych różnic histologicznych. Zmniejszona aktywność lokomotoryczna może wynikać z dysfunkcji mitochondriów, której nie można było wykryć w rutynowych badaniach histologicznych [35–37]. Dlatego też wszechstronna charakterystyka mitochondriów w cystynozie danio pręgowanego wymaga dalszej oceny.

Oprócz wyżej wymienionych fenotypów, kilka badań wykazało, że pacjenci z cystynozą wykazują również objawy oczne, takie jak światłowstręt i kurcz powiek [1], przy czym rogówka jest jedną z najbardziej dotkniętych części oka, co powoduje gromadzenie się kryształów cystyny ​​i zwiększenie grubości [20]. Niewiele jednak wiadomo o przyczynach zwiększonej grubości rogówki. Na przykład sugerowano, że opisany fenotyp jest spowodowany subkliniczną dysfunkcją komórek nabłonka i/lub śródbłonka prowadzącą do obrzęku naczyniowego [20]. W naszym badaniu odkryliśmy, że ctns−/−wyświetlanie dorosłej rogówki wzrasta wraz z grubością warstwy zrębowej rogówki, co wskazuje, że nasz model wykazuje oznaki dysfunkcji rogówki wcystynoza.

Cistanche dlanerkafunkcjonować

Jedna z głównych luk, które należy wypełnić, aby uzyskać kompleksowe zrozumieniecystynozajest brak modelu zwierzęcego, który w pełni rekapituluje ludzką chorobę. Opracowano kilka modeli mysich, wykazujących akumulację cystyny, ale nie dających pełnego obrazunerkowyfenotyp [8,26]. W szczególności mysz C57BL/6 wykazywała akumulację cystyny ​​w kilku narządach, która wzrasta wraz z wiekiem [8]. Ponadto model mysi C57BL/6 wykazuje uszkodzenia kanalików proksymalnych począwszy od wieku 6 miesięcy. Podobnie w naszym modelu zmiany proksymalnych kanalików ulegają z czasem pogorszeniu. Jednak na poziomie kłębuszkowym model mysi C57BL/6 wykazał normalny fenotyp, podczas gdy nasz model dorosłej rybki danio przerost kłębuszkowy. Ponadto model mysi C57BL/6 nie naśladuje upośledzonej płodności obserwowanej u ludzi, podczas gdy model ctns-/-danio pręgowany przedstawia torbiele spermatogenne wzbogacone w plemniki i zmniejszoną produkcję jaj. Na poziomie oka, zarówno mysz[38], jak i model-/-rybii zebry przedstawiają nieprawidłowości w oczach. Wręcz przeciwnie, na poziomie skóry ten model mysi nie wykazuje zaburzonej produkcji melatoniny [8], która pojawia się w modelu dorosłego danio pręgowanego jako niedobarwiony wzór skóry. Wreszcie, na poziomie behawioralnym, nasz model danio pręgowanego ctns-/- wykazuje zmniejszoną aktywność lokomotoryczną, co może być spowodowane upośledzoną funkcją mitochondriów lub może być spowodowane wtórnym efektem zwiększonej masy ciała ucystynozadanio pręgowany. Ogólnie rzecz biorąc, wydaje się, że nasz model danio pręgowanego ctns−/− lepiej odzwierciedla ludzką chorobę. Ostatnio Shimizu i in. ustalił nową kongeniczną mutację Ctnsugl w szczepie szczura, który się przedstawiłnerkowyzmiany i kryształy cystyny ​​w lizosomachnerkakora [7]. Jednak nadal brakuje bardziej szczegółowej charakterystyki modelu. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania i scharakteryzowania nowych modeli funkcjonalnych, które rekapitulują choroby ludzkie.

Podsumowując, wykazaliśmy, że nasz model dorosłego danio pręgowanego ctns-/- odtwarza kilka ludzkich fenotypów piaskownicy cystynowej może być przydatny do badania patogenezy choroby u dorosłych oraz do testowania długoterminowych skutków nowych leków korygujących nerki i pozaustroje.nerkowymanifestacje.

4. Materiały i metody

4.1. Utrzymanie i hodowla danio pręgowanego

Zebrafish był traktowany i utrzymywany zgodnie z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt KU Leuven (zatwierdzenie etyczne nr 142/2019). Do tego badania włączyliśmy danio pręgowanego w wieku 18 miesięcy oraz danio pręgowanego typu dzikiego u obu płci. Szczegóły generowania ctns−/−zebrafish zostały opisane w naszym poprzednim badaniu [10].

4.2. Pomiar cystyny

Poziom cystyny ​​mierzono u osobników bezbraczników (samce typu dzikiego, n=3andctns-/-samce, n=3), a ilość wyrażono jako nmol/mg białek. Najpierw danio pręgowany został uśmiercony przez zanurzenie w metanosulfonianie trikainy MS-222 (300 mg/l), a następnie próbki tkanek poddano działaniu ultradźwięków w obecności 200 µl 5 mM N-etylomaleimidu (NEM, St. Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) firmy Dulbecco, maksymalnie 200 mg tkanki na każdy lizat. Następnie do każdego homogenatu dodano 100 µl 12-procentowego kwasu sulfosalicylowego (SSA) i próbki odwirowano przy 12,000 g przez 10 min, 4°C. Supernatanty zawierające cystynę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy, podczas gdy osady rozpuszczono przez noc w temperaturze 4°C w 300 µl 0,1 M NaOH i utrzymywano w temperaturze -80°C do momentu zmierzenia białka przy użyciu zestawu Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Następnie ilość (nmol) cystyny ​​znormalizowano do ilości (mg) białka z każdej próbki. Następnie 50 µl supernatantu zawierającego cystynę dodawano do 50 µl roztworu wzorca wewnętrznego (Cystyna d6) i worteksowano przez 5 s; następnie mieszaninę wyekstrahowano 200 µl acetonitrylu, worteksowano przez 30 s, a następnie odwirowano przy 16,000 g przez 9 min. Chromatografię cieczową i analizę spektrometrii masowej przeprowadzono za pomocą UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) wyposażonego w źródło ESI-JET-STREAM działające w trybie jonów dodatnich (ESIplus). Do sterowania tym sprzętem i analizy danych wykorzystano oprogramowanie MassHunter (stacja robocza Agilent Technologies, Barcelona, ​​Hiszpania). Zastosowaną kolumną rozdzielającą była InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 x 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz kwasem nadjodowym

Danio pręgowany (samica typu dzikiego, n=3; samiec typu dzikiego, n=3; ctns-/-samica ryby, n=3; ctns-/-samiec, n=3) uśmiercono przez zanurzenie w metanosulfonianu trikainy MS-222 (300 mg/L), a następnie cały danio pręgowany utrwalono w 4% buforowanym paraformaldehydzie (4% PFA) w temperaturze 4°C przez 1 tydzień . Po dwukrotnym przemyciu PBS danio pręgowane przeniesiono do roztworu EDTA (100 mM, pH=8) w celu odwapnienia na kolejny tydzień, a następnie zatopiono w parafinie. Zatopioną w parafinie tkankę danio pręgowanego wycięto (grubość 4-µm) na Leicamikrotom (LeicaBiosystems, Wetzlar, Niemcy). Skrawki wybarwiono H&E i PAS zgodnie ze standardowymi protokołami.

W badaniach histologicznych oczu zebranych (samica typu dzikiego, n=3andctns-/-samica ryby, n= 3), oczy wyłuszczono i utrwalono w 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Wykonano następujące zatopienie w medium o optymalnej temperaturze cięcia (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japonia), wykonano kriosekcje 10-µm (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokio, Japonia). Skrawki wybarwiono H&E zgodnie ze standardowymi protokołami. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu jasnego pola Leica (Leica DM6, Wetzlar, Niemcy).

4.4. Immunohistochemia (barwienie rozszczepionej kaspazy-3)

Skrawki ze świeżo ściętą tkanką danio pręgowanego odparafinowano i nawodniono. Skrawki poddano indukowanemu ciepłem odzyskiwaniu antygenu przy użyciu 10 mM buforu cytrynianowego (pH=6). Po zablokowaniu 5% normalną surowicą kozią (NGS) w dPBS, skrawki inkubowano z króliczą kaspazą przeciw rozszczepieniu -3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, rozcieńczenie 1:200), a następnie -Envision, przeciwciało drugorzędowe znakowane HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Jako kontrolę negatywną zastosowano normalną surowicę króliczą. Jako chromogen zastosowano diaminobenzydynę (DAB, DAKO, Glostrup, Dania). Następnie skrawki wybarwiono kontrastowo H&E, odwodniono i zamontowano.

Leczenie choroby nerek: Cistanche

4.5. Barwienie błękitem toluidynowym i TEM

Danio pręgowanynerkowyTkanki (samce danio pręgowanego typu dzikiego, n=3 i ctns-/- samiec danio pręgowanego, n=3) zebrano i utrwalono w buforze utrwalającym EM (1,5% aldehydu glutarowego/1% paraformaldehydu) przez 24 godziny . Następnie tkanki nerki utrwalano 2,5% aldehydem glutarowym/1,2% akroleiną w buforze utrwalającym (0,1 mol/l kakodylanów, 0,1 mol/l sacharozy, pH 7,4) i 1 procent tetratlenku osmu i osadzony w żywicy. Półcienkie skrawki (0.5-µm grubości) wybarwiono błękitem toluidynowym. Ultracienkie skrawki wybarwiono octanem uranylu. Obrazy zebrano przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej JEM-1200 EX (JEOL Ltd, Tokio, Japonia) przy różnych powiększeniach.

4.6. Cyfrowa analiza obrazu

Zabarwione szkiełka zostały zdigitalizowane przy użyciu ultraszybkiego skanera Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Holandia)

4.6.1. Analiza przerostu kłębuszkowego

Aby przeanalizować przerost kłębuszków u danio pręgowanego, na szkiełkach barwionych PAS zmierzono powierzchnie (µm2) torebki Bowmana, przestrzeń Bowmana i kępkę kłębuszków. Wszystkie dostępne kłębuszki na skrawek włączono i zmierzono za pomocą oprogramowania ImageJ. Do analizy statystycznej wykorzystano średnią pomiarów z każdego danio pręgowanego.

4.6.2. Analiza wyrażeń ciętych kaspazy-3

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 procent dodatniego barwienia). Do analizy statystycznej użyto średniej punktacji z każdego danio pręgowanego.

4.6.3. Analiza grubości zrębu rogówki

Grubość zrębu rogówki danio pręgowanego (powiększenie 10x) zmierzono w tych samych odległościach od środka oka za pomocą oprogramowania ImageJ u danio pręgowanego. Dla każdego zdjęcia wykonano n=7 pomiarów w różnych miejscach odcinka oka (centralny, środkowy, peryferyjny) wzdłuż rogówki w odstępach 100 µM. Do analizy statystycznej wykorzystano średnią z pomiarów.

4.7. Badanie płodności

Płodność została oceniona przez krycie samicy i samca danio pręgowanego (samica typu dzikiego, n=4 i samicy ryby typu dzikiego, n=6 i samca ryby typu ctns-/-, n=4 i ctns-/-samica ryby, n=6) w tacce do tarła. Następnego ranka, godzinę po świetle, pobrano zarodki i zarejestrowano całkowitą liczbę wytworzonych jaj. Zapłodnione jaja przeszukiwano i liczono od niepłodnych pod mikroskopem świetlnym. Hodowlę prowadzono n=7 razy z rzędu w tygodniu. Wykluczono dwa eksperymenty skutkujące brakiem produkcji jaj jednocześnie zarówno u danio pręgowanego typu dzikiego, jak i danio pręgowanego.

4.8. Aktywność lokomotoryczna

Danio pręgowany (samica typu dzikiego, n=6; samiec typu dzikiego, n=6; ctns-/-samica ryby, n=6; ctns-/-samiec, n=6) zostały umieszczone w zwykłych jednostkach mieszkalnych i po czasie adaptacji wynoszącym 5 minut były filmowane przez 5 minut. Nagranie wideo zostało wykonane przy użyciu GoPro® HERO 7 umieszczonego na szczycie zbiornika, oferując tym samym widok z góry na pływające ryby. Rozdzielczość i liczbę klatek na sekundę ustawiono odpowiednio na 1080p (1920×1080) i 30 kl./s. Filmy zostały przeanalizowane za pomocą funkcji Tracker. Śledzenie trajektorii poszczególnych zebrów w trakcie eksperymentu. Trajektorie zostały następnie przeanalizowane za pomocą niestandardowego kodu Pythona, aby uzyskać średnią prędkość lokomotoryczną (piksel/s) w każdej grupie [39].

Cistanche-neral

4.9. Pomiary masy i długości ciała

Zebry zostały uśmiercone przez zanurzenie w 300 mg/loftricaine metanosulfonian MS-222. Po stwierdzeniu braku odpowiedzi na bodźce zewnętrzne uśpione danio pręgowane umieszczono na bibułce i osuszono. Długość uśpionego danio pręgowanego oceniano za pomocą suwmiarki, mierząc od czubka pyska do szypułki ogonowej. Masę uśpionych danio pręgowanego oceniono za pomocą skali analitycznej.

4.10. Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS (IBM, New York, NY, USA) i GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Dane z dwóch grup zostały przeanalizowane za pomocą niesparowanego testu t z poprawką Welcha, dwustronnego. Dane dwóch kategorycznych zmiennych niezależnych przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej ANOVA z testem najmniejszej istotnej różnicy Fishera (PLSD). Różnice z p < 0.05="" uznano="" za="" istotne="">

4.11. Badanie płodności

W celu porównania wskaźników produkcji jaj między dzikim i ctns−/−danio pręgowanym przeprowadzono analizę regresji Poissona przy użyciu uogólnionych równań estymujących z solidnymi błędami standardowymi, aby uwzględnić korelację wskaźników z eksperymentami. W celu porównania szans oferowanych jaj wykorzystanych między typem dzikim i ctns-/-danio pręgowany Przeprowadzono analizę regresji logistycznej przy użyciu uogólnionych równań estymujących z solidnymi błędami standardowymi w celu uwzględnienia korelacji szans w ramach eksperymentów.

Materiały uzupełniające: Poniższe są dostępne online pod adresem https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22179398/s1.

Wkład autora: Konceptualizacja, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodologia, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; oprogramowanie SPB, JH, LDG, HT, TN; walidacja, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB i EL; analiza formalna, SPB, JH, LDG, HT, TN; dochodzenie, LvdH, HJB, EL; zasoby, HJB i EL; kuratorstwo danych, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; pisanie – przygotowanie oryginalnego projektu SPB, JH; pisanie – recenzja i redakcja, LvdH, HJB, EL; wizualizacja, LvdH, HJB, EL; nadzór, PdW, LvdH, HJB, EL; administracja projektami, LvdH, HJB, EL; pozyskiwanie finansowania, HJB, EL Wszyscy autorzy przeczytali i wyrazili zgodę na opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowanie: Autorzy chcieliby podziękować funduszowi wewnętrznemu KULeuvenC1GranttoE.L. (C14/17/113), The China Scholarship Council Grant dla JH (CSC n◦ 201508500109) oraz stypendium podoktoranckie FWO dla LDG (12I3820N).

Oświadczenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej: Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki KU Leuven n.142/2019. Podziękowania: Chcielibyśmy podziękować: Didierowi Cagniniemu za ocenę histologii mózgu zarówno w ctns-/-, jak i dzikich, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickxandKimvanKelst za ich stałe wsparcie i pomoc w ośrodku wodnym KU Leuven, Peterowi Neeskensowi za wsparcie techniczne TEM oraz Ron Wolterbeek do analizy statystycznej.

Konikty interesów: Autorzy deklarują konflikt interesów. Fundatorzy mieli norole w projekcie badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w napisaniu manuskryptu lub w decyzji o opublikowaniu wyników.

Bibliografia

1. Elmonem, mgr; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinosis: przegląd. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [Odsyłacz]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anna C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; i in. Heptahelikalne białko PQLC2 jest lizosomalnym eksporterem kationowych aminokwasów leżącym u podstaw działania cysteaminy wcystynozaterapia. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 2012, 109, E3434-E3443. [Odsyłacz] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Poprawa rokowania cystynozy nefropatycznej. wewn. J. Nefrol. Renowacja. Dis. 2014, 7, 297-302. [Odn.]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Gość, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; i in. Terapia cysteaminą opóźnia postęp cystynozy nefropatycznej u późnych nastolatków i dorosłych. Nerka wewn. 2012, 81, 179–189. [Odn.]

5. Cherqui, S. Terapia cysteaminą: leczenie cystynozy, a nie lekarstwo. Nerka wewn. 2012, 81, 127-129. [Odn.]

6. Dawid, D.; Princiero Berlingerio, S.; Elmonem, mgr; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levchenko, E. Molekularne podstawy cystynozy: rozkład geograficzny, funkcjonalne konsekwencje mutacji w genie CTNS i potencjał naprawy. Nefron 2019, 141, 133–146. [Odsyłacz] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Delecja w genie Ctns powoduje dysfunkcję kanalików nerkowych i akumulację cystyny ​​u szczurów LEA/Tohm. Mamo. Genom 2019, 30, 23-33. [Odn.]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gublera, MC; Antignac, C. Fenotyp nerkowycystynozamysi model jest zależny od tła genetycznego. Nefrol. Wybierz. Przeszczep 2010, 25, 1059-1066. [Odsyłacz] [PubMed]

9. Elmonem, mgr; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levchenko, EN GeneticNerkowyChoroby: pojawiająca się rola modeli danio pręgowanego. Komórki 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, mgr; Khalil R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Zmutowana cystynoza (ctns) zebrowatych wykazuje funkcje kłębuszków i kanalików nerkowych. Nauka. Rep. 2017,7, 42583. [Odsyłacz]

11. Lusco, MA; Najafian, B.; Alpy, CE; Fogo, ABAJKDATlas patologii nerek:Cystynoza. Jestem. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [Odn.]

12. Park, mgr; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Zwiększona apoptoza w fibroblastach cystynotycznych inerkowykomórki nabłonka kanalika proksymalnego powstają w wyniku cysteinylacji kinazy białkowej C delta. J. Am. Soc. Nefrol. 2006, s. 17, 3167-3175. [Odn.]

13. Veys, KRP; Elmonem, mgr; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissena, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; i in. Przyspieszone wewnętrzne starzenie się skóry w nefropatycznej cystynozie oceniane za pomocą optycznej tomografii koherencyjnej o wysokiej rozdzielczości. J.Inwestuj. Dermatol. 2019, 139, 2242-2245. [Odn.]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssena, MC; Levtchenko, EN Stan płodności u mężczyzn z cystynozą leczonych cysteaminą. Nawóz. Sterylne. 2010, 93, 1880-1883. [Odn.]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssena, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Pierwsze pomyślne poczęcie wywołane przez mężczyznę chorego na cystynozę. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [Odsyłacz] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Kremery, JF; Hus, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Czynność jąder u mężczyzn z niemowlęcą cystynozą nefropatyczną. Szum. Powiel. 2021, 36, 1191-1204. [Odsyłacz] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Ciąża u kobiet z cystynozą. Clin. Nerka J. 2019, 12, 855-858. [Odn.]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbona, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennerta, OM; Gahl, WA Idiopatyczne nadciśnienie śródczaszkowe w cystynozie. J. Pediatr. 2004, 145, 673-678. [Odsyłacz] [PubMed]

19. Dixon, P.; Krzysztof K.; Chauhan, A. Potencjalna rola kolagenu zrębowego w krystalizacji cystyny ​​u pacjentów z cystynozą. wewn. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [Odn.]

20. Katz B.; Melles, RB; Schneidera, JA; Rao, NA Grubość rogówki w cystynozie nefropatycznej. Fr. J. Oftalmol. 1989, 73, 665-668. [Odsyłacz] [PubMed]

21. Niestierowa, G.; Gahl, WA Cystinosis: ewolucja choroby uleczalnej. Pediatr. Nefrol. 2013, 28, 51–59. [Odsyłacz] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Efekty długotrwałego leczenia cysteaminą u pacjentów zcystynoza. Pediatr. Nefrol. 2019, 34, 571–578. [Odsyłacz] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) jako model do badania starzenia się i wysiłku fizycznego: Z wiekiem słabną sprawność fizyczna i zdolność do treningu. Do potęgi. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [Odsyłacz] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko E.; Cheng, KC Life spas i starzejące się fenotypy w dwóch szczepach Danio pręgowanego (Danio rerio). Do potęgi. Gerontol. 2002, 37, 1055-1068. [Odn.]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Biogeneza lizosomów i lizosomalne białka błonowe: Trafficking spełnia funkcję. Nat. Ks. Mol. Biol. 2009, 10, 623–635. [Odn.]

26. Cherqui, S.; Sewin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sicz, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gublera, MC; i in. Wewnątrzlizosomalna akumulacja cystyny ​​u myszy bez cystynozy, białka uszkodzonego w cystynozie. Mol. Komórka. Biol. 2002, 22, 7622-7632. [Odn.]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn S.; Devuyst, O. Dedyferencjacja i aberracje przedziału endolizosomalnego charakteryzują wczesny etap cystynozy nefropatycznej. Szum. Mol. Genet. 2014, 23, 2266-2278. [Odn.]

28. Hard, GC Pewne środki pomagają w histologicznym rozpoznaniu nefropatii kroplowej szklistej w dziewięćdziesięciodniowych badaniach toksyczności. Toksykol. Patol. 2008, 36, 1014-1017. [Odn.]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Wewnątrzkomórkowa dystrybucja cystyny ​​w kanalikach proksymalnych wypełnionych cystyną. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [Odn.]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Wykorzystanie danio pręgowanego do badania genezy podocytów podczas rozwoju i regeneracji nerek. Geneza. 2014, 52, 771–792. [Odn.]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lizosomalna akumulacja cystyny ​​promuje depolaryzację mitochondrialną i indukcję genów wrażliwych na redoks w ludzkich komórkach kanalików proksymalnych nerek. J. Physiol. 2016, 594, 3353-3370. [Odn.]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Czat, P.; i in. Cystinozyna to melanosomalne białko, które reguluje syntezę melaniny. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [Odn.]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12 pośredniczy w imporcie cysteiny do melanosomów i lizosomów. Natura 2020, 588, 699–704. [Odn.]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Ocena histologiczna i stereologiczna spermatogenezy danio pręgowanego (Danio rerio) z naciskiem na pokolenia spermatogonialne. Biol. Powiel. 2009, 81, 177-187. [Odsyłacz] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Nieprawidłowa autofagia mitochondrialna w nefropatiicystynoza. Autofagia 2010, 6, 971-973. [Odsyłacz] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Wpływ atypowego mitochondrialnego poziomu cyklicznego AMP w cystynozie nefropatycznej. Komórka. Mol. Życie Sci. 2018, 75, 3411–3422. [Odsyłacz] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Poliszczuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Poliszczuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Dynamika mitochondrialna komórek nabłonka proksymalnego kanalika w nefropatycznej cystynozie. wewn. J.Mol. Nauka. 2019,21,192. [Odn.]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurycego T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; i in. Anomalie oczne w zwierzęcym modelu cystynozy naśladują patogenezę choroby. Pediatr. Res. 2007, 62, 156-162. [Odn.]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinza, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Śledzenie wszystkich osobników w małych lub dużych zbiorowościach nieoznakowanych zwierząt. Nat. Metody 2019, 16, 179–182. [Odn.]