Zespół transkryptomu De Novo oparty na RNA-Seq i odkrycie genu mięsistej łodygi Cistanche Deserticola-Ⅱ

Klasyfikacja funkcjonalna wszystkich wyrażonych transkryptów w oparciu o ontologię genów i bazy danych KEGG

Adnotację Gene Ontology (GO) uzyskano z adnotacji UniProt i pliku powiązań tożsamości. W sumie 20 907 transkryptów, stanowiących 32,69% całkowitej ekspresji sekwencji, przypisano do 1745 terminów funkcjonalnych. Spośród wszystkich terminów funkcjonalnych GO większość (1116, 63,95%) stanowiły procesy biologiczne, następnie składnik komórkowy (329, 18,85%) i funkcja molekularna (300, 17,20%). Przypisane funkcje wyrażonych transkryptów obejmowały szeroki zakres kategorii GO, a 10 najpopularniejszych terminów GO z najczęściej opisywanymi transkryptami wymieniono w Tabeli 3. Zapewniamy dystrybucję wszystkich wyrażonych transkryptów w trzech kategoriach ontologii genów (funkcja molekularna, składnik komórkowy i proces biologiczny) w pliku uzupełniającym (zbiór danych S3). Terminy GO związane z funkcjami wiążącymi i aktywnością transferazy były reprezentowane głównie w kategorii funkcji molekularnych. Jeśli chodzi o funkcje wiązania, najpowszechniejsze było wiązanie kationów (4394 transkryptów), następnie wiązanie nukleotydów/nukleozydów (średnio 3404 transkryptów) i wiązanie białek (2422 transkryptów). Natomiast w grupie o aktywności transferazy najwięcej jest tych z grupami przenoszącymi zawierającymi fosfor (2256 transkryptów, 65,77%). Wśród kategorii składników komórkowych transkrypty były bardziej zlokalizowane wewnątrzkomórkowo (średnio 10 581 transkryptów), podczas gdy w kategorii procesów biologicznych transkrypty były bardziej zaangażowane w proces metaboliczny biopolimeru (średnio 6683 transkrypty), a następnie regulację procesu komórkowego (4841 transkryptów ), ekspresję genów (4678 transkryptów) i transport (3512 transkryptów).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO ZAPOBIEGANIA CHOROBIE ALZHEIMERA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Aby wydobyć geny biorące udział w biosyntezie ligniny i PhG, przeszukano 21 358 nieredundantnych potencjalnych sekwencji białkowych względem sekwencji genów 13 organizmów roślinnych w bazie danych KEGG i przypisano je do 275 szlaków KEGG z co najmniej 5 trafieniami. 10 najważniejszych szlaków o najbardziej dopasowanych sekwencjach wymieniono w Tabeli 4. Większość szlaków była zaangażowana w pierwotne procesy metaboliczne, takie jak metabolizm aminokwasów lub białek (ko01230, ko04141 i ko04120), metabolizm węglowodanów (ko01200 i ko00500) oraz metabolizm nukleotydów lub metabolizm nukleozydów (ko03018, ko00230 i ko00240). Poza tym istnieje 27 szlaków związanych z metabolizmem wtórnym (ryc. 2), takich jak biosynteza szkieletu terpenoidowego, biosynteza fenylopropanoidów, biosynteza karotenoidów, biosynteza alkaloidów izochinolinowych oraz biosynteza alkaloidów tropanowych, piperydynowych i pirydynowych. Wyniki te dostarczają dalszych wskazówek, że w organizmie zachodzą aktywne procesy metaboliczneC. desericolatkanka macierzysta. Wszystkie wyrażane transkrypty powiązane ze szlakami KEGG zostały wymienione w pliku uzupełniającym (zestaw danych S4). Chociaż istnieją pewne znacząco zmienione szlaki między C. desericola a innymi roślinami, takimi jak ryż (zestaw danych S5), naszym głównym celem w tym badaniu jest ujawnienie całego profilu transkryptomu łodygi C. desericola i zobrazowanie powiązanych szlaków biosyntezy PhG które mogą być przydatne w prowadzeniu uprawy.

Geny kandydujące kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie ligniny

Lignina jest drugim najpowszechniejszym naturalnym polimerem lądowym w królestwie roślin, stanowiącym aż jedną trzecią materiału znajdującego się w ścianach komórkowych roślin. Jako ważny składnik ścian komórkowych, ligniny pomagają w transporcie wody, zapewniają wsparcie mechaniczne i integralność strukturalną oraz chronią przed patogenami i roślinożercami. Ta rola ligniny jest bardzo cenna we wspieraniu podziemnego wzrostu C. desericola na pustyni. W tym badaniu przedstawiliśmy pełny obraz szlaków biosyntezy ligniny u C. desericola (ryc. 3), w którym monomery ligniny są biosyntetyzowane z fenyloalaniny w drodze szeregu reakcji enzymatycznych, w tym hydroksylacji, metylacji, redukcji i procesu polimeryzacji oksydacyjnej. Enzymy związane z biosyntezą ligniny wykryto w trzech głównie syntetyzowanych postaciach w tkance naczyniowej (lignina p-hydroksylo-fenylowa (H), gwajacylowa (G) i syringylowa (S)) oraz 5-ligninina hydroksylo-gwajacylowa, która została jedynie zidentyfikowana w roślinach z niedoborem COMT (kwasu kawowego 3-O-metylotransferazy, EC 2.1.1.68) (takim jak knock-down).

Amoniakalia fenyloalaniny (PAL, EC 4.3.1.24) jest pierwszym kluczowym enzymem na szlaku biosyntezy ligniny (ryc. 3), który przekształca fenyloalaninę w kwas cynamonowy poprzez nieoksydacyjną deaminację. W sumie zsekwencjonowano 6297 odczytów PAL i złożono 7 transkryptów PAL w C. desericola (Tabela 5). Porównując podobieństwa sekwencji, odkryliśmy, że 4 z nich (comp28550_c1_seq1/2/3/5) wykazywały ponad 95% podobieństwa do znanej sekwencji mRNA C. Deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), podczas gdy comp28550_c1_seq4 i comp25940_c0_seq1 miały odpowiednio 77% i 82% podobieństwa. Przewidywanie ORF ujawniło, że 5 transkryptów miało potencjał kodowania białek i było zawierających domenę liazy aminokwasów aromatycznych (PF00221.14). Wśród nich tylko transkrypt comp28550_c1_seq4 mógł kodować pełną sekwencję białkową złożoną z 718 reszt aminokwasowych. Doniesiono, że PAL był kodowany przez małą rodzinę wielogenową u większości gatunków roślin, np. 4 u Arabidopsis thaliana, 5 u Populus trichocarpa, 3 u Scutellaria baicalensis i 7 Cucumis sativus itd. Nasza analiza filogenetyczna sugeruje, że były 4 Geny kodujące PAL w C.

desericola i nazwaliśmy je odpowiednio CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 i CdPAL4 (ryc. S2). 4-Ligaza kumaranowo-CoA (4CL, EC 6.2.1.12) i 4-monooksygenaza trans-cynamonianowa (CYP73A, EC 1.14.13.11) to dwa enzymy odpowiedzialne za przekształcanie kwasu cynamonowego do dikumarolu-CoA w dwóch odwrotnych sytuacjach święcenia. Znajdują się one również w szkieletach, a ich wartości ekspresji FPKM wynoszą odpowiednio 39,57 i 51,93.

Cztery typy lignin poddano biosyntezie różnymi szlakami kontrolowanymi przez trzy kluczowe enzymy: reduktazę cynamoilo-CoA (CCR, EC 1.2.1.44), szikimianową o-hydroksycynamoilotransferazę (HCT, EC 2.3.1.133) i ferulat{{1{ {56}}}}hydroksylaza (F5H, EC 1.14.-.-). CCR opisano jako punkt kontrolny szlaku lignin [50, 51], który katalizuje X-CoA (X obejmujący dikumarol, kawoil, feruloil, 5-hydroksyferuloil i synapoil) do Y-aldehydu (Y, w tym p -kugar, kawoil, koniferyl, 5-hydroksylo-koniferyl i snap), podczas gdy HCT katalizował p-kumaroilo-CoA do kwasu p-kumaroiloszikimowego/kwasu p-kumaroilochinowego. Te dwa enzymy, podobnie jak przełącznik, regulowały biosyntezę lignin P-hydroksylo-fenylowych lub pozostałych trzech rodzajów lignin. F5H był kolejnym przełącznikiem gałęzi regulującym ligninę syringylową i ligninę 5-hydroksyl-gwajacylową. Inne ważne enzymy, w tym 3-O-metylotransferaza kwasu kawowego (COMT, EC 2.1.1.68), O-metylotransferaza kawoilo-CoA (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) i dehydrogenaza alkoholu cynamonowego (CAD, EC 1.1.1.195 ) również wykryto ekspresję. Szczegółowe informacje na temat ekspresji przedstawiono w Tabeli 6. Te geny enzymatyczne zidentyfikowane w tym badaniu będą stanowić cenne źródło do funkcjonalnych badań genomicznych tej ważnej rośliny leczniczej. 10 genów związanych ze szlakiem biosyntezy lignin w Tabeli 6 wybrano do weryfikacji RT-qPCR w celu potwierdzenia naszych wyników RNAseq (ryc. 4), a ich wysokie korelacje (współczynnik korelacji Pearsona: 0,90343) wskazywały na wysoką dokładność i powtarzalność naszej analizy transkryptomu. Zestaw danych S1 zawiera listę sekwencji starterów zastosowanych w tej analizie.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Geny kandydujące kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie PhG

Wiadomo, że glikozydy fenyloetanoidowe (PhG) są głównymi składnikami aktywnymi C. desericola, które mają działanie poprawiające potencję seksualną, usuwające wolne rodniki i przeciwdziałające starzeniu. Trzy składniki chemiczne PhG to kwas organiczny, sacharyd i aglikon fenyloetanolu (ryc. 3). Kwasy organiczne, w tym kwas kawowy, kwas ferulowy i kwas kumalowy, są produktami szlaku biosyntezy fenylopropanoidów. Składniki sacharydów, w tym glukoza i ramnoza, są produktami szlaków metabolizmu węglowodanów, takich jak metabolizm skrobi i sacharozy, metabolizm aminocukierów i cukrów nukleotydowych, metabolizm fruktozy i mannozy itp. Jednakże szlak biosyntezy części fenyloetanolu nie jest jeszcze jasny. Tutaj zaproponowaliśmy dwa możliwe szlaki biosyntezy fenyloetanolu w oparciu o nasze dane dotyczące sekwencji. Jednym z nich jest opisany szlak kwasu kawowego lub kwasu ferulowego, znany również jako szlak kwasu cynamonowego, który jest podobny do głównego szlaku biosyntezy ligniny. Inny opiera się na szlaku metabolizmu fenyloalaniny (ryc. 3), w którym fenyloalaninę do fenyloetanolu osiągano znanym „szlakiem Enrlicha”, który po raz pierwszy odkryto u drożdży sto lat temu i potwierdzono w kwiatach petunii, pomidorach i róży. W łodydze C. desericola wykryto ekspresję czterech genów enzymatycznych kodujących aminotransferazę asparaginianową/tyrozynową, aminotransferazę fosforanu histydyny i oksydazę amin pierwszorzędowych, które są odpowiedzialne za konwersję fenyloalaniny do fenyloetanolu. Produkt fenyloetanolu może być dalej utleniany przez monooksygenazę lub metylowany przez metylotransferazę do jego pochodnych (aglikonu fenyloetanolowego), które biorą udział w biosyntezie PhG. Podsumowując, zaproponowano dwa domniemane szlaki biosyntezy aglikonu fenyloetanolowegoC. desericolaale nadal wymagają dalszych badań.

Dyskusje

W ostatnich latach genomika roślin szybko się rozwinęła dzięki zastosowaniu technologii sekwencjonowania nowej generacji, natomiast niewiele badań skupiało się na genomice pustynnych roślin leczniczych. Pilnie konieczne jest przeprowadzenie badań genomicznych lub transkryptomicznych, aby zrozumieć jego adaptację do środowiska suszy i zasolenia oraz szlak biosyntezy głównych składników bioaktywnych. Odkrycie transkryptomu de novo dla niektórych roślin leczniczych,

takie jak żeń-szeń Panax, miłorząb dwuklapowy i Glycyrrhiza uralensis zostały po raz pierwszy wykorzystane na platformie Roche 454 ze względu na długi czas odczytu. Ze względu na skuteczną zdolność składania przy krótkich odczytach, szczególnie korzystnych odczytach ze sparowanych końców, sekwencjonowanie i składanie transkryptomu oparte na Illumina były również szeroko stosowane w przypadku organizmów modelowych i niemodelowych. W niniejszym badaniu wygenerowaliśmy około 8G odczytów ze sparowanych końców o długości 101 bp i wytworzyliśmy dłuższe sekwencje unigenu o średniej długości 725 bp. Dane dotyczące transkryptomu specyficznego dla łodygi na dużą skalę mogą dostarczyć przydatnych danych referencyjnych i zostać wykorzystane do zbadania wtórnego metabolizmu bioaktywnych składników C. Deserticola. 81,62% wszystkich surowych odczytów przeszło rygorystyczne filtry jakości (w tym przycinanie adaptera i odrzucanie odczytów niskiej jakości) przed montażem, co sugeruje wysoką jakość naszych danych sekwencjonowania, a 82,08% odczytów wysokiej jakości było przydatnych do montażu. Inne odczyty, które nie zostały wykorzystane do montażu, mogą wynikać z błędów sekwencjonowania, parametrów montażu i in. Te niewykorzystane odczyty wysokiej jakości pozostały pomocne w ulepszaniu montażu de novo w połączeniu z dłuższymi odczytami z innej platformy (takiej jak Roche 454) w przyszłości.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Duża liczba złożonych transkryptów (30 098) wykazała duże podobieństwa sekwencji do znanych genów w publicznych bazach danych, co sugeruje, że nasze dane dotyczące sparowanych końców oparte na Illumina obejmowały znaczną część transkryptów C. Deserticola. Transkrypty bez trafień BLAST mogą wynikać z nieulegających translacji regionów 3' lub 5', niekodującego RNA lub nowych sekwencji genów C. Deserticola. Wyrażane transkrypty przypisano do szerokiego zakresu kategorii GO i szlaków KEGG (tabele 3 i 4), w których wiele transkryptów przypisano do szlaków związanych z wtórnym metabolizmem. Jak wiemy, fenylopropanoid może działać jako indukowalny związek przeciwdrobnoustrojowy, bardzo zbawienny dla podziemnego stylu życia [1], a także działać jako cząsteczka sygnałowa w interakcjach roślina-mikrob, poza jego użytecznością leczniczą [68, 69]. Terpenoid wykorzystywany jest do biosyntezy składników bioaktywnych (takich jak 6- deoksykatalpol) [70]. Odkryliśmy, że geny zaangażowane w szlak biosyntezy szkieletu fenylopropanoidowego i terpenoidowego były bardzo liczne u C. Deserticola. Co ważniejsze, odkrycie dobrze reprezentowanych szlaków biosyntezy ligniny (ryc. 3) wskazało na aktywny proces metaboliczny ligniny w łodydze C. Deserticola. Wykryto ekspresję wszystkich znanych genów enzymów biorących udział w biosyntezie ligniny (ryc. 3), a cztery kluczowe enzymy, w tym PAL, CCR, HCT i F5H, charakteryzowały się mniejszą obfitością ekspresji (odpowiednio FPKM 26,47, 3,89, 3,4 i 3,83) w porównaniu z inne geny enzymów (Tabela 6). Warto przeprowadzić dalsze badania, czy zmiana ekspresji tych trzech genów może wpłynąć na produkcję ligniny u C. desericola. PAL jest kluczowym enzymem w biosyntezie ligniny, a także bierze udział w biosyntezie fenylopropanoidu, resweratrolu, flawonoidu i kumaryny [71–74]. Wykryliśmy cztery różne geny PAL w genomie C. desericola (ryc. S2), co zbiegło się z faktem, że PAL był kodowany przez małą rodzinę wielogenową [39, 43, 45–49], co dodatkowo udowodniło, że może odgrywać ważną rolę w metabolicznym przepływie węgla .

PhG jest głównym składnikiem aktywnym C. Deserticola. Geny biorące udział w biosyntezie fenyloetanolu są ważne dla jakości C. desericola. Wydedukowaliśmy dwa różne szlaki biosyntezy fenyloetanolu i 17 genów enzymatycznych zaangażowanych w biosyntezę PhG w łodydze C. Deserticola. Po raz pierwszy wydedukowano również możliwe procesy po kwasie kawowym/ferulowym (ryc. 3) w oparciu o wzór strukturalny półproduktów i właściwości katalityczne odpowiednich enzymów, w których kwas kawowy/ferulowy zostałby najpierw utleniony do pochodnej fenylopirogronianu; następnie grupa karboksylowa została pozbawiona dekarboksylazy; na koniec grupa aldehydowa została ponownie przekształcona w grupę alkoholową przez dehydrogenazę. Jest to pierwsze zastosowanie technologii sekwencjonowania par końców firmy Illumina do badania całego transkryptomu C. desericola i składania odczytów sekwencji RNA bez genomu referencyjnego. Badanie to zapewni przydatne zasoby i sekwencje genów do przyszłych badań genomiki funkcjonalnej i proteomiki nad C. Deserticola.

Wnioski

W tym badaniu sprofilowaliśmy transkryptom łodygi C. desericola w oparciu o dane z wysokoprzepustowego sekwencjonowania, zidentyfikowaliśmy geny zaangażowane w szlaki biosyntezy ligniny, a także po raz pierwszy wywnioskowaliśmy o potencjalnym szlaku biosyntezy PhG, co z pewnością przyspieszy zrozumienie o niejednoznacznych procesach fizjologicznych i wielkiej wartości leczniczej na poziomie molekularnym. Jak dotąd jest to pierwsza próba złożenia de novo całego transkryptomu łodygi C. desericola i wykrycia szlaku biosyntezy składników leczniczych przy użyciu zbiorów danych sekwencjonowania opartych na rozwiązaniu Illumina. Nasze badania mogą sprzyjać rozwojowi leków naturalnych i selekcji odmian o właściwościach leczniczych.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%