Skaningowa mikroskopia przewodnictwa jonowego żywego ludzkiego kłębuszka nerkowego

Więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Rusłan Bohovyk1,2|Mychajło Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrzej Szewczuk3|Oleg Palygin1|Aleksander Staruschenko1,4

1Wydział Fizjologii, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA2Oddział Membranologii Komórkowej, Instytut Fizjologii Bogomoletz, Kijów, Ukraina3Wydział Medycyny, Imperial College London, Londyn, UK4Centrum Medyczne Clementa J. Zabłockiego VA, Milwaukee, WI, USA

KorespondencjaAlexander Staruschenko i Ruslan Bohovyk, Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA.E-mail: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Informacje o finansowaniu Departament Spraw Weteranów, numer grantu/nagrody: I01 BX004024; National Heart, Lung and Blood Institute, numer grantu/nagrody: P01 HL116264 i R35 HL135749; Amerykańskie Towarzystwo Fizjologiczne, numer grantu/nagrody: nagroda za rozwój kariery naukowej; Narodowy Instytut Cukrzycy i Układu Pokarmowego iNerkaChoroby, Numer grantu/nagrody: DK126720

Abstrakcyjny

Uszkodzenie podocytów jest cechą charakterystyczną chorób kłębuszków nerkowych, takich jak ogniskowe odcinkowe stwardnienie kłębuszków nerkowych, zwykle związane z wyraźną albuminurią i progresją patologii nerek. Nieprawidłowości strukturalne i utrata podocytów są również powiązane z chorobą z minimalnymi zmianami i są bardziej powszechnecukrzycowa choroba nerek. Tutaj po raz pierwszy zastosowaliśmy technikę skaningowej mikroskopii przewodnictwa jonowego (SICM) do oceny świeżo wyizolowanego człowiekakłębuszkitopologia. SICM daje wyjątkową okazję do ocenykłębuszkipodocyty, a także inne segmenty strukturalne nefronów z rozdzielczością mikroskopii elektronowej, ale w żywych próbkach. Pokazano tutaj zastosowanie metody SICM u żywego człowiekakłębuszki, który dostarcza dowodu zasady przyszłej dynamicznej analizy morfologii błony i różnych parametrów funkcjonalnych w żywych komórkach.

Kliknij, aby uzyskać skutki uboczne Cistanche i Cistanche na chorobę nerek

1. WSTĘP

Kłębuszkiprzedstawia kępkę naczyń włosowatych znajdujących się w części wejściowej nefronu, gdzie krew jest selektywnie filtrowana przez kłębuszkową barierę filtracyjną składającą się z komórek śródbłonka, błony podstawnej kłębuszków i podocytów. Pierwotne i wtórne procesy sąsiednich podocytów przeplatają się, tworząc szczelinową przeponę, która szczelnie pokrywa naczynia włosowate kłębuszków. Ta membrana ma złożoną morfologię i tworzy ostateczną barierę dla filtracji krwi, przyczyniając się do selektywności wielkości i umożliwiając przepuszczanie cząsteczek mniejszych niż albumina. Zmniejszenie liczby podocytów i zatarcie wyrostka racicowego odnotowano w ogniskowym segmentowym stwardnieniu kłębuszków nerkowych, chorobie z minimalnymi zmianami i nefropatii cukrzycowej.1-3Ponadto utrata podocytów i modyfikacja ich architektury mogą być widoczne na bardzo wczesnych etapachnerkachoroby, które mogą leżeć u podstaw/nasilać ich progresję. Obrazowanie morfologii komórki w wysokiej rozdzielczości staje się niezbędnym i użytecznym narzędziem do badania struktur komórkowych i roli, jaką odgrywają one w funkcjonowaniu komórki i progresji choroby.4 Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) jest szeroko stosowaną metodą prowadzenia takich badań. Mimo to wymaga wielu złożonych procedur przygotowania próbki, co uniemożliwia analizę żywej próbki.5 Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania nowych narzędzi do badania zmian morfologii podocytów w żywych próbkach. Tryb sondy hoppingowej w skaningowej mikroskopii przewodnictwa jonowego (SICM) to technika umożliwiająca wysokiej rozdzielczości, nieoptyczne obrazowanie powierzchni żywych komórek o złożonej morfologii.6-8Główną zaletą tej metody jest bliskość kilku nanometrów rozdzielczości przestrzennej i długi zakres Z (pionowy), który można zastosować do żywych próbek o zawiłej morfologii w fizjologicznie istotnych warunkach. SICM to multimodalna technika obrazowania, którą można łączyć z innymi uznanymi technikami, równoczesną i dynamiczną analizą morfologii błony oraz różnymi parametrami funkcjonalnymi, takimi jak objętość komórek, potencjały błonowe, prądy pojedynczych kanałów jonowych, a nawet dynamika kompleksów białek błonowych w żywych komórkach.9-11 Tutaj podajemy przykład zastosowania SICM do analizy morfologii żywego człowiekakłębuszkiStruktura.

Objawy choroby nerek Cistanche

2. MATERIAŁY I METODY

Do eksperymentu wykorzystaliśmy część obszaru korowego odrzuconego człowieka po przeszczepienerkawypreparowano i przechowywano w roztworze konserwującym Wisconsin, a następnie inkubowano w natlenionym roztworze soli fizjologicznej (PSS).12 Kłębuszki nerkowe izolowano przy użyciu techniki wibrodysocjacji, jak opisano wcześniej.13 Takie podejście pozwala na szybką izolację dobrze zachowanych kłębuszków nerkowych od człowieka.nerki. Aby wykonać obrazowanie SICM, świeżo wyizolowany człowiekkłębuszkizostały przymocowane do powierzchni szkła poli-L-lizyny umieszczonej w komorze celki wypełnionej roztworem PSS. Próbki ręcznie umieszczano w kierunkach xy pod odwróconym mikroskopem optycznym Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). W przypadku sondy hoppingowej zastosowano nanopipety ze szkła borokrzemianowego do obrazowania SICM o rezystancji około 100 MΩ, co odpowiada szacowanej średnicy końcówki około 120 nm. Nanopipety wyciągano za pomocą poziomego ściągacza typu płomienistego/brązowego P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Nanopipety napełniono tym samym roztworem PSS, który zastosowano do kąpieli i umieszczono w kierunku z za pomocą siłownika piezoelektrycznego. Prąd jonów przepływający przez nanopipety mierzono za pomocą wzmacniacza patch-clamp Axopatch 700B (Axon Instruments) w trybie voltage-clamp i monitorowano przez niestandardowy uniwersalny sterownik (ICAPPIC Ltd, Wielka Brytania), który jednocześnie kontrolował pozycjonowanie próbki i pipety. 6 Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w temperaturze pokojowej (20-22 stopni). Do obrazowania skomplikowanych, zawiłych struktur, takich jak procesy stóp podocytów wkłębuszki, użyliśmy trybu backstep/hopping SICM, który jest najbardziej odpowiedni do obrazowania topografii żywych komórek z wysoką rozdzielczością.6,14 Pojedynczy krok zasady hoppingu obejmuje zdarzenie, w którym prąd odniesienia jest mierzony przez umieszczenie nanopipety znacznie powyżej próbka. Następnie nanopipeta zbliża się wzdłuż osi Z do powierzchni próbki, aż zmierzony poziom prądu spadnie do zadanej wartości zadanej odpowiadającej ~ 1,0 procentowi -1,2 procenta prądu odniesienia. W tym momencie podejście zostaje zakończone, współrzędne XYZ siłowników piezoelektrycznych XY i Z są rejestrowane jako współrzędna powierzchni próbki dla pierwszego punktu obrazowania, a pipeta jest wycofywana z powierzchni. Ta procedura jest następnie powtarzana w każdym pojedynczym punkcie obrazowania wzdłuż osi xy określonej przez wstępnie ustawioną rozdzielczość i zakres obszaru skanowania. Na rysunku 1B zakres skanowania i rozdzielczości obrazu wynosiły odpowiednio 30 µm × 30 µm i 512 pikseli × 512 pikseli, a na rysunku 1C odpowiednio 5 µm × 5 µm i 480 pikseli × 480 pikseli. Surowe dane topografii SICM i przetwarzanie końcowe obrazu przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy mikroskopowej SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, Wielka Brytania).

RYSUNEK 1 Zastosowanie obrazowania w skaningowej mikroskopii przewodnictwa jonowego. A, Świeżo izolowany człowiekkłębuszkiprzymocowany do szklanej powierzchni poli-Llizyny. Po lewej stronie pokazano mikropipetę zbliżającą się do powierzchni kłębuszka w celu wykonania obrazowania SICM. B, Przykład elementów bariery filtracyjnej kłębuszków, w tym podocytów i wyrostków stóp pokrytych naczyniami, wizualizowany przez SICM. 45 min dla skanowania całego obszaru (30 × 30 µm, rozdzielczość 512 × 512 pikseli; zmiana osi z 15 µm). C, Rozszerzone spojrzenie na architekturę wtórnych wyrostków ludzkich podocytów stopy ujawnione przez SICM o wysokiej rozdzielczości. 12 min dla skanowania całego obszaru (rozdzielczość 5 × 5 µm, rozdzielczość 480 × 480 pikseli; zmiana osi z 3 µm). Pokazane są paski skali

3. WYNIKI I DYSKUSJA

Jakość obrazu SICM jest porównywalna z SEM i pozwala na precyzyjne badaniekłębuszkistruktura powierzchni, w tym naczynia krwionośne i podocyty, oraz architektura wtórnych wyrostków stopy.4 W naszym poprzednim badaniu wykorzystaliśmy obrazowanie SICM do oceny patologicznych zmian strukturalnych w wyrostkach podocytowych stopy u szczurów z nefropatią cukrzycową typu 2 (T2DN). przeprowadzili analizę porównawczą trójwymiarowej architektury bariery filtracyjnej podocytów u szczurów bez cukrzycy i T2DN. Nasze dane ujawniły znaczną utratę procesów podocytowych stopy w kłębuszkach T2DN, zapewniając dokładną ocenę zmian histopatologicznych, które wystąpiły w nefropatii cukrzycowej, leżącej u podstaw nefrynurii i albuminurii u tych szczurów. dwuwymiarowa struktura powierzchni świeżo wyizolowanego, żywego kłębuszka ludzkiego. Kłębuszki nerkowe człowieka są strukturami kulistymi o średnicy około 300 µm16; dlatego końcówka pipety musi ostrożnie zbliżać się do górnej części obszaru zainteresowania. Nasz zestaw SICM ma zakres skanerów w osi z 25 µm i 30 × 30 µm w osi xy, co pozwoliło nam uzyskać wysokiej rozdzielczości obraz dużej częścikłębuszkipowierzchnia. Czas akwizycji silnie zależy od zakresu skanowania, rozdzielczości i rozmiaru końcówki elektrody przeskakującej. W przypadku obrazowania żywych komórek w złożonych strukturach, takich jak świeżo wyizolowany kłębuszki, czas skanowania waha się od 10 do 50 minut na klatkę (więcej szczegółów znajduje się w legendzie rysunku). Łączny efekt wysokiej rozdzielczości, dużego obszaru skanowania i fluktuacji stochastycznych w żywych systemach może skutkować artefaktami obrazowania przedstawianymi jako przesunięcia poziome i pionowe między cyklami zmiany pozycji pipety z nadzieją. Zwróć uwagę, że w przypadku złożonych geometrii z nagłymi zmianami lokalizacji powierzchni, zarówno czas akwizycji, jak i artefakty obrazowania, takie jak ciemne lub złe piksele, mogą się zwiększyć. Obraz topografii SICM (ryc. 1A) przedstawia naczynia włosowate kłębuszków pokryte wyraźnie widocznymi pierwotnymi i wtórnymi wyrostkami podocytowymi. SICM umożliwia pozyskiwanie obrazów próbek o różnych zakresach skanowania w skali nanometrycznej, przy zachowaniu wystarczającego poziomu rozdzielczości.17 Rycina 1B przedstawia architekturę wyrostków wtórnych ludzkich podocytów w stopie ujawnioną przez SICM o wysokiej rozdzielczości. Dalsza analiza takich obrazów topograficznych może być wykorzystana do badania zmian morfologicznych procesów stopy podocytowej w warunkach patologicznych i w odpowiedzi na różne zastosowania leków.

Zastosowanie techniki SICM do badania trójwymiarowej struktury powierzchni próbek tkanek miękkich, w tym:kłębuszkii komórki podocytów, zostały początkowo wprowadzone przez Nakajimę i wsp.4. Autorzy wykorzystalinerkaplastry w celu porównania tej techniki z konwencjonalnym SEM. Tutaj rozszerzyliśmy te badania na żywy ludzki kłębuszki nerkowe. Stosując takie podejście, ujawniliśmy ogromny potencjał techniki SICM w zakresie szybkiego i niezawodnego badaniakłębuszkibariera filtracyjna. Jedną z wielkich zalet SICM (oprócz użycia żywych próbek) jest to, że nie wymaga wielu procedur przygotowania próbki, które są zwykle potrzebne do obrazowania mikroskopowego EM, w tym odwodnienia i roztworu do utrwalania. Dlatego SICM pozwala uniknąć kurczenia się próbek obserwowanych w EM, co może prowadzić do mylących rzeczywistych wymiarów. Co ważne, SICM w czasie rzeczywistym na świeżo wyizolowanych kłębuszkach umożliwia również testowanie dynamiki ruchu wyrostków stóp w odpowiedzi na ostrą ekspozycję na leki będące przedmiotem zainteresowania. Wreszcie pipeta SICM może służyć do wykonywania rejestracji patch-clamp prądów jednokanałowych.18 W tym celu, po rekonstrukcji mapy topograficznej, oprogramowanie akwizycji (ICAPPIC Ltd, Wielka Brytania) pozwoliło na kontrolowane hamowanie szkła SICM sonda hoppingowa na powierzchni komory, zmniejszająca rezystancję mikroelektrody do warunków patch-clamp (7 do 12 MΩ) i czyniąca ją odpowiednią do rejestracji jednokanałowej w tym samym eksperymencie. SICM pozwala na wybór dokładnego położenia elektrody patch-clamp na powierzchni komórki na podstawie danych topograficznych poprzez dobrze kontrolowane podejście pionowe z nanometrową precyzją, co skutkuje łatwym utworzeniem styku gigaseal z błoną komórkową o nazwie Smart Patch.19

Podsumowując, opisana tutaj metoda ma doskonały potencjał do badania kłębuszków i innych świeżo wyizolowanych segmentów nefronu. Ponadto pokazuje, że możliwe jest wykorzystanie człowiekanerkapróbki bez skomplikowanego przygotowania do oceny zmian morfologicznych w badaniu patologii.

Cistanche na chorobę nerek

PODZIĘKOWANIE

Badania w laboratorium autorów zostały sfinansowane przez Departament Spraw Weteranów I01 BX004024, Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi R35 HL135749 i P01 HL116264, Narodowy Instytut Cukrzycy i Trawienia iNerkaChoroby R01 DK126720 oraz nagroda za rozwój kariery naukowej Amerykańskiego Towarzystwa Fizjologicznego.

KONFLIKT INTERESÓW

Dr Andrew Shevchuk jest udziałowcem i otrzymuje wynagrodzenie za konsultacje od ICAPPIC Ltd. Wszyscy pozostali autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów

AUTORSKIE WKŁADY

Ruslan Bohovyk: Konceptualizacja (równe); Kuracja danych (lead); Analiza formalna (lead); Pisemno-oryginalny projekt (równy); Pisanie-recenzja i edycja (równe). Mykhailo Fedoriuk: Kurator danych (wsparcie); Analiza formalna (wspierająca); Pisanie-recenzja i edycja (równe). Elena Isaeva: Konceptualizacja (wsparcie); Kuracja danych (wsparcie); Analiza formalna (wspierająca); Pisemno-oryginalny projekt (wsparcie); Pisanie-recenzja i edycja (równe). Andrew Shevchuk: Konceptualizacja (wsparcie); Oprogramowanie (wspomagające); Pisanie oryginalnego projektu (wsparcie); Pisanie-recenzja i edycja (równe). Oleg Palygin: Konceptualizacja (równe); Analiza formalna (wspierająca); Metodologia (wspierająca); Administracja projektu (wsparcie); Pisemno-oryginalny projekt (pomocniczy); Pisanie-recenzja i edycja (równe). Alexander Staruschenko: Konceptualizacja (lead); Administracja projektu (lead); Zasoby (lead); Nadzór (prowadzący); Pisemno-oryginalny projekt (równy); Pisanie-recenzja i edycja (równe).

OŚWIADCZENIE O DOSTĘPNOŚCI DANYCH

Dane potwierdzające wyniki tego badania są dostępne u odpowiedniego autora na uzasadnione żądanie.