Autoradiografia [18F]-fluorkiem sodu Obrazowanie wapnicy nerek w nerkach dawcy i przeszczepionych allogenicznych przeszczepach nerki

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan-Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrokalcynozawystępuje aż w 43 procentachnerkabiopsje przeszczepu allogenicznego rok po przeszczepie i są związane z gorszą funkcją przeszczepu i słabą przeżywalnością przeszczepu. Badaliśmy obrazowanie [18F]-fluorku sodu ([18F]-NaF) mikrozwapnień w nerkach dawcy (n= 7) i eksplantowanychnerkaprzeszczepy allogeniczne (n= 13). Do oceny histologicznej zwapnienia (czerwień alizarynowa; barwienie Von Kossy) i autoradiografii ex-vivo [18F]-NaF zastosowano trzy serie skrawków zatopionych w parafinie. Obrazy połączono, aby ocenić, czy obszary mikrozwapnień odpowiadają obszarom wychwytu [18F]-NaF. Na podstawie analiz histologicznych mikrozwapnienia kanalikowo-śródmiąższowe i kłębuszkowe były obecne odpowiednio w 19/20 i 7/20 próbkach. Stosując autoradiografię, wychwyt [18F]-NaF stwierdzono w 19/20 próbkach, przy znacznie większej aktywności znacznika wnerkaprzeszczep allogeniczny w porównaniu z próbkami nerki zmarłego dawcy (p {{0}}.019). Barwienie Alizarin Red aktywnych mikrozwapnień wykazało dobrą korelację (rho Spearmana 0.81, p < 0,001),="" a="" barwienie="" von="" kossy="" skonsolidowanych="" zwapnień="" wykazało="" istotną,="" ale="" słabą="" korelację="" (0,62,="" p="00,003)." z="" aktywnością="" [18f]-naf.="" ta="" korelacja="" między="" wychwytem="" ex-vivo="" [18f]-naf="" a="" mikrozwapnieniami="" potwierdzonymi="" histologicznie="" jest="" pierwszym="" krokiem="" w="" kierunku="" metody="" obrazowania="" w="" celu="" identyfikacji="" mikrozwapnień="">nefrokalcynoza. Może to prowadzić do lepszego zrozumienia etiologii mikrozwapnień i ich wpływu na funkcję przeszczepu nerki.

Kliknij, aby uzyskać korzyści z ekstraktu z cistanche na choroby nerek

Nefrokalcynoza, definiowany jako miąższowe i kanalikowe odkładanie się szczawianu wapnia (CaOx) lub fosforanu wapnia (CaPhos), jest ważnym czynnikiem pogarszającym funkcję przeszczepu ponerkatransplantacja1–3. Odkładanie się CaOx i CaPhos przypisuje się wysokim poziomom szczawianu w surowicy, wapnia i fosforanów w surowicy u pacjentów z przewlekłymnerkachoroba i/lub nadczynność przytarczyc4,5. Częstość występowanianefrokalcynoza, w oparciu o biopsje przeszczepu nerki, wynosi 6 procent po 6 miesiącach, 25–43 procent po roku i do 79 procent po 10-latach ponerkatransplantacja5–7. Badania skupiające się na biopsjach przeszczepu nerki w ciągu jednego roku po przeszczepie wykazały związek między wczesną obecnością złogów wapnia a gorszą funkcją przeszczepu i słabą przeżywalnością przeszczepu4,8,9. Nie jest jednak jasne, czy te mikrozwapnienia odgrywają aktywną rolę w dysfunkcji przeszczepu allogenicznego, czy są jedynie wskaźnikami rozregulowanego metabolizmu mineralnego.

Spotykać się z kimś,nerkabiopsje allogeniczne są jedyną metodą diagnostyczną oceny mikrozwapnień poprzeszczepowych. Nieinwazyjne i niezawodne podejście diagnostyczne umożliwiłoby wielokrotne pomiary, ułatwiając śledzenie zwapnień w czasie i badania interwencyjne z potencjalną poprawą wyników dotyczących funkcji przeszczepu i przeżycia przeszczepu po przeszczepie nerki10.

Pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa (PET/CT) z użyciem [18F]-fluorku sodu ([18F]-NaF) jest wykorzystywana w praktyce klinicznej i badaniach eksperymentalnych jako metoda obrazowania szkieletu i naczyń11-15. Chociaż obrazowanie CT utrudnia wiarygodną wizualizację mikrozwapnień naczyniowych, wyniki obrazowania ex-vivo [18F]-NaF microPET dobrze korelują z potwierdzonymi histologicznie mikrozwapnieniami w próbkach naczyniowych u ludzi i zwierząt16,17. Co więcej, wyniki kilku prospektywnych badań klinicznych wykazały, że wczesna aktywność naczyniowa [18F]-NaF ma dobry związek zarówno z mikrozwapnieniami wykrytymi w obrazowaniu CT, jak i, co ciekawsze, ze wzrostem wielkości tych zwapnień18–20.

W tym miejscu przedstawiamy wyniki badania autoradiografii dowodu koncepcji dla wykorzystania ex-vivo obrazowania [18F]-NaFnefrokalcynozau dawcynerkioraz przeszczepione allogeniczne przeszczepy nerki jako podejście diagnostyczne do wizualizacji mikrozwapnień.

Tabela 1.Nerkacechy biorcy przeszczepu. Brak przypadków hiperkalcemii w tej kohorcie; *Klasyfikacja Klasyfikacji Patologii Alloprzeszczepów Banf – 201828; FSGS=Ogniskowe odcinkowe stwardnienie kłębuszków nerkowych; IFTA=Śródmiąższowe zwłóknienie i zanik kanalików; odpowiednie wyniki autoradiografii i histologii przedstawiono w Uzupełniającym S1.

Tabela 2. Zmarłynerkacechy dawcy. *Choroba sercowo-naczyniowa zdefiniowana jako incydent mózgowo-naczyniowy, zawał mięśnia sercowego, choroba naczyniowa wymagająca interwencji inwazyjnej; **jak zauważył zespół ds. zamówień; Odpowiednie wyniki autoradiografii i histologii przedstawiono w Uzupełniającym S2; brak dawców z cukrzycą.

Wyniki

Przykładowa kohorta.

Trzynaścienerkapróbki pobrano po transplantektomii, średnio 33 [IQR 9–66] miesięcy po przeszczepie, od biorców przeszczepu w średnim wieku 51 [IQR 30–64] lat. Transplantektomię wykonano z powodu odrzucenia przeszczepu allogenicznego (Banf IIA i IIB) u siedmiu pacjentów, przewlekłej arteriopatii przeszczepu allogenicznego u dwóch pacjentów, zakażenia przeszczepu allogenicznego u dwóch pacjentów, pierwotnego braku funkcji u jednego pacjenta oraz zwłóknienia śródmiąższowego i atrofii kanalików w stopniu III u jednego pacjenta. Ośmiu z 13 (61,5 procent) pacjentów miało nadczynność przytarczyc, siedmiu (53,8 procent) miało hiperfosfatemię, pięciu (38,5%) miało cukrzycę i żaden z tych pacjentów nie miał objawównefrokalcynozaw klinicznym USG lub historii kamieni nerkowych (tab. 1). Pobrano próbki nerek od siedmiu zmarłych dawców od dawców w średnim wieku 65 lat [IQR 64–71] lat. Czterech z siedmiu (57,1 procent) dawców miało historię choroby sercowo-naczyniowej, żaden nie miał cukrzycy, a sześciu na siedmiu (85,7 procent) miało miażdżycę naczyń nerkowych w badaniu wzrokowym, które są potencjalnymi czynnikami odrzucającymi te dawcynerki(Tabela 2).

Rycina 1. Obraz autoradiografii wychwytu [18F]-fluorku sodu ([18F]-NaF) (A), z nałożonym obrazem wychwytu [18F]-NaF z barwieniem czerwieni alizarynowej mikrozwapnień (B) i barwieniem von Kossy zwapnień (C).

Autoradiografia i histologia.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 procent na 5 (25%) z 20 próbek (ryc. 1 i ryc. 2A) (uzupełniające S1 i uzupełniające S2, pokazujące autoradiografię i obrazy nakładane dla wszystkich próbek). Liczba obszarów [18F]-NaF była znacznie wyższa wnerkapróbki przeszczepów allogenicznych w porównaniu ze zmarłym dawcąnerkapróbki, z medianą 7.0 [IQR 4.0–15,5] i 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], odpowiednio (p=0.019) (uzupełniający S3).

Mikrozwapnienia kanalikowo-śródmiąższowe, uwidocznione za pomocą barwienia czerwienią alizaryną, były obecne w 19 z 20 próbek, z medianą 5,5 [IQR 2–10,3] na próbkę, a mikrozwapnienia kłębuszkowe zaobserwowano w siedmiu z 20 próbek, z medianą 1 [IQR 1-3] na próbkę (ryc. 2B). Znacznie większą liczbę mikrozwapnień zaobserwowano w próbkach przeszczepów nerki w porównaniu z próbkami nerki od dawcy zmarłego, przy medianie 9.0 [IQR 5.0–20.5] i 4,0 [IQR 1,0–4,0], odpowiednio (p=00,046) (Suplementarny S3). W przypadku barwienia Von Kossy zwapnienia kanalikowo-śródmiąższowe były widoczne w 18 z 20 próbek, przy medianie 2,5 [IQR 1–5] na próbkę, a zwapnienia kłębuszkowe były widoczne w siedmiu z 20 próbek, przy medianie 1 [IQR 0–3 ] na próbkę (rys. 2C). Liczba zwapnień nie różniła się istotnie międzynerkapróbki przeszczepów allogenicznych i próbki nerek zmarłego dawcy, o medianie 4.0 [IQR 2.0–6.0] i 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], odpowiednio (p=0.311) (Suplementarny S3). Powtarzalność między obserwatorami została zidentyfikowana między wizualnym i półautomatycznym wykrywaniem zwapnień, z ICC wynoszącym 0,94 (95% CI 0,85–0,98) dla barwienia czerwienią alizaryną oraz 0,77 (95% CI 00,42–0,91) dla barwienia metodą Von Kossy.

Nakładane obrazy wyników autoradiografii i histologii wykazały wspólną lokalizację wychwytu [18F]-NaF z barwieniem czerwienią alizaryną dla mikrozwapnień (ryc. 1B). Dla porównania, nałożone obrazy wychwytu [18F]-NaF i barwienia zwapnień metodą Von Kossy wykazały wychwyt w obszarach bez zwapnień potwierdzonych histologicznie (ryc. 1C). Fałszywie ujemny wychwyt [18F]-NaF, jako procent obszarów (mikro)zwapnień potwierdzonych histologicznie poza nakładką, wyniósł medianę 0 procent [IQR 0–25 procent] dla obszarów czerwonych alizaryny i mediana 100 procent [65–100 procent] dla obszarów Von Kossa. Barwienie czerwienią alizarynową mikrozwapnień wykazało dobrą korelację z wychwytem [18F]-NaF (rho Spearmana 0,81 (95% CI 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 procent wychwytu [18F]-NaF (ryc. 4).

Rycina 2. Nałożony obraz wychwytu [18F]-fluorku sodu ([18F]-NaF) i mikrozwapnień (czerwień alizarynowa) (A), z barwieniem czerwienią alizaryną dla mikrozwapnień (B) i barwieniem von Kossy dla zwapnień (C).

Charakterystyka biorcy w czasie transplantektomii.

Nie zaobserwowano różnic międzynerkapróbki allografu od pacjentów z (n{0}) lub bez hiperfosfatemii (n=6), dla liczby obszarów [18F]-NaF (mediana 5.0 [IQR 2.0-11.8] kontra 7.0 [7.0-23.0], p=0.170) , czerwień alizarynowa (mediana 7,5 [IQR 5.0-14.0] versus 12.0 [3.0-34.0], p{{30}.390) i Von Kossa (mediana 5.0 [IQR 3,5–6,3] kontra 3.0 [2.{ {59}}–5.0], p=0.247). Porównanie próbek allograficznych nerek od pacjentów z (n=8) lub bez (n=5) nadczynnością przytarczyc nie wykazało różnic dla liczby obszarów [18F]-NaF (mediana 7.0 [IQR 4.0-7,5] versus 7,5 [4.0-23.0], p=0.459), czerwień alizarynowa (mediana 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] kontra 1{{103}}.0 [3.5–32.8], p{{76 }} 0,769 i Von Kossa (mediana 4.0 [IQR 1,5–5.0] kontra 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). Nie stwierdzono istotnych różnic między próbkami allografu nerki od pacjentów z (n=5) lub bez (n=8) cukrzycy, dla liczby obszarów [18F]-NaF (mediana 5,5 [IQR 2,5– 19,3] w porównaniu z 7,0 [6,5–15,5], p=00,524), czerwień alizarynowa (mediana 10,0 [IQR 5,5–24,8] w porównaniu z 9,0 [4,0–8,5], p=0 0,833) oraz Von Kossa (mediana 3,0 [IQR 2,0–5,8] w porównaniu z 4,0 [3,5–8,5], p=0,284). Dla czasu pomiędzy transplantacją a transplantektomią (miesiące) nie zaobserwowano istotnych korelacji z liczbą obszarów [18F]-NaF (p=0.586), czerwienią alizarynową (p=0.667) i Von Kossy (p=0.459). Dla wieku w momencie przeszczepu nie zaobserwowano istotnych korelacji z liczbą obszarów [18F]-NaF (p=0.902), czerwienią alizarynową (p=0.798) i von Kossą (p =0.334). Podobnie nie zaobserwowano istotnych korelacji między czasem trwania dializy (miesiące) ponerkauszkodzenie allografu i liczba obszarów [18F]-NaF (p=0.481), czerwień alizarynowa (p=0.565) i Von Kossa (p=0.174).

Rysunek 3. Korelacja liczby obszarów fluorku [18F]-sodu ([18F]-NaF) z mikrozwapnieniami wybarwionymi czerwienią alizaryną (A) i zwapnieniami wybarwionymi metodą von Kossy (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 procent powierzchni wskaźnika z fluorku [18F]-sodu ([18F]-NaF) dla liczby mikrozwapnień wybarwionych na czerwono alizarynowy (A) i zwapnień wybarwionych metodą von Kossy (B) (mediana, zakres międzykwartylowy).

Dyskusja

W tym badaniu potwierdzającym koncepcję, wychwyt ex-vivo [18F]-NaF u ludzinerkaPróbki miąższu wykazały dobrą korelację z mikrozwapnieniami potwierdzonymi histologicznie. Wychwyt [18F]-NaF silniej korelował z barwieniem czerwienią alizaryną dla aktywnych mikrozwapnień w porównaniu z barwieniem skonsolidowanych zwapnień metodą Von Kossy, co sugeruje rolę obrazowania [18F]-NaF w identyfikacji obszarów wczesnego stadium nefrokalcynozy.

Przedstawione próbki stanowią mieszankę przypadków nerek dawcy i przeszczepów allogenicznych z usuniętych nerek. Te dwa typy próbek różniły się pod względem wiązania znacznika, z większym wychwytem [18F]-NaF obserwowanym w próbkach przeszczepu allogenicznego z eksplantowanej nerki. Jest to zgodne z wcześniejszymi publikacjami, które donoszą o wzroście mikrozwapnień po przeszczepieniu nerki5–7. Stowarzyszenienefrokalcynozaz gorszą funkcją przeszczepu w czasie biopsji i rok po przeszczepie opisano w dwóch badaniach dotyczących biopsji przeszczepu allogenicznego nerki, z 258 i 149nerkaodpowiednio biorcy przeszczepu8,9. Ponadto w kohorcie podłużnej obejmującej 97 biorców przeszczepu nerki wykazano znacznie gorsze 1-rok i 12-przeżycie przeszczepu u pacjentów ze złogami szczawianu wapnia (tj. przeżycie przeszczepu 98,6% w porównaniu z 72,5% i odpowiednio 79,3 proc. wobec 49,7 proc.). W wieloczynnikowej analizie regresji logistycznej obecność złogów szczawianu wapnia była niezależnie związana z utratą przeszczepu, w modelu obejmującym m.in. kreatyninę w czasie biopsji i typ dawcy4. Specyficzna rola mikrozwapnień w tej kaskadzienerkapogorszenie funkcji przeszczepu allogenicznego pozostaje niejasne. W warunkach klinicznych przed transplantacją, złogi CaOx przypisuje się wysokim poziomom szczawianu w surowicy, cząsteczki, która nie jest skutecznie usuwana podczas dializy4. Natomiast złogi CaPhos są najczęściej obserwowane u pacjentów z nadczynnością przytarczyc i wysokim poziomem wapnia w surowicy, z powodu zaburzonego metabolizmu mineralnego przed i po transplantacji5. Nie znaleźliśmy różnic w wynikach histologii i autoradiografii dla hiperfosfatemii, nadczynności przytarczyc, cukrzycy, czasu między przeszczepem a transplantektomią oraz czasu trwania dializy po niewydolności przeszczepu nerki.

Opracowanie nowych strategii leczenia aktywnych mikrozwapnień wnefrokalcynoza, jego znaczenie kliniczne w odniesieniu do (przewlekłej) niewydolności przeszczepu powinno być rozumiane bardziej kompleksowo. Z identyfikacją docelowej populacji wysokiego ryzykanerkabiorców przeszczepów, badania kliniczne mogą być zaprojektowane w celu zbadania strategii leczenia21. Możliwy cel można znaleźć w regulacji w górę endogennych inhibitorów zwapnienia, ze szczególnym naciskiem na osteopontynę3.

Biorąc pod uwagę wysoką częstość występowanianefrokalcynozai jego związek z funkcją przeszczepu nerki, lepsze zrozumienie etiologii mikrozwapnień jest uzasadnione. Nieinwazyjne i niezawodne podejście diagnostyczne do identyfikacji i ilościowej oceny mikrozwapnień we wczesnej fazie wapnicy nerek może umożliwić badania nad wpływem wapnicy nerek na czynność przeszczepu nerki. Obrazowanie [18F]-NaF jest interesujące, ponieważ wychwyt [18F]-NaF w próbkach naczyń ludzkich i zwierzęcych jest zwiększony w biologicznie aktywnych obszarach zwapnienia, zanim te obszary będą mogły być uwidocznione za pomocą tomografii mikrokomputerowej16,17,22. W ostatnich badaniach klinicznych PET/CT wykazano, że wychwyt [18F]-NaF jest związany z postępem zwapnienia naczyń, co dostarcza dowodów klinicznych na zastosowanie [18F]-NaF do wykrywania obszarów z biologicznie czynnym zwapnieniem18-20. Obserwacje w tym badaniu są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami w zakresie obrazowania naczyń. Wykazano dobrą korelację między wychwytem [18F]-NaF a potwierdzonymi histologicznie mikrozwapnieniami, podczas gdy korelacja z utrwalonymi zwapnieniami była wyraźnie słabsza.

Jak stwierdzono, zidentyfikowano wspólną lokalizację między wychwytem [18F]-NaF a mikrozwapnieniami dodatnimi dla czerwieni alizarynowej, podczas gdy obszary wychwytu [18F]-NaF nie znajdowały się w tej samej lokalizacji z barwieniem skonsolidowanych zwapnień metodą Von Kossy. Te zwapniałe obszary ze skonsolidowanymi zwapnieniami i brakiem odpowiadającego im wychwytu [18F]-NaF można uznać za obszary nieaktywnego zwapnienia, w których nie zachodzi proces mineralizacji, jak wcześniej opisali Irkle i in. w badaniu ex-vivo zwapnienia tętnic szyjnych16. Chociaż zwalidowane tylko dla zwapnień naczyniowych, a nie dlanerkazwapnień miąższu, przemawia za tym właściwości wiązania [18F]-NaF z zewnętrzną powierzchnią zwapnień i ograniczona penetracja zwapnień litych. W związku z tym wychwyt [18F]-NaF będzie wyższy w mikrozwapnieniach o dużej powierzchni w porównaniu z mikrozwapnieniami o dużej objętości, ale stosunkowo małej powierzchni13,16.

To badanie sprawdzające koncepcję ma również pewne ograniczenia. Po pierwsze, nieodłącznie związane z projektem badania, wyniki reprezentują pojedynczy punkt czasowy, bez klinicznej obserwacji postępu zwapnienia. Po drugie, to badanie sprawdzające koncepcję składa się ze stosunkowo małej liczby próbek nerki, ponieważ transplantektomia po późnym niepowodzeniu przeszczepu jest wykonywana tylko ze wskazań klinicznych i dostępności odrzuconego dawcynerkido celów badawczych jest ograniczona23. Dlatego też kompleksową analizę etiologii osadów wapnia należy rozważyć poza zakresem tego projektu. Po trzecie, przełożenie kliniczne wyników jest utrudnione przez brak wiedzy na temat dystrybucji in vivo [18F]-NaF w nerkach i wpływu usuwania znacznika nerkowego, tj. niska aktywność cel-tło może ograniczać wizualizację zwapnień. Aby rozwiązać ten problem, należy ocenić optymalny moment obrazowania [18F]-NaF PET, tj. w którym [18F]-NaF jest rzeczywiście wydalany, a pozostała aktywność pochodzi z wiązania z uwapnionymi obszarami. Możliwe, że można to osiągnąć przy opóźnionym obrazowaniu przekraczającym trzy godziny, jak to jest wykonywane w celu oceny zwapnień wieńcowych24. Zmniejszony współczynnik filtracji kłębuszkowej stwierdzony u biorców przeszczepów może skutkować wydłużeniem fazy wydalania, co wymaga dłuższego okresu między wstrzyknięciem znacznika a obrazowaniem PET, ale obecne wytyczne nie wskazują na potencjalną nefrotoksyczność znacznika [18F]-NaF11,25. Potencjalnym krokiem pomiędzy przedstawionym tu badaniem potwierdzającym koncepcję a obrazowaniem in vivo może być obrazowanie ex-vivo [18F]-NaF PET normotermicznych perfundowanych nerek lub badania in-vivo [18F]-NaF mikroPET na zwierzętach26,27. Po czwarte, kliniczne zastosowanie tej techniki może być utrudnione przez koszty wykonania procedury [18F]-NaF PET/CT i nieodłączną ekspozycję na promieniowanie. Jednak nowe systemy kamer cyfrowych PET o wyższej czułości mogą zmniejszyć oba te zjawiska ze względu na krótszy czas skanowania i niższą wstrzykiwaną dawkę aktywności.

Siła tego badania dowodu koncepcji polega na szczegółowym porównaniu jeden do jednego mikrozwapnień zidentyfikowanych przez autoradiografię i histologię [18F]-NaF. Wychwyt [18F]-NaF w różnych próbkach można było porównać bez potrzeby dalszych korekt, ponieważ wszystkie próbki inkubowano w tym samym roztworze [18F]-NaF. Co więcej, badanie to dostarcza pierwszych danych pokazujących wizualne i statystyczne dopasowanie między wychwytem [18F]-NaF a potwierdzonymi histologicznie mikrozwapnieniami w próbkach nerki.

Funkcja Cistanche-nerki

Podsumowując, przedstawiamy pierwsze dane dotyczące zastosowania [18F]-NaF w badaniu autoradiografii do identyfikacji mikrozwapnień wnefrokalcynozaponerkaprzeszczep. To badanie potwierdzające koncepcję ex-vivo [18F]-NaF jest pierwszym krokiem w kierunku potencjalnego zastosowania klinicznego [18F]-NaF PET/CT u biorców przeszczepu nerki.

Metody

Człowieknerkapróbki.

Tkanka nerki została pobrana po transplantektomii (n=13) oraz z odrzuconych nerek od zmarłych dawców (n=7) w przypadku utraty nerki dawcy przez afiliowane ośrodki transplantacyjne. Dane kliniczne od biorców i dawców przeszczepu nerki uzyskano z dokumentacji medycznej pacjentów, w tym o obecności nadczynności przytarczyc, hiperfosfatemii i cukrzycy przed transplantektomią oraz klinicznej oceny patologii próbek przeszczepów nerki zgłoszonych przy użyciu klasyfikacji Banf. Działania badawcze prowadzono zgodnie z deklaracją Helsińskich zasad etycznych dotyczących badań medycznych z udziałem ludzi, a instytucjonalna komisja rewizyjna wydała zgodę na to badanie (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Od wszystkich biorców przeszczepu uzyskano świadomą zgodę i wydano zgodę przed oddaniem na wykorzystanie wyrzuconych nerek od zmarłych dawców do celów badawczych. Działania kliniczne i badawcze były zgodne z Zasadami Deklaracji Stambulskiej przedstawionymi w „Deklaracji Stambulskiej w sprawie handlu narządami i turystyki transplantacyjnej”.

Standardowa procedura operacyjna (SOP) dla pobierania próbek tkanek była następująca: Próbki pobrano na sali operacyjnej bezpośrednio po ekstrakcji nerki (w przypadku transplantektomii) lub po przybyciu odrzuconego dawcynerkaw naszym centrum transplantacyjnym. Próbki użyte do tego eksperymentu pobrano w płaszczyźnie poprzecznej górnego bieguna, w tym tkankę korową i rdzeniową nerki, o wymiarach od 25 mm × 15 mm do 20 mm × 40 mm. Próbki te zostały utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie. Za pomocą precyzyjnego przyrządu do cięcia mikrotomu wykonano trzy skrawki zatopione w parafinie. Skrawki te zamontowano na szkle mikroskopu adhezyjnego (TOMO, Matsunami Glass, USA). Przekroje szeregowe, czyli sąsiednie odcinki, które odsłaniają kolejne warstwynerkapróbki tkanek wykorzystano do autoradiografii i analizy histologicznej. Przed inkubacją znacznika i barwieniem histologicznym skrawki odparafinowano, ponownie uwodniono w wodzie demineralizowanej i tymczasowo przechowywano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).

Inkubacja [18F]‑NaF i autoradiografia.

Eksperyment ex-vivo oparto na protokole zastosowanym we wcześniejszych badaniach Hop i in. oraz Reijrink i wsp.22,29. Pierwsze badanie jest badaniem autoradiograficznym dotyczącym wychwytu [18F]-NaF w blaszkach szyjnych od pacjentów po udarze mózgu poddawanych zabiegom chirurgicznym, dla porównania ze wskazaniem zwapnienia na podstawie tomografii komputerowej. Drugie badanie to badanie autoradiograficzne dotyczące wychwytu [18F]-FDG w próbkach tkanki tłuszczowej, z porównaniem immunohistochemii serii skrawków. Jeden z każdych trzech seryjnych skrawków był kąpany w roztworze [18F]-NaF, w stężeniu 618 milibekereli (MBq) w 300 ml PBS, w temperaturze pokojowej, przez 30 min. Płukanie prowadzono przez trzykrotne płukanie zimnym PBS i dwukrotne płukanie zimną wodą. Próbki suszono na wolnym powietrzu, a nad próbkami umieszczono wygaszony ekran luminoforowy. Ekspozycję prowadzono przez noc, przez okres 24 godz. i 30 min. Rozkład i intensywność aktywności w tkankach określano na ekranie luminoforowym przy użyciu urządzenia Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, USA).

Czerwień alizarynowa i barwienie von Kossy.

Barwienie czerwienią alizaryną przeprowadzono w celu uwidocznienia akumulacji wapnia we wczesnym stadium zwapnienia. Próbki inkubowano w 2 procentowym w/v roztworze czerwieni alizarynowej (rozpuszczonej w wodzie demineralizowanej), pH 4,2 przez 5 minut30. Mycie przeprowadzono przez 20-krotne płukanie w 1:1 aceton/ksylen i 20-krotne płukanie w 100% ksylenie. Barwienie von Kossa przeprowadzono w celu uwidocznienia obecności nieorganicznych cząsteczek fosforanów w skonsolidowanych zwapnieniach. W skrócie, próbki inkubowano w 1-procentowym roztworze azotanu srebra (AgNO3) przez 1 godzinę, wystawiając je na działanie promieni słonecznych30. Na przemian z trzykrotnym płukaniem w wodzie demineralizowanej, inkubowano z tiosiarczanem sodu przez 5 min, a następnie inkubowano w nuklearnej szybkiej czerwieni przez 3 min.

Przetwarzanie i analizy obrazu.

Zabarwione skrawki tkanek zdigitalizowano za pomocą Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japonia), a obrazy skontrolowano za pomocą oprogramowania Aperio ImageScope w wersji 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Niemcy). Przeprowadzono autoradiografię i ilościowe komputerowe analizy obrazów za pomocą oprogramowania ImageJ, wersja 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Odejmowanie tła zastosowano dla wszystkich obrazów histologicznych, wstawiając kontur na granicy próbki histologicznej. Półautomatyczne wykrywanie zwapnień w barwieniu czerwieni alizarynowej i von Kossy przeprowadzono za pomocą ImageJ-BioVoxxel Toolbox31. Dla wszystkich próbek zastosowano progi, a wykryte obszary zwapnienia rozszerzono za pomocą 6 iteracji, aby zoptymalizować wizualizację. W przypadku obrazów autoradiograficznych wykonano rotację i zmianę rozmiaru na podstawie oryginalnych próbek histologicznych. Dla wszystkich próbek zastosowano wartości progowe, w wyniku których wykryto obszary wychwytu znacznika, zgodnie z podejściem opisanym przez Irkle i in.: obrazy były progowane metodą Otsu, a następnie rozmycia Gaussa i progowania metodą Li16. Obrazy nakładane uzyskano przez dopasowanie konturów z sąsiednich obrazów histologicznych, a następnie dopasowanie wyników histologii i autoradiografii (ryc. 1). Opartą na pikselach kwantyfikację powierzchni zwapnienia i znacznika (jako procent powierzchni próbki) przeprowadzono za pomocą narzędzia ImageJ — Analiza cząstek.

Objawy choroby nerek Cistanche

Analizy statystyczne.

Statystykę wykonano za pomocą pakietu statystycznego dla nauk społecznych wersja 23 (IBM Corporation, Armonk NY, USA), wykresy wykonano za pomocą programu GraphPad Prism 7.02 dla systemu Windows (program Graph Pad, San Diego, USA), a rysunki wykonano za pomocą programu Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, USA). Wyniki przedstawiono jako medianę i rozstęp międzykwartylowy (IQR) dla danych skośnych oraz jako częstość i odsetek, gdy dane były kategoryczne. Porównaliśmy grupy za pomocą testów U Manna–Whitneya (dwustronna wartość p<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Dostępność danych

Nerka zmarłego dawcy inerkaObrazy z autoradiografii biorcy przeszczepu wychwytu [18F]-fluorku sodu ([18F]-NaF) wraz z nałożonymi obrazami wychwytu [18F]-NaF z barwieniem czerwienią alizaryną mikrozwapnień i barwieniem Von Kossy zwapnień są dostępne online jako informacje uzupełniające. Wszystkie dodatkowe dane zostaną udostępnione na żądanie, zgodnie z przepisami IRB Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Groningen.

Bibliografia

1. Gwinner, W. i in. Wczesne zwapnienie allogenicznych przeszczepów nerki wykryte przez biopsje protokołu: przyczyny i implikacje kliniczne. Jestem. J. Przeszczep. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. i Unwin, RJ Co to jestnefrokalcynoza?. Nerka wewn. 88, 35-43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontyna chroni przed wysokimi stężeniami fosforanównefrokalcynozai zwapnienie naczyń. Nerka wewn. 89, 1027-1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Wczesna obecność odkładania się szczawianu wapnia wnerkaBiopsje grafu wiążą się ze słabym długoterminowym przeżyciem przeszczepu. Jestem. J. Przeszczep. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. i in. Lokalizacja, etiologia i wpływ złogów fosforanu wapnia w alloprzeszczepach nerki. Jestem. J. Przeszczep. 9, 2470-2478 (2009).

6. Nankivell, BJ i in. Historia naturalna przewlekłej nefropatii przeszczepu allogenicznego. N. Engl. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. i in. Czynniki ryzyka przewlekłej nefropatii przeszczepu allogenicznego po przeszczepieniu nerki: badanie biopsji protokołu. Nerki Int.67, 341-348 (2005).

8. Bagnasco, SM i in. Złogi szczawianu w biopsjach z natywnej i przeszczepionej nerki oraz wpływ na funkcję przeszczepu. Nefrol. Wybierz. Przeszczep. 24, 1319-1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Odkładanie się szczawianu w biopsjach przeszczepu nerki w ciągu 3 miesięcy po przeszczepie jest związane z dysfunkcją przeszczepu. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Czy zapomnieliśmy o obrazowaniu przed i po przeszczepie nerki?. Eur. Radiol. 28, 3263-3267 (2018).

11. Beheshti, M. i in. 18F-NaF PET/CT: wytyczne procedury EANM do obrazowania kości. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Obrazowanie 42, 1767-1777 (2015).

12. Dweck, MR i in. Wychwyt fluorku sodu 18F przez tętnice wieńcowe. J. Am. Dz. Kardiol. 59, 1539-1548 (2012).

13. Dweck, MR i in. Wychwyt 18F-fluorku sodu jest markerem aktywnego zwapnienia i progresji choroby u pacjentów ze zwężeniem aorty. Okr. Kardiovasc. Obrazowanie 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. i in. Możliwość wykonania PET/CT z fluorkiem sodu 18F do obrazowania blaszki miażdżycowej. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Identyfikacja celu w diagnostyce i interwencji wrażliwych blaszek miażdżycowych poza obrazowaniem metodą pozytonowej tomografii emisyjnej 18F-fluorodeoksyglukozy: obiecujące znaczniki na horyzoncie. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Obrazowanie 46, 251-265 (2019).

16. Irkle, A. i in. Identyfikacja aktywnego mikrozwapnienia naczyń za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej z fluorkiem sodu 18F. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD i in. Wzmocnienie sygnału 18 F-fluorku identyfikuje mikrozwapnienia związane z niestabilnością blaszek miażdżycowych na obrazach z pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej. Okr. Kardiovasc. Obrazowanie 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM i in. Wychwyt naczyniowy w tomografii pozytonowej z fluorkiem sodu 18F: prekursor zwapnienia naczyń? J. Nucl. Kardiol. (2020).

19. Derlin, T. i in. Korelacja stanu zapalnego oceniona przez 18F-FDG PET, aktywne odkładanie minerałów ocenione przez 18F-fluorek PET i zwapnienie naczyń w blaszce miażdżycowej: badanie PET/CT z podwójnym znacznikiem. J. Nucl. Med. 52, 1020-1027 (2011).

20. Kitagawa, T. i in. Wartość prognostyczna pozytonowej tomografii emisyjnej z fluorkiem sodu 18F w wykrywaniu choroby wieńcowej wysokiego ryzyka w połączeniu z tomografią komputerową. J. Am. Serca dr hab. 7, e010224 (2018).

21. Back, M. i in. Endogenne inhibitory zwapnienia w zapobieganiu zwapnieniu naczyń: konsensus w ramach akcji COST EuroSofCalcNet. Przód. Kardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. i in. Pozytronowa tomografia emisyjna z 18F-fluorkiem sodu oceniła mikrozwapnienia w blaszkach tętnicy szyjnej człowieka, które są odpowiedzialne i nie są winne. J. Nucl. Kardiol. 26, 1064-1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrektomia po niepowodzeniu przeszczepu: obecna praktyka i wyniki. Jestem. J. Przeszczep. 7, 1961-1967 (2007).

24. Kwieciński, J. i in. Obrazowanie z 3-godzinnym opóźnieniem poprawia ocenę wieńcowego PET z fluorkiem sodu 18F. J. Nucl. Med. 60, 530-535 (2019).

25. Bucerius, J. i in. Stanowisko Komitetu Sercowo-Naczyniowego Europejskiego Towarzystwa Medycyny Nuklearnej (EANM) w sprawie obrazowania PET miażdżycy. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Obrazowanie 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. i in. Nerki świń DCD przeanalizowano za pomocą MRI, aby ocenić ex vivo ich żywotność. Transplantacja 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. i in. Infuzja mezenchymalnych komórek zrębu do świńnerkipodczas normotermicznej perfuzji maszynowej: nienaruszone MSC można prześledzić i zlokalizować w kłębuszkach nerkowych. wewn. J. Mol. Nauka. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. i in. Przewodnik referencyjny z 2018 r. dotyczący klasyfikacji patologii przeszczepów nerkowych według Banfa. Transplantacja 102, 1795-1814 (2018).

29. Reijrink, M. i in. Wychwyt [18F]FDG w tkance tłuszczowej nie jest związany z zapaleniem w cukrzycy typu 2. Mol. Obrazowanie Biol.23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. i in. Zwapnienie naczyń i zwłóknienie aorty to dwufunkcyjna rola osteopontyny w miażdżycy cukrzycowej. Art.. TrombVascBiol 31, 1821-1833 (2011).

31. Brocher, J. Jakościowa i ilościowa ocena dwóch nowych histogramów ograniczających algorytmy binaryzacji. wewn. J. Proces obrazu. 8, 30–48 (2014).

Podziękowanie

Ten projekt badawczy jest wspierany grantem Fundacji De Cock-Hadders (kod projektu 2018-03).

Autorskie Wkłady

SB przyczynił się do projektu, nabycia i analizy oraz przygotował szkic rękopisu. IFA, MR i MLCB przyczyniły się do zaprojektowania, pozyskania i analizy oraz merytorycznie poprawiły manuskrypt. SPB, CM i MHdB wnieśli wkład w koncepcję i merytorycznie zrewidowali manuskrypt. JLH, RHJAS i RAP wnieśli wkład w koncepcję, projekt i analizę oraz dokonali merytorycznej korekty manuskryptu.

Konkurujące interesy

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.