Klonowanie genów, identyfikacja funkcjonalna, analiza strukturalna i ekspresyjna syntazy sacharozy z Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analiza ekspresji CtSus w różnych częściach Cistanche tubulosa i systemie hodowli komórkowych w warunkach stresu suszy

4.1 Analiza ekspresji CtSus w różnych częściach Cistanche tubulosa

Doświadczenia in vitro z transformacją całych komórek i eksperymenty z enzymatyczną reakcją katalityczną potwierdziły, że białko kodowane przez gen CtSus może katalizować syntezę UDP-glukozy. W celu dalszego zbadania korelacji między tym genem a biosyntezą związków glikozydowych u Cistanche tubulosa przeanalizowano poziom ekspresji tego genu w różnych częściach Cistanche tubulosa.

WYSOKIEJ JAKOŚCI ZIOŁO CISTANCHE Z 10-98% ECHINAKOZYDEM

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>część nadziemna; wśród nich zawartość echinakozydu w haustorii jest najwyższa.

Przeprowadzono ilościową PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym, stosując cDNA z różnych części Cistanche tubulosa jako matryce, a wyniki analizowano metodą 2–ΔΔCT i przeprowadzono analizę różnicową. Wyniki przedstawiono na rysunku 4A. Poziom ekspresji genu CtSus w haustorii był najwyższy, 1,5 razy większy niż w części nadziemnej, a poziom ekspresji w części podziemnej był istotnie wyższy niż w części nadziemnej, co jest zgodne ze schematem akumulacji glikozydów fenyloetanoidowych reprezentowany przez echinakozyd w różnych częściach Cistanche tubulosa.

Rycina 4 Względne poziomy ekspresji CtSus w różnych częściach C. tubulosa i komórkach zawiesinowych traktowanych PEG6000. A: Względny poziom ekspresji CtSus w różnych częściach C. tubulosa; B: Poziom względnej ekspresji CtSus w komórkach zawiesiny C. tubulosa traktowanych PEG6000 w różnych punktach czasowych. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 Analiza ekspresji CtSus w komórkach zawiesinowych Cistanche desericola w warunkach stresu suszy

Wstępne badania w ramach projektu wykazały, że stres suszy wywołany przez PEG6000 może znacząco zwiększyć akumulację glikozydów fenyloetanolowych w komórkach zawiesinowych Cistanche Deserticola. Od 3 do 9 dni po indukcji zawartość echinaceazydu znacznie wzrosła. Od 12 do 15 dnia tempo wzrostu zawartości echinakozydu uległo spowolnieniu i osiągnęło wartość maksymalną w 15 dniu. Następnie, wraz ze wzrostem czasu hodowli, zawartość echinakozydu znacząco wzrosła. Stopniowo zmniejszała się zawartość fruktozydu [24]. Na podstawie tych badań w niniejszym artykule wykorzystano cDNA nietraktowanych komórek Cistanche Deserticola w zawiesinie i indukowanych PEG6000- komórek Cistanche Deserticola w zawiesinie jako matryce do przeprowadzenia ilościowej detekcji PCR metodą fluorescencji w czasie rzeczywistym w celu zbadania genu CtSus w komórkach Cistanche Deserticola w zawiesinie w warunkach warunki stresu suszy. Zmiany w poziomach ekspresji. Wyniki przedstawiono na rysunku 4B. W komórkach zawiesinowych Cistanche desericola indukowanych PEG6000 ekspresja CtSus znacząco wzrosła 6 dnia po indukcji, osiągnęła najwyższą wartość 9 dnia, a następnie spadła do tego samego poziomu co kontrola. Grupy na tym samym poziomie. Powyższe wyniki pokazują, że stres suszy może znacząco zwiększyć ekspresję genu CtSus w linii komórek zawiesinowych Cistanche desericola, co jest zgodne ze wzorcem akumulacji echinaceazydu pod wpływem stresu suszy. Jednakże szczytowa ekspresja genu CtSus pojawia się wcześniej niż szczyt zawartości echinaceazydu, ponieważ aktywny donor glikozylu syntetyzowany w wyniku katalizy CtSus jest ważnym prekursorem wymaganym do wieloetapowej reakcji glikozylacji w późniejszym szlaku biosyntezy echinaceazydu. spekuluje się, że organizmy poddane stresowi suszy będą preferencyjnie mobilizować geny związane z metabolizmem pierwotnym, aby osiągnąć akumulację aktywnych dawców, a następnie osiągnąć akumulację produktów metabolizmu w ramach metabolizmu wtórnego.

5 Badanie trójwymiarowej struktury białka CtSus i analiza kluczowych miejsc aktywnych

W oparciu o funkcję CtSus w katalizowaniu wytwarzania donora glikozylu UDP-glukozy, zbadano strukturalne podstawy aktywności katalitycznej CtSus. Do przewidywania struktury drugorzędowej białka wykorzystano narzędzie internetowe SOPMA. Wyniki pokazały, że drugorzędowa struktura CtSus zawierała 55,28% -helis, 25,47% losowych cewek, 12,80% wydłużonych nici i 6,46% -zwojów (Rysunek 5A), co wskazuje, że -helisy są najważniejszymi drugorzędowymi jednostkami strukturalnymi w białku CtSus, po których następują losowe cewki, które również stanowią dużą część białka. Wydłużone pasma i skręty są rozmieszczone w całym białku. Według istniejących badań syntaza sacharozy występuje zwykle w postaci tetrameru, co uważa się za jej aktywną formę. Dlatego w tym artykule dalej wykorzystano AlphaFold2 do przewidywania struktury białka CtSus i uzyskano jego trójwymiarową strukturę tetramerów białkowych. Porównanie bazy danych PDB (Protein Data Bank) wykazało, że podobieństwo sekwencji między syntazą sacharozy Arabidopsis thaliana AtSus1 (PDBID 3S28) i CtSus może osiągnąć 77,93%. Przewidywaną strukturę CtSus porównano z trójwymiarową strukturą AtSus1, a wartość średniego odchylenia kwadratowego (RMSD) po superpozycji białka wyniosła 1, 11 Å, co wskazuje, że struktury przestrzenne obu są wysoce spójne (ryc. 5B).

Rysunek 5 Badania strukturalne CtSus. A: Przewidywana struktura drugorzędowa CtSus przy użyciu SOPMA.Blue: helisa; Fioletowy: losowa cewka; Czerwony: splot przedłużony; Zielony: prześcieradło. B: Trójwymiarowe dopasowanie struktury AtSus1 (w kolorze niebieskim) i CtSus (w kolorze zielonym). Obydwa pokazano jako tetramer.C: Kluczowe reszty w kieszeni wiążącej substrat AtSus1 (w kolorze niebieskim) i CtSus (w kolorze zielonym ze znakowanymi resztami); D: Dopasowanie konformacji wiązania UDP i fruktozy w AtSus1 (w kolorze niebieskim) i CtSus (w kolorze zielonym); E: Interakcje pomiędzy UDP i CtSus pokazane na diagramie 2D przeanalizowanym przez klienta Discovery Studio

Opisaną strukturę krystaliczną kompleksu białko-ligand Arabidopsis AtSus1 z UDP i fruktozą (PDBID3S29) wykorzystano jako matrycę [16] do analizy sposobu wiązania CtSus z UDP i fruktozą. Wyniki dokowania molekularnego pokazano na rysunku 5C. Można zaobserwować, że kieszenie wiążące substrat AtSus1 i CtSus są bardzo podobne pod względem typu aminokwasów, rozmieszczenia przestrzennego i konfiguracji, a nakładanie się jest duże, co dowodzi, że sekwencja syntazy sacharozy jest wysoce konserwatywna w roślinach. Konformacje dwóch ligandów, UDP i fruktozy, w kieszeni wiążącej substrat białkowy pokazano na Figurze 5D. Najbardziej korzystna konformacja dokowania molekularnego UDP i CtSus dobrze pokrywa się z konformacją UDP w kompleksie krystalicznym AtSus1-UDP, co potwierdza dokładność wyników dokowania molekularnego. Oddziaływanie między UDP i kluczowymi resztami aminokwasowymi w kieszeni wiążącej substrat białkowy pokazano na Figurze 5E. UDP i CtSus są połączone ze sobą głównie wiązaniami wodorowymi i oddziaływaniami hydrofobowymi. Kluczowe reszty aminokwasowe w kieszeni wiążącej substrat obejmują Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 i Glu681.

Dyskusja

Modyfikacja glikozylacji jest jednym z ważnych sposobów poprawy właściwości fizycznych i aktywności biologicznej produktów naturalnych lub prekursorów leków. W porównaniu z tradycyjnymi metodami chemicznymi, enzymatyczna modyfikacja glikozylacji ma zalety łagodnych warunków reakcji, dużej selektywności i przyjazności dla środowiska. Jednakże reakcja glikozylacji glikozylotransferazy wymaga dużej ilości donorów cukru UDP, które są drogie i trudne do uzyskania, co powoduje, że glikozylotransferazy nie mogą być powszechnie stosowane w produkcji przemysłowej. Syntaza sacharozy może katalizować odwracalną reakcję: sacharoza + UDP ⇌ UDP-glukoza + fruktoza i może tworzyć odnawialny cykl UDP-glukozy poprzez reakcję sprzęgania z glikozylotransferazą. Cistanche tubulosa jest bogata w różnorodne związki glikozydowe o różnych typach strukturalnych, reprezentowane przez związki glikozydowe fenyloetanolu, co sugeruje, że szlak syntezy aktywnego donora glikozylu w jego organizmie z udziałem syntazy sacharozy ma silny metabolizm, ale odpowiednia syntaza sacharozy z roślin Cistanche nie zgłoszono. W tym badaniu po raz pierwszy sklonowano gen syntazy sacharozy CtSus z Cistanche tubulosa. Białko kodowane przez ten gen zawiera konserwatywną domenę roślinnej syntazy sacharozy. Porównując sekwencję syntaz sacharozy z innych roślin stwierdzono, że podobieństwo sekwencji aminokwasów między nią a syntazami sacharozy z roślin tego samego rzędu wynosiło ponad 90%, co wskazuje na wysoki stopień zachowania sekwencji syntaz sacharozy z roślin. Analiza ewolucji molekularnej wykazała, że ​​CtSus należy do gałęzi syntazy sacharozy roślin dwuliściennych i jest najbliżej spokrewniony z syntazą sacharozy PrSus z P. ramosa z rodziny Orobanchaceae.

Aby zbadać aktywność katalityczną CtSus, w badaniu tym połączono glikozylotransferazę UGT71BD1, której aktywność została wcześniej zweryfikowana przez grupę badawczą, w celu skonstruowania systemu koekspresji z dwoma plazmidami. Dzięki eksperymentom katalitycznym na całych komórkach warunki osiągnięto bez dodawania dodatkowych dawców cukru UDP. Reakcja glikozylacji związku kumaryny, cynamonu i resweratrolu, związku stylbenu. W porównaniu z grupą kontrolną dodatek CtSus znacząco zwiększył współczynnik konwersji reakcji glikozylacji katalizowanych przez UGT71BD1-. Na tej podstawie w niniejszym badaniu skonstruowano rekombinowany plazmid ekspresyjny CtSus i uzyskano rozpuszczalną ekspresję rekombinowanego białka w E. coli. Enzymatyczne reakcje katalityczne in vitro pokazują, że w obecności sacharozy i UDP, CtSus może katalizować wytwarzanie UDP-glukozy, a po usunięciu znacznika powinowactwa czynnika wyzwalającego zawartego w rekombinowanym białku, produkt CtSus katalizujący wytwarzanie UDP -otrzymuje się glukozę. Stawka została znacznie poprawiona. Wyniki transformacji całych komórek i enzymatycznej reakcji katalitycznej in vitro potwierdziły aktywność CtSus jako katalitycznego aktywnego donora cukru UDP-glukozy, katalitycznego syntazy sacharozy. W celu dalszego zbadania korelacji między genem CtSus a biosyntezą glikozydów w Cistanche tuberosum analizowano ekspresję CtSus w różnych częściach Cistanche tuberosum za pomocą ilościowych eksperymentów PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym. Wyniki wykazały, że gen ulegał ekspresji w haustorii Cistanche tuberosum. Najwyższy poziom ekspresji. Cistanche Deserticola jest rośliną pasożytniczą i nie może uzyskać składników odżywczych niezbędnych do wzrostu i rozwoju w procesie fotosyntezy. Dlatego musi pasożytować na korzeniach rośliny żywicielskiej i polegać na roślinie żywicielskiej w zakresie pozyskiwania składników odżywczych w celu utrzymania wzrostu. W roślinach sacharoza dostarcza głównie energii i dawców źródeł węgla [12]. Jednakże sacharoza nie może być bezpośrednio wykorzystana przez komórki i wymaga dalszego rozkładu. Haustoria jest pomostem łączącym Cistanche Deserticola z rośliną żywicielską i odgrywa kluczową rolę w procesie jej wzrostu. kluczowy

[25], zatem wysoka ekspresja syntazy sacharozy w haustorii Cistanche desericola jest uzasadniona. Wysoka ekspresja CtSus w haustorii jest również zgodna z dużym wzorcem akumulacji glikozydów fenyloetanoidowych w haustorii. Ponadto, poprzez ilościową analizę fluorescencyjną PCR zmian w poziomach ekspresji genu CtSus w komórkach zawiesiny Cistanche desericola w różnych punktach czasowych w warunkach stresu suszy, stwierdzono, że stres suszy może znacząco zwiększyć ekspresję genów CtSus w linii komórek zawiesiny, co jest zgodny z echinaceazydem. Schemat akumulacji w liniach komórkowych zawiesiny pod wpływem stresu suszy jest spójny. Powyższe wyniki sugerują, że CtSus bierze udział w szlaku biosyntezy glikozydów fenyloetanoidowych reprezentowanych przez echinaceę w Cistanche tulipis in vivo. Jest to jeden z wielu szlaków biosyntezy. W pierwszym etapie reakcja glikozylacji dostarcza aktywnego donora glikozylu, UDP-glukozy. Krótko mówiąc, to badanie

W badaniu zidentyfikowano nowy gen syntazy sacharozy u Cistanche Deserticola, który umożliwił enzymatyczną syntezę in vitro aktywnych dawców glikozylu i dostarczył nowych elementów genetycznych do konstrukcji bakterii inżynieryjnych do biosyntezy glikozydów Cistanche Deserticola.

Wkład autorów: Tian Weisheng był odpowiedzialny za analizę bioinformatyczną, analizę ekspresji, analizę aktywności enzymatycznej i napisanie pierwszego projektu genu CtSus; Yan Yaru był odpowiedzialny za badania przesiewowe i klonowanie genów; Cui Xiaoxue i Huang Wenqian uczestniczyli w analizie bioinformatycznej i analizie ekspresji; Wang Yingxia i Zhao Saijing uczestniczyli w konstrukcji wektora i analizie aktywności enzymów; Li Jun i Shi Shepo zajmowali się głównie analizą aktywności enzymatycznej i analizą ekspresji; Tu Pengfei i Liu Xiao byli odpowiedzialni za projekt pomysłu na artykuł, kierowanie eksperymentami oraz napisanie i sprawdzenie artykułu. W redakcji artykułu uczestniczyli wszyscy autorzy.

Referencje

[1] Piosenka ZH, Lei L, Tu PF. Postępy w badaniach aktywności farmakologicznej roślin CistancheHoffinga. i Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ i in. Porównanie chemomów między uprawnymi i dzikimi Cistanchetubulosa przy użyciu spektroskopii 1H-NMR [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y i in. Cistanches Herba, od gatunku zagrożonego do wielkiej marki medycyny chińskiej [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M i in. Polisacharydy Cistanche Deserticola chronią komórki PC12 przed uszkodzeniem wywołanym OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X i in. Ewolucja enzymów przemiany nukleotydów roślinnych w cukier [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Tworzenie cukru nukleotydowego w roślinach, interkonwersja i odzyskiwanie poprzez recykling cukru [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H., Li L., Wang PG. Charakterystyka biochemiczna UDP-GlcNAc/Glc4-epimerazy z Escherichia coli O86:B7 [J]. Biochemia, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr i in. Identyfikacja UDP-N-acetyloglukozaminy4-epimerazy zaangażowanej w glikozylację białek egzosporium u Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Identyfikacja całego transkryptomu genów syntazy sacharozy w Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M i in. Syntaza sacharozy: unikalna glikozylotransferaza do rozwoju procesu biokatalitycznej glikozylacji [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. The biosynthesis of sacrose [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.