Klonowanie genów, identyfikacja funkcjonalna, analiza strukturalna i ekspresyjna syntazy sacharozy z Cistanche Tubulosa Ⅱ

Wyniki i analiza

1 Wydobywanie genów syntazy sacharozy w Cistanche tubulosa i klonowanie genu CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>część powietrzna.

Wysokiej jakości Cistanche Tubulosa dla zdrowia mężczyzn

Dlatego wartości poziomu ekspresji FPKM dwóch kandydatów na geny syntazy sacharozy uzyskane podczas wstępnego badania przesiewowego danych transkryptomu różnych części Cistanche tubulosa znormalizowano za pomocą Z-Score i przeprowadzono analizę różnicową (Figura 1A). Wyniki wykazały, że gen CtSus charakteryzował się najwyższym poziomem ekspresji w haustorium, a poziom ekspresji w części podziemnej był wyższy niż w części nadziemnej, co było zgodne ze schematem akumulacji związków glikozydowych w różnych częściach Cistanche tubulosa, podczas gdy poziom ekspresji genu CtSus1 w haustorium był niski. Zatem w oparciu o powyższe wyniki wybrano gen CtSus do późniejszej amplifikacji sekwencji, ekspresji egzogennej i identyfikacji funkcjonalnej. Stosując cDNA Cistanche tubulosa jako matrycę, po amplifikacji PCR otrzymano produkt jednopasmowy o ~2500 bp (Figura 1B). Produkt PCR odzyskano z żelu i zligowano z wektorem do klonowania, a region kodujący docelowego genu pełnej długości otrzymano przez sekwencjonowanie. Długość sekwencji CtSus wynosiła 2418 pz.

Rycina 1 Badanie genów i klonowanie CtSus z C. tubulosa oraz analiza bioinformatyczna zakodowanego w nim białka. A: Poziomy ekspresji genów CtSus i CtSus1 w różnych częściach C. tubulosanormalizowane jako wskaźniki Z w oparciu o ich wartości FPKM; B: Amplifikacja genu CtSus; M: marker DNA; C: domena konserwatywna białka CtSus przewidywana metodą SMART; D: Wielokrotne dopasowanie sekwencji syntaz CtSus i sacharozy zidentyfikowanych z innych roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum i Albuca bracteata. Domena syntezy sacharozy i domena przenoszenia cukru są reprezentowane odpowiednio przez czerwone i niebieskie ramki; E: Analiza filogenetyczna CtSus i syntaz sacharozy z innych roślin; F: Analiza SDS-PAGE heterologicznej ekspresji CtSus przy użyciu wektora pCold™ I w E. coli. Ścieżka 1: Marker białkowy; Ścieżka 2: Frakcja supernatantu; Ścieżka 3: Frakcja osadu. Czerwona strzałka pokazuje białko CtSus. G: PCR na koloniach pojedynczego klonu zawierającego oba dwa rekombinowane plazmidy. M: marker DNA; 1: pet-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabela 2 Podobieństwa sekwencji aminokwasów pomiędzy CtSus i syntazami sacharozy zidentyfikowanymi z innych roślin

2.3 Analiza filogenetyczna

Drzewo filogenetyczne skonstruowane za pomocą oprogramowania MEGA wykorzystano do analizy związku filogenetycznego między syntazą sacharozy CtSus z Cistanche tubulosa i innymi syntazami sacharozy pochodzenia roślinnego. Wyniki przedstawiono na rysunku 1E. Syntazy sacharozy pochodzenia roślinnego wykazują odrębne gałęzie ewolucyjne u roślin dwuliściennych (regiony I i II) i jednoliściennych (region III). CtSus należy do gałęzi dwuliściennej, a sekwencje najściślej spokrewnione z CtSus pochodzą z roślin Lamiaceae (Cistanche tubulosa to roślina Lamiaceae Orobanchaceae), podczas gdy druga gałąź składa się głównie z roślin Solanales, co dodatkowo wskazuje na wysoką ochronę i Homologia genów syntazy sacharozy pochodzenia roślinnego w ewolucji roślin w tej samej kolejności. Wśród nich najbliżej spokrewniona z CtSus jest syntaza sacharozy PrSus (AEN79500.1) z Phelipanche ramosa z rośliny Orobanchaceae.

3 Egzogenna analiza ekspresji i aktywności CtSus

3.1 Egzogenna ekspresja genu CtSus Plazmidy pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus i pCold™ I-CtSus zweryfikowane poprzez sekwencjonowanie przeniesiono do kompetentnej ekspresyjnie E. coli Transetta (DE3), a pozytywne klony przeszukiwano metodą PCR na koloniach w celu weryfikacji sekwencjonowania. Otrzymane rekombinowane szczepy ekspresyjne indukowano niską temperaturą IPTG w celu ekspresji białka, bakterie zebrano przez wirowanie i dodano bufor do lizy w celu rozbicia bakterii w celu otrzymania supernatantu i osadu, a do wykrywania przeprowadzono SDS-PAGE. Wyniki pokazały, że gdy jako wektory ekspresyjne zastosowano pET-28a i pET-24b, CtSus nie ulegał ekspresji w E. coli, natomiast gdy jako wektor ekspresyjny stosowano pCold™ I, wyraźny CtSus prążek rekombinowanego białka wykryto w regionie ~100 kDa, co było zgodne z jego teoretycznie przewidywaną względną masą cząsteczkową wynoszącą 92,2 kDa (Figura 1F).

3.2 Transformacja całych komórek

W celu wstępnej weryfikacji funkcji katalitycznej CtSus skonstruowano szczep koekspresyjny CtSus i genu glikozylotransferazy UGT71BD1. UGT71BD1 został sklonowany i zidentyfikowany z Cistanche tubulosa i jest UDP-glukozylotransferazą, która może powszechnie akceptować związki aromatyczne, takie jak glikozydy fenyloetanoidowe, różne rodzaje flawonoidów, stylben i kumaryna jako receptory i katalizować reakcję glukozylacji substratu fenolowej grupy hydroksylowej przy użyciu UDP-glukozy jako dawca cukru [18]. Wprowadzenie CtSus może teoretycznie zapewnić większą ilość donora glikozylu UDP-glukozy do reakcji glukozylacji katalizowanej przez UGT71BD1, promując w ten sposób równowagę reakcji w kierunku tworzenia produktów glikozylacji, zwiększając w ten sposób wydajność produktów glikozylacji. Plazmid pCold™ I-CtSus i plazmid pET-28a-UGT71BD1 transformowano jednocześnie do kompetentnej ekspresyjnie E. coli Transetta (DE3). Pojedyncze klony zawierające oba rekombinowane plazmidy przeszukano metodą PCR na koloniach i uzyskano pozytywne szczepy ekspresyjne rekombinowane poprzez weryfikację sekwencjonowania (Figura 1G). Koekspresję podwójnego genu indukowano in vitro, a szczep ekspresyjny pojedynczego genu pET-28aUGT71BD1 zastosowano jako grupę kontrolną. Aktywność CtSus w katalizowaniu wytwarzania donora UDP-glukozy została wstępnie sprawdzona poprzez transformację całych komórek. Wyniki HPLC i wysokorozdzielczej spektrometrii masowej wykazały, że gdy reakcję transformacji całych komórek przeprowadzono z akonityną 1 i resweratrolem 2 jako substratami, wytworzenie oczywistych produktów glikozylacji wykryto po 24 godzinach transformacji, jak pokazano na rycinie 2.

Figura 2 Biotransformacja substratu 1 lub 2 w całych komórkach odpowiednio przez rekombinowany szczep niosący UGT71BD1 lub rekombinowany szczep niosący sprzężenie UGT71BD1 z CtSus. A: Chromatogramy HPLC biotransformacji substratu 1 w całych komórkach. Długość fali detekcji wynosiła 360 nm; B: widma HRESI-MS i MS2 produktu 1a; C: Chromatogramy HPLC biotransformacji substratu 2 w całych komórkach; Długość fali detekcji wynosiła 330 nm. D: Widma HRESI-MS produktów 2a i 2b

Gdy 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, wzór cząsteczkowy C9H6O4) zastosowano jako substrat, pik chromatograficzny produktu 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, przewidywany wzór cząsteczkowy C15H16O9) wykryto przy 5,39 min, co było zgodne z UV absorpcja substratu i produktu kontrolnego. W tym samym czasie w widmie MS2 1a wykryto pik fragmentu o m/z 179.033 4 [M+H]+ wykryto w widmie MS2 1a, który powstał w wyniku utraty cząsteczki glukozy (162 Da) przez 1a, co wskazuje, że 1a był produktem substratu 1 połączonego z cząsteczką glukozy. Współczynnik konwersji obliczono całkując powierzchnię piku. Stwierdzono, że stopień konwersji całych komórek UGT71BD1 katalizujących substrat 1 w celu wytworzenia glikozylowanego produktu 1a wyniósł 71,87%, natomiast dodatek CtSus zwiększył współczynnik konwersji reakcji do 95,84%, czyli 1,3 razy więcej niż w grupie kontrolnej. Gdy substratem był związek 2 (m/z 227,072 5 [MH]-, wzór cząsteczkowy C14H12O3), produkt ma piki chromatograficzne 2a (m/z 389,123 4 [MH]-, przewidywana cząsteczka wzór C20H22O8) i 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, przewidywany wzór cząsteczkowy C26H32O13) zgodny z charakterystyczną absorpcją UV podłoża i produktu kontrolnego wykryto odpowiednio po 10,32 i 6,52 min . Pik fragmentu wykryto przy 3 [MH]-, który powstał w wyniku utraty jednej cząsteczki glukozy (162 Da), co wskazuje, że 2a był produktem substratu 2 połączonego z jedną cząsteczką glukozy. Porównując dane z literatury [18] oraz informacje prognozowane za pomocą spektrometrii mas, ustalono, że produkt 2b jest produktem substratu 2 połączonego z dwiema cząsteczkami glukozy. Współczynnik konwersji obliczono przy użyciu zintegrowanej powierzchni piku. Stwierdzono, że dodatek CtSus może zwiększyć stopień konwersji reakcji glikozylacji substratu 2 z 64,01% do 78,51%, w tym wydajność produktu monosacharydowego 2a wzrosła z 45,09% do 63,58%, a wydajność produktu disacharydowego 2b zmieniło się z 18,92% na 14,93%.

3.3 Oczyszczanie rekombinowanego białka CtSus i identyfikacja aktywności enzymatycznej in vitro

Wyniki eksperymentu transformacji całych komórek sugerują, że CtSus ma działanie katalizujące wytwarzanie aktywnego donora glukozy UDP-glukozy. W celu dalszej bezpośredniej weryfikacji tej aktywności katalitycznej poprzez enzymatyczną reakcję katalityczną in vitro, białko fuzyjne genu CtSus w układzie ekspresyjnym pCold™ oddzielono i oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa. Wyniki pokazały, że gdy jako wektor ekspresyjny zastosowano pCold™ I, rekombinowane białko ulegało ekspresji w dużych ilościach, ale głównie w osadzie. Gdy jako wektor ekspresyjny zastosowano pCold™ TF, gen CtSus ulegał ekspresji w dużych ilościach w E. coli (Figura 3A). Białko fuzyjne oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa HisTrap FF i poddano enzymatycznej reakcji katalitycznej in vitro. Wyniki przedstawiono na rysunku 3B. Gdy jako substraty zastosowano sacharozę i UDP, w porównaniu z grupą kontroli negatywnej, pik nowego produktu wykryto przy 10,32 min. Jego czas retencji i absorpcja UV były zgodne z UDP-glukozą. W porównaniu ze standardem stwierdzono, że produktem jest UDP-glukoza. Jednakże, ponieważ białko fuzyjne wyrażane przez wektor ekspresyjny pCold™ TF zawiera duży rozpuszczalny znacznik czynnika wyzwalającego (wielkość białka znacznikowego wynosi 48 kDa), będzie to miało duży wpływ na aktywność katalityczną białka. W związku z tym znacznik białka fuzyjnego został dalej cięty przez enzym Czynnik Xa i oczyszczono białko CtSus bez znaczników egzogennych (Figura 3A). Białko poddano katalizie enzymatycznej in vitro, a wyniki wykazały, że wydajność UDP-glukozy wzrosła z 3,53% do 10,66%

(Rysunek 3B). Powyższe wyniki potwierdziły aktywność CtSus w katalizowaniu wytwarzania UDP-glukozy poprzez katalizę enzymatyczną in vitro, a także pokazały, że obecność znacznika o dużym powinowactwie sprzyja rozpuszczalnej ekspresji CtSus, ale będzie także znacząco wpływać na Aktywność katalityczna enzymu in vitro.

Rycina 3 Heterologiczna ekspresja i identyfikacja funkcjonalna CtSus. A: Analiza SDS-PAGE białek CtSus. Ścieżka 1: Marker białkowy; Ścieżka 2: Rekombinowany CtSus z czynnikiem wyzwalającym; Ścieżka 3: Cięcie znacznika czynnika wyzwalającego przy użyciu proteazy czynnika Xa z wytworzeniem białka CtSus oznaczonego czerwoną strzałką. B: Testy enzymatyczne in vitro z wykorzystaniem białka fuzyjnego i wolnych od czynników wyzwalających białek CtSus do katalizowania syntezy UDP-glukozy w obecności odpowiednio sacharozy i UDP, ze standardem referencyjnym UDP-glukozy. Gotowane białko zastosowano jako grupę kontrolną w tych samych warunkach. Długość fali detekcji wynosiła 260 nm