Synergistyczne działanie przeciwzapalne ekstraktu z Laminaria Japonica Fucoidan i Cistanche Tubulosa

W odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcym antygenom makrofagi uwalniają cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu (TNF-), interleukina-1 (IL- 1), IL-6 i inne. Takie cytokiny indukują chemotaktyczny napływ granulocytów, monocytów, limfocytów i komórek tucznych do uszkodzonej tkanki, co sprzyja usuwaniu antygenu i regeneracji tkanki. Jednakże nadmierny naciek i aktywacja komórek pogłębia uszkodzenia tkanek, prowadząc do obrzęku (wysięku naczyniowego) i bólu, które są dobrze znanym zjawiskiem zapalnym.

TNF- jest ważnym czynnikiem indukującym ekspresję genu syntazy tlenku azotu (iNOS) w kilku liniach komórkowych. Aktywacja iNOS prowadzi do produkcji tlenku azotu (NO), który nie tylko moduluje kilka funkcji fizjologicznych, takich jak działanie bakteriobójcze i rozszerzenie naczyń, ale także powoduje stan zapalny. Po uszkodzeniu tkanki, degradacja fosfolipaz fosfolipidów błony komórkowej wytwarza kwas arachidonowy. Kwas arachidonowy jest dalej rozkładany przez cyklooksygenazę (COX) do prostaglandyn (PG). Nadmierna ilość PGE2 wytworzona przez COX-II indukuje kilka cytokin odpowiedzialnych za stan zapalny. Ponieważ zarówno NO, jak i PGE2 działają jako główne czynniki wywołujące stan zapalny i ból, głównymi strumieniami procesu zapalnego są szlaki TNF-NO i COX-II-PGE2, które są hamowane przez kortykosteroidy i niesteroidowe lekileki przeciwzapalne(NLPZ).

Chociaż istnieje kilka sterydów i NLPZterapii chorób zapalnychleki te mogą powodować niekorzystne skutki dla układu odpornościowego, przewodu pokarmowego, nerek, wątroby, ośrodkowego układu nerwowego, ciśnienia krwi i układu sercowo-naczyniowego. Dlatego konieczne jest minimalizowanie niekorzystnego działania środków chemicznych poprzez ich zastępowanie lub stosowanie w połączeniu z produktami naturalnymi.

Fukoidan, kompleks polisacharydów siarczanowych z wodorostów, takich jak Laminaria japonica i Cladosiphon okamuranus, szeroko rozpowszechniony w wielu krajach, był od długiego czasu stosowany jako środek leczniczy w medycynie Wschodu. We wcześniejszych badaniach wykazano, że fukoidan ma działanie przeciwutleniające, przeciwzakrzepowe, przeciwnowotworowe idziałanie przeciwzapalne. W związku z tym uwagę badaczy przyciąga korzystny wpływ fukoidanu na choroby zapalne, niedokrwienie, dysfunkcję układu odpornościowego i nowotwory. Z drugiej strony,Cistanche tubulosa(CT) jest również szeroko stosowany jako tradycyjny lek w Chinach. Doniesiono, że ekstrakty CT obniżają wytwarzanie TNF-á i IL- 4, które są głównymi czynnikami wytwarzania NO w szlakach zapalnych [19].

Takie wcześniejsze odkrycia skłoniły nas do zbadania łącznej skuteczności fukoidanu i ekstraktu CT na 2 głównych szlakach zapalenia. Aby wyjaśnić mechanizm działania, przeanalizowaliśmy NO i PGE2 w wysiękach powstałych w wyniku zapalenia worka powietrznego wywołanego karagenem.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO ZAPOBIEGANIADZIAŁANIA ZAPALNEPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiały i metody

Przybory

Półoczyszczony fukoidan i wodny ekstrakt CT otrzymano od Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Ekstrakt Fukoidan i CT utrzymywano w temperaturze 4 stopni, zmieszano (1:3) rozpuszczono w oczyszczonej wodzie przed użyciem i podawano doustnie w objętości 5 ml/kg.

Hodowla komórkowa i oznaczanie ilościowe NO

Linię komórkową makrofagów mysich RAW 264.7 zakupiono z American Type Culture Collection (Manassas, USA) i hodowano w pożywce Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco (Sigma, St. Louis, USA) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyki [100 U/ml penicylina (Sigma) i 100 µg/ml streptomycyny (Sigma)]. Komórki inkubowano w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C.

Aby ocenić wpływ fukoidanu i ekstraktu CT na wydzielanie NO, komórki RAW 264.7 (1×106 komórek/ml) inkubowano z fukoidanem lub ekstraktem CT (1–320 µg/ml) przez 5 minut , a następnie interferon- (IFN-, 10 U/ml) i lipopolisacharyd (LPS, 10 µg/ml) przez 24 godziny. W naszych wstępnych badaniach potwierdzono, że leczenie IFN-plus LPS w celu aktywacji komórek RAW 264.7 nie wpływa na żywotność komórek do 24 godzin oraz że fukoidan i ekstrakt CT nie są cytotoksyczne do 1 mg/ml. Jako wskaźnik NO mierzono stężenie azotynów (NO2 – ), utlenionego produktu NO. Pożywkę hodowlaną zmieszano z równą objętością odczynnika Griessa (1% sulfanilamid, 0,1% naftyloetylenodiamina w 2,5% kwas fosforowy) [21] i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Stężenie azotynów analizowano przy 540 nm, gdzie do wygenerowania krzywej standardowej wykorzystano NaNO2.

Zwierzęta i leczenie

Samce myszy ICR (w wieku 7 tygodni) zakupiono od Daehan Biolink (Eumseong, Korea) i trzymano w pomieszczeniu o stałych warunkach otoczenia (22±2°C; 40-70% wilgotności względnej; 12-godzinnego światła - cykl ciemności; jasność 150-300 luksów). Pasza w postaci granulatu i oczyszczona woda były dostępne ad libitum. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Narodowego Chungbuk (CBNU) w Korei i przeprowadzone zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) Centrum Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, CBNU.

Myszom (n=8/grupę) podano doustnie fukoidan (18 lub 54 mg/kg), ekstrakt CT (54 lub 162 mg/kg) lub ich mieszaninę (18+54, {{6 }} lub 90+270 mg/kg) raz dziennie przez 7 dni. Niskie dawki fukoidanu (18 mg/kg) i ekstraktu CT (54 mg/kg) pochodziły z szacunkowych dawek dla ludzi wynoszących 100 mg/ciało (70 kg) i 300 mg/ciało po przeliczeniu powierzchni masy ciała (Km{{14 }} dla człowieka/Km=3 dla myszy). Wysokie dawki fukoidanu i ekstraktu CT ustalono na 3-krotność, samodzielnie lub w mieszaninie, a mieszaninę o najwyższej dawce ustalono na 5-krotność, aby ocenić maksymalne efekty synergiczne.

Pierwszego dnia leczenia fukoidanem i ekstraktem CT myszom wstrzyknięto podskórnie 10 ml sterylnego powietrza w tylną stronę, aby utworzyć woreczek [22,23]. Po 2 i 5 dniach do torebki ponownie wstrzyknięto 5 ml powietrza. Godzinę po ostatnim traktowaniu do torebki wstrzyknięto 1 ml karagenu (1% w soli fizjologicznej; Sigma) lub jego nośnika (sól fizjologiczna).

Analizy wysięków

Woreczek powietrzny przemyto 1 ml zimnej soli fizjologicznej 6 godzin po wstrzyknięciu karagenu i zarejestrowano objętość netto płynu do płukania. Całkowitą liczbę komórek zapalnych, neutrofili, monocytów i limfocytów określono za pomocą licznika Coulter. Stężenia NO i PGE2 oznaczono odpowiednio za pomocą odczynnika Griessa (Sigma) i testu immunoenzymatycznego (EIA) przy użyciu zestawu Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO BLOKOWANIA DZIAŁANIA CHEMOTAKSY KOMÓREK ZAPALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Badanie histopatologiczne

Tkankę wyściełającą woreczek usunięto i utrwalono w obojętnym roztworze formaliny. Skrawki tkankowe zatopione w parafinie barwiono hematoksyliną-eozyną i badano pod mikroskopem świetlnym pod kątem zmian zapalnych.

Analiza statystyczna

Wyniki przedstawiono jako średnią ± SE. Porównania grup eksperymentalnych przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie poprawki testem Tukeya. Wartość AP<0.05 was considered statistically significant.

Wyniki

In vitro hodowla komórkowa RAW 264.7, leczenie IFN i LPS znacznie zwiększyło wytwarzanie NO (ryc. 1). Wstępne leczenie fukoidanem (1–320 µg/ml) nie miało wpływu na uwalnianie NO z linii komórkowej makrofagów (ryc. 1A). Dla porównania, ekstrakt CT (32–320 µg/ml) znacząco hamował wytwarzanie NO, co wskazuje na działanie przeciwzapalne (ryc. 1B).

Wstrzyknięcie karagenu do worka powietrznego myszy znacznie zwiększyło objętość wysięku w worku (ryc. 2). Takie zwiększone wysięk zostało złagodzone przez leczenie fukoidanem (18 mg/kg) i ekstraktem CT (54 i 162 mg/kg). Warto zauważyć, że skojarzone leczenie fukoidanem i ekstraktem CT dodatkowo zmniejszyło objętość wysięku w porównaniu z indywidualnymi efektami, chociaż kombinacje wyższych dawek (54+162 mg/kg i 90+270 mg/kg) nie wykazały dodatkowej skuteczności do kombinacji najniższej dawki (18+54 mg/kg) (Rysunek 2A). Zawartość stopnia N w torebce również drastycznie wzrosła po wstrzyknięciu karagenu (Rysunek 2B). W porównaniu z łagodnym działaniem fukoidanu, ekstrakt CT wyraźnie obniżył stężenie N. Skojarzone leczenie fukoidanem i ekstraktem CT dodatkowo zmniejszyło poziom NO w sposób zależny od dawki. Podobnie, zwiększona zawartość PGE2 została synergistycznie stłumiona przez terapię skojarzoną fukoidanem i ekstraktem CT (Figura 2C).

Równolegle z mediatorami stanu zapalnego w worku, liczba komórek zapalnych drastycznie wzrosła po wstrzyknięciu karagenu: 37,8, 4,8 i 24,1-krotność poziomów kontrolnych odpowiednio dla neutrofili, monocytów i limfocytów (Tabela 1). Jednakże fukoidan i ekstrakt CT znacząco zmniejszyły naciek komórek zapalnych, w którym fukoidan był nieco lepszy od ekstraktu CT. Nieoczekiwanie nie uzyskano efektu synergistycznego w nacieku komórek zapalnych przy jednoczesnym podaniu fukoidanu i ekstraktu CT.

Jak wywnioskowano z nacieku komórek zapalnych w wysiękach, tkanka podskórna otaczająca worki powietrzne wykazywała poważne zmiany zapalne (ryc. 3). Zaobserwowano niezwykle wiele komórek w pogrubionej tkance podskórnej narażonej na działanie karagenu (ryc. 3B) w porównaniu z niemal normalnymi cechami u zwierząt kontrolnych (ryc. 3A). Takie zmiany zapalne zostały znacząco złagodzone przez leczenie fukoidanem (ryc. 3C i 3D) lub ekstraktem z tomografii komputerowej (ryc. 3E i 3F).

Warto zauważyć, że silniejsze działanie przeciwzapalne uzyskano w przypadku terapii skojarzonej fukoidanem i ekstraktem CT (ryc. 3G-3I).

Dyskusja

Wykorzystując model zapalenia worka powietrznego indukowanego arragenianem in vivo, wstrzyknięcie powietrza do grzbietów gryzoni indukuje proliferację komórek, które rozwarstwiają się na powierzchni jamy, tworząc strukturę podobną do błony maziowej. W tym modelu wstrzyknięcie nacieku komórek zapalnych wywołanego karagenem zwiększyło wysięk, co wskazuje na wyciek naczyniowy. Woreczek powietrzny służy jako zbiornik komórek zapalnych i mediatorów, które można łatwo oznaczyć w płynie, który gromadzi się lokalnie.

Spośród różnorodnych mediatorów stanu zapalnego, które mogą indukować przepuszczalność naczyń, dobrze wiadomo, że NO i PGE2 są głównymi czynnikami zaangażowanymi w patogenezę wielu chorób zapalnych. Są one również znane jako mediatory wywoływania i percepcji bólu. iNOS, który ulega ekspresji i aktywacji w różnych typach komórek poprzez stymulację TNF i/lub LPS podczas stanu zapalnego, wytwarza wysokie, trwałe stężenia NO. NO jest ważną cząsteczką regulatorową spełniającą różnorodne funkcje fizjologiczne, takie jak rozszerzenie naczyń prowadzące do wycieku naczyniowego. PGE2, który jest wytwarzany z kwasu arachidonowego przez COX, przyczynia się do rozwoju wielu chorób zapalnych, a nadprodukcja PGE2 w odpowiedzi na różne stymulacje zapalne wiąże się ze zwiększeniem poziomu COX-II i postępem stanu zapalnego. Dlatego szlaki TNF- - NO i COX-II-PGE2 uznano za dwa główne strumienie procesów zapalnych, które są blokowane odpowiednio przez inhibitory iNOS (kortykosteroidy) i COX (NLPZ).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO ZAKAZANIA CHOROB ZAPALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

W niniejszym badaniu jednoczesne podawanie fukoidanu i ekstraktu CT zmniejszyło objętość wysięku w worku, co sugeruje, że mają one działanie hamujące przeciek naczyniowy (ryc. 2A). W porównaniu z indywidualnymi efektami każdego ekstraktu fukoidanu i CT, leczenie skojarzone uległo dalszemu wzmocnieniu, co sugeruje, że działanie obu stopni działa synergistycznie. Takie synergiczne działanie pomiędzy fukoidanem i ekstraktem CT zostało poparte ich działaniem na poziomy NO i PGE2 w wysiękach (ryc. 3B i 2C).

Co jednak ciekawe, potwierdzono, że fukoidan nie hamuje bezpośrednio aktywacji makrofagów w teście in vitro (ryc. 1A). Podobnie, potencjał hamujący fukoidanu na akumulację NO i PGE2 w teście in vivo był stosunkowo niższy niż ekstraktu CT (Figury 2B i 2C). Taki mechanizm działania fukoidanu różni się od bezpośredniej inaktywacji komórek przez ekstrakt CT (ryc. 1B). Dla porównania, fukoidan wykazywał wysoką skuteczność w hamowaniu nacieku komórek zapalnych w workach (Tabela 1). Fukoidan był lepszy od ekstraktu CT w blokowaniu migracji neutrofili, monocytów i limfocytów do miejsc uszkodzenia tkanek wywołanego karagenem. Co ciekawe, nie stwierdzono synergicznego działania przeciwmigracyjnego, co wskazuje na różne mechanizmy działania pomiędzy fukoidanem i ekstraktem CT: tj. fukoidan blokuje naciek komórek zapalnych, podczas gdy ekstrakt CT hamuje aktywację komórek.

Komórki polimorfojądrowe, zwłaszcza neutrofile, są głównymi składnikami komórkowymi rekrutowanymi do ostrych miejsc zapalnych indukowanych przez karagen. Ponadto powstające komórki zapalne, takie jak makrofagi i limfocyty, również odgrywają kluczową rolę w procesie zapalnym, wydzielając cytokiny. Po wstępnym potraktowaniu fukoidanem lub ekstraktem CT liczba białych krwinek, które migrowały do ​​woreczków powietrznych wypełnionych karagenem, została znacząco zmniejszona. Wynik ten był zgodny z efektem, jaki można uzyskać w przypadku kortykosteroidów, takich jak deksametazon, ale nie w przypadku NLPZ, w tym indometacyny. Dlatego przyjmuje się, że ekstrakt fukoidan i CT mają po części właściwości steroidów.

Oprócz działania blokującego chemotaksję komórek zapalnych, ekstrakt CT wydaje się tłumić aktywację makrofagów. Zostało to potwierdzone przez jego działanie hamujące na NO in vitro i in vivo, który jest głównym mediatorem stanu zapalnego wytwarzanym przez makrofagi. Zatem wpływ ekstraktu CT na makrofagi może wynikać z tłumienia ekspresji mRNA i/lub bezpośredniego hamowania aktywności iNOS w tych komórkach.

PGE2 jest również jednym z głównych mediatorów stanu zapalnego. Zwiększa się równolegle z obrzękiem tkanek, który jest tłumiony przez NLPZ, inhibitory COX. Karagen może zwiększać produkcję PGE2 poprzez indukcję mRNA COX-II i białka COX-II w wysięku worka. W tym modelu karagen znacząco zwiększał ilość PGE2 i była ona istotnie tłumiona przez ekstrakt CT. Warto zauważyć, że wynik ten był zgodny z efektem, jaki można uzyskać w przypadku indometacyny NLPZ. Z uzyskanych wyników wynika zatem, że ekstrakt CT posiada dodatkowe właściwości NLPZ. Podsumowując, uważa się, że ekstrakt CT wywierał działanie zarówno kortykosteroidowe, jak i podobne do NLPZ w modelu zapalenia wywołanego karagenem, a fukoidan wzmagał działanieprzeciwzapalne działanie ekstraktu CTpoprzez blokowanie nacieku komórek zapalnych.

Chociaż określenie dokładnego mechanizmu działania wymaga dalszych badań, mieszanina fukoidanu i ekstraktu CT wyraźnie łagodziła objawy stanu zapalnego poprzez blokowanie szlaków TNF-NO i COX-II-PGE2 w zapaleniu worka powietrznego wywołanego karagenem. Odkrycia te dostarczają dowodów, że skojarzone leczenie fukoidanem i ekstraktem CT może być obiecującym kandydatem do łagodzenia różnych typów stanów zapalnych, które reagują na kortykosteroidy lub NLPZ.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO ZAKAZANIA CHOROB ZAPALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%