Abstrakcyjny
Zbadać synergistyczne działanie hamująceCistanche Deserticolaglikozydy fenyloetanoidowe (PHG) i glabrydyna (GLA) na pigmentacji skóry, optymalny stosunek masy PHG do GLA został wstępnie przesiewanyin vitroTesty hamowania aktywności tyrozynazy, 1, 1- divhenyl -2- picrylhydrazyl (dpph) Rodnik i 2,2'-azino-bis ({3- etylobenzothiazoline -6- kwas sulfenowy) (Abts⁺) radykalne. Dalsze oceny przeprowadzono przy użyciu trzech modeli komórkowych:

Model melanogenezy indukowany UVB B16F10 w celu oceny hamowania syntezy melaniny poprzez aktywność tyrozynazy i zawartość melaniny;

Model zapalny HACAT indukowany lipopolisacharydem (LPS) w celu oceny działań przeciwzapalnych poprzez pomiar interleukiny -6 (IL {3}}) i czynnik martwicy nowotworów- (Tnf-) Supresja;

AAPH (2,2'-azobis (2- amidinopropan) indukowany dihydrochlorkiem model stresu oksydacyjnego HACAT w celu określenia aktywności przeciwutleniającej poprzez wzmocnienie nadtlenku (SOD) i katalazy (CAT).

Optymalny stosunek masy PHG/GLA został zidentyfikowany za pomocą tych modeli. Wyniki wykazały, że roztwory PHG/GLA (przygotowane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, PBS, pH 6,8) przy stosunkach masy 1: 1, 5: 1 i 10: 1 wykazywały znaczące hamowanie tyrozynazy i synergistyczne działanie przeciwutleniające. Wskaźniki hamowania tyrozynazy wyniosły odpowiednio 94,37%, 92,93%i 88,06%; Radykalne wskaźniki wymiatania DPPH osiągnęły 89,44%, 88,72%i 88,10%; Wskaźniki wymiatania ABTS⁺ wyniosły 100,13%, 100,01%i 99,87%. Przy 25 ug/ml w DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) nie wykazywał cytotoksyczności w kierunku komórek B16F10 lub HACAT. Wyświetlone rozwiązanie DMEM PHGS/GLA (1: 1)Najwyższe hamowanie tyrozynazy(23,80% aktywność resztkowa), znaczącoZmniejszona zawartość melaniny(30,90%) i przewyższyło inne wskaźniki i monoterapie w tłumieniu IL -6/TNF-uwalniania i zwiększaniu aktywności SOD/CAT. Synergistyczne połączenie PHG i GLA skutecznie złagodzone SKinpigmentacja przez hamowanie melanogenezy, Zmniejszenie stanu zapalnego iZwiększenie pojemności przeciwutleniającej.

Słowa kluczowe
CistancheDeserticola glikozydy fenyloetanoidalne; glabrydyna; efekt synergistyczny; anty-melanogeneza; przeciwutleniacz; przeciwzapalny; Surowce farmaceutyczne

 

 

 

CistancheDeserticola ekstrakt zWysoki poziomglikozydy fenyloetanoidowe do wybielania skóry

Whatsapp nas, aby uzyskać więcej informacji

 

Sekcja eksperymentalna

1.1 Materiały, odczynniki i instrumenty

Komórki czerniaka myszyB16f10 (nr katalogu: STCC20013G -1), Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.

Unieśmiertelnione ludzkie keratynocytyHacat (nr katalogu: ICELL-H066), Icell Bioscience Inc., Szanghaj, Chiny.

Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche (PHG)Iglabrydyna (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tyrozynaza, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)IL-tyrozyna, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny.

1, 1- divhenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Japonia.

2,2′-azino-bis (3- etylobenzotiazolina -6- kwas sulfonowy) sól diamonu (abts), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Kwas askorbinowy (VC), Tianjin Damao Chemical Reagent Factory.

Persulfate potasuIbezwodny etanol, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Wodorotlenek sodu, Chengdu Huayi Pharmaceutical Expitnt Manufacturing Co., Ltd.

Fosforan dipotasowy, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-DOPA, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Zestaw zliczania komórek -8 (CCK8), Beijing Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, dimetylosulfotlenk (DMSO), 2,2′-azobis (2- metylopropionamidyna) dihydrochlorek (aAph), Ilipopolisacharyd (LPS), Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

Medium o wysokiej glukozie DMEM, Thermo Fisher Scientific (Chiny).

Płodowa surowica bydła (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Roztwór penicyliny-streptomycyny, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Human IL -6 zestaw ELISA, Zestaw ludzki TNF-ELISA, IZestaw Elisa Human Cat, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Zestaw testu całkowitego dysmutazy nadtlenkowej (SOD), Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Wszystkie odczynniki miały ocenę analityczną.

Użyte instrumentów:

Czytnik mikropłytek pełnej fali Multiskan FCIInkubator CO2 HERACHELL 371, Thermo Fisher Scientific, USA.

KQ -200 VDB Ultrasonic Cleaner, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

DVKW-D -2 cyfrowa termostatyczna kąpiel wodna, Pekina Yongguangming Medical Instrument Factory.

DHG -9246 elektryczny termostatyczny piekarnik suszący, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

KN4006B Ultraviolet Promieniation Instrument UVB(Intensywność napromieniowania: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Instrument Squiping Co., Ltd.

1.2 Metody

Najpierw PHG i GLA rozpuszczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH =6. 8) lub 50% roztworu etanolu w celu przygotowania roztworów o stężeniach masy stężenia masy{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 {17}}}} 05, 0,025, 0,1, 0,4, 0,8, 1.2, 1.6 i 2,0 g/l/l/l/l/l/l. Następnie PHG i GLA mieszano w stosunkuM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 i 1:40, w celu przygotowania roztworów PHG/GLA o całkowitym stężeniu masy0.4 g/L, oznaczone jakoPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40)odpowiednio.

 

1.3 Eksperymenty biochemiczne

1.3.1 Test hamowania aktywności tyrozynazy

W płytce studni 96-,50 μl roztworu próbki testowej, 50 μl PBS (pH =6. 8), I50 μl roztworu L-tyrozyny (1 g/l)zostały kolejno dodane. Talerz inkubowano w 37 -stopniowej kąpieli wodnej przez 10 minut. Następnie,5 0 μl roztworu tyrozynazy (0,4 g/l, równoważne 200 u/ml)Dodano, a płytkę ponownie inkubowano w 37 stopni łaźni wodnej przez kolejne 10 minut.

Arbutin (ARB)zastosowano jako kontrolę pozytywną iPBS (ph =6. 8)był używany jako pusta kontrola.

Absorbancja roztworu na490 nmZmierzono za pomocą czytnika mikropłytek, a współczynnik hamowania tyrozynazy in vitro (%) obliczono za pomocą równania (1).

 

 

W formule:

Reakcja _jest absorbancją roztworu próbki zawierającego roztwór L-tyrozynowy, PBS i roztwór tyrozynazy.

A _ kontrola reakcjijest absorbancją roztworu próbki zawierającego roztwór L-tyrozyny i PBS bez roztworu tyrozynazy.

A _jest absorbancją roztworu zawierającego roztwór L-tyrozynowy, PBS i roztwór tyrozynazy bez próbki.

A _ kontrola pustejjest absorbancją roztworu zawierającego roztwór L-tyrozyny i PBS bez roztworu próbki i tyrozynazy.

1.3.2 Oznaczanie aktywności wymiatania wolnego rodnika DPPH

Po pierwsze, {0}}. 0197 g (0,05 mmol) DPPH dokładnie zważono i rozpuszczono w 250 ml bezwodnego etanolu, aby przygotować roztwór roboczy DPPH o stężeniu0. 2 mmol/l.

Następnie PHG i GLA rozpuszczono w 50% etanolu w celu przygotowania roztworów etanolu PHG i GLA o masowych stężeniach{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 i 2,0 g/l. Rozwiązania Etanolu VC zostały przygotowane w ten sam sposób.

Następnie roztwory etanolu PHG i GLA mieszano w stosunkuM (Solution PHGS): M (rozwiązanie GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Aby uzyskać 9 roztworów etanolu PHG/GLA o różnych współczynnikach masy, oznaczonych jakoPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Wreszcie,100 μl każdego roztworu próbkiI100 μl roztworu roboczego DPPHdodano do studzienki 96-, zmieszano równomiernie i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Absorbancja przy517 nmmierzono za pomocą czytnika mikropłytek. VC zastosowano jako kontrolę pozytywną i każdy eksperyment powtórzono trzykrotnie.

Wskaźnik wymiatania wolnego rodnika DPPH (%) obliczono za pomocą równania (2).

 

W formule:

A1jest absorbancją roztworu próbki + roztworu roboczego DPPH.

A2to absorbancja 50% etanolu + DPPH rozwiązania roboczego.

A3jest absorbancją rozwiązania próbki + 50% etanolu.

 

1.3.3 Oznaczanie aktywności oczyszczania wolnego rodników

Pierwszy,1 g (1,82 mmol) ABTrozpuszczono w wodzie dejonizowanej, aby przygotować roztwór roboczy ABTS z końcowym stężeniem7,4 mmol/l. 0. 5 g Persulfate potasurozpuszczono w wodzie dejonizowanej w celu przygotowania roztworu roboczego potasu z końcowym stężeniem2,6 mmol/l. Równe objętości roztworu roboczego ABTS i roztworu roboczego potasu zostały zmieszane i pozostawiono do reagowania w ciemności przez 12 godzin w celu przygotowania roztworu roboczego ABTS⁺.

Następnie roztwory etanolu PHG, GLA i VC, a także PHG/GLA Rozwiązania etanolu o stosunkuPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), przygotowano zgodnie z metodą opisaną w rozdziale 1.3.2.

Wreszcie,40 μl każdego roztworu próbkiI160 μl roztworu roboczego Abts⁺dodano do płytki studzienkowej 96-, zmieszano równomiernie i reagowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 6 minut. Absorbancja roztworu na734 nmmierzono za pomocą czytnika mikropłytek.

Wskaźnik wymiatania wolnego rodnika ABTS⁺ (%) obliczono za pomocą równania (3).

 

 

W formule:

A1jest absorbancją roztworu próbki + roztworu roboczego Abts⁺.

A2to absorbancja dejonizowanej wody + abts⁺ roztwór roboczy.

A3jest absorbancją roztworu próbki + wody dejonizowanej.

1.4 Eksperymenty komórkowe

1.4.1 Kultura komórkowa

Po ożywieniu komórek B16F10 i HACAT zostały one zaszczepione do pożywki o wysokiej glukozie DMEM (zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% roztworu penicylin-streptomycyny) i hodowano w37 stopni, 5% CO2, I70% wilgotnościw inkubatorze przez 24 godziny. Status wzrostu komórek zaobserwowano pod mikroskopem, a zmiany pożywki lub pasażowanie przeprowadzono w razie potrzeby w oparciu o stan wzrostu komórek.

1.4.2 Grupa eksperymentalna

Komórki B16F10 i HACAT logarytmicznej fazy logarytmicznej zostały zaszczepione do studzienki 96- przy odpowiedniej gęstości komórki i hodowano przez 24 godziny, aby umożliwić przestrzeganie komórek. Roztwory próbki o różnych stężeniach przygotowano przy użyciu pożywki DMEM.

Grupy eksperymentalne były następujące:

Normalna grupa

Grupa modelowa

Grupa niskiej dawki PHGS(125 ug/ml)

Grupa średniej dawki PHGS(250 ug/ml)

Grupa wysokiej dawki PHGS(500 ug/ml)

GLA GLA Niskie dawki(6,25 ug/ml)

GLA GLA Średniej dawki(12,5 ug/ml)

GLA GLA High Dose(25 ug/ml)

Grupa PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

Grupa PHGS/GLA (5: 1)

Grupa PHGS/GLA (10: 1)

DlaModel pigmentacji indukowany UVB w komórkach B16F10, modelowe komórki grupowe traktowano30 μl PBS (pH =7. 4)i napromieniowane pod instrumentem promieniowania ultrafioletowego UVB3 cm poniżej urządzeniaDo110 sekund. Grupy eksperymentalne były wstępnie traktowane100 μl różnych roztworów próbekprzez 1 godzinę przed dodaniem30 μl PBSi napromieniowanie pod urządzeniem UVB przez 110 sekund. Normalną grupę stale traktowano podłożem DMEM o wysokiej glukozie, a grupa pusta nie zawierała komórek, ale zastąpiono równą ilością pożywki.

DlaModel zapalny indukowany przez LPS w komórkach HACAT, grupa modelowa była traktowanaRoztwór PBS 20 ug/mlprzez 24 godziny. Grupy eksperymentalne były wstępnie traktowane100 μl różnych roztworów próbekprzez 24 godziny przed dodaniemRoztwór LPS 20 ug/mlprzez kolejne 24 godziny. Normalną grupę stale traktowano podłożem DMEM o wysokiej glukozie, a grupa pusta nie zawierała komórek, ale zastąpiono równą ilością pożywki.

DlaModel stresu oksydacyjnego indukowanego przez AAPH w komórkach HACAT, grupa modelowa była traktowana25 mmol/l Roztwór AAPHprzez 24 godziny. Grupy eksperymentalne były wstępnie traktowane100 μl różnych roztworów próbekprzez 24 godziny przed dodaniem25 mmol/l Roztwór AAPHprzez kolejne 24 godziny. Normalną grupę stale traktowano podłożem DMEM o wysokiej glukozie, a grupa pusta nie zawierała komórek, ale zastąpiono równą ilością pożywki.

Każda grupa została skonfigurowana3 powtórz studniei kulturalne przy37 stopni, 5% CO2, I70% wilgotnościw inkubatorze.

1.4.3 Test cytotoksyczności

Cytotoksyczność mierzono za pomocąMetoda CCK8. Faza logarytmiczna B16F10 i komórki HACAT strawiono za pomocą0. 25% trypsynyprzez 3 minuty. Po trawieniu za pomocą pożywki komórki wielokrotnie pipetowano w celu przygotowania zawiesiny komórkowej z gęstościąKomórki 1 × 10⁴/ml. Komórki były równomiernie zaszczepione do 96- studzienki w100 μl na studnię, i PBS dodano do studni peryferyjnych. Po przyleganiu komórek dodano różne stężenia roztworów próbki3 Odplikane studnie na grupę, a komórki hodowano na37 stopni, 5% CO2, I70% wilgotnościDo24, 48 i 72 godzinyprzed odrzuceniem medium.

Dla wszystkich grup,100 μl pożywki o wysokiej glukozie CCK8 DMEM (zawierająca 10% CCK8)dodano i inkubowano dla60 minut. Absorbancja roztworu na450 nmmierzono za pomocą czytnika mikropłytek.

Żywotność komórek (%) obliczono za pomocą równania (4).

 

W formule:

A _jest absorbancją komórek zawierających studni, roztworu CCK8 i roztworu próbki.

A _jest absorbancją odwiertu zawierającego pożywkę i roztworu CCK8, ale bez komórek.

A0jest absorbancją komórek zawierających studni i roztworu CCK8, ale bez roztworu próbki.

1.4.4 Test aktywności tyrozynazy

Metodę L-DOPA zastosowano do pomiaru aktywności tyrozynazy. Po leczeniu komórek48 godzinJak opisano w sekcji 1.4.2, supernatant odrzucono, a studnie przemyto dwukrotnie PBS (pH =7. 4). Następnie,50 μl 1% Triton X -100dodano do każdej studni i natychmiast umieszczono w zamrażarce –80 stopni dla30 minut. Komórki rozmrożono w temperaturze pokojowej w celu indukcji lizy.

Po wstępnym pielęgnięciu37 stopniDo5 minut, 10 μl 10 mmol/L roztworu Dopadodano do każdej studni i inkubowano w37 stopni, 5% CO2 i 70% wilgotnościDo1 godzina. Absorbancja przy475 nmmierzono za pomocą czytnika mikropłytek. Każdy eksperyment powtórzonotrzykrotnie, a aktywność tyrozynazy (%) obliczono za pomocą równania (5).

W formule:

Eksperyment _jest absorbancją komórek zawierających studni i roztworu próbki w ramach promieniowania UVB.

A _ normalnyjest absorbancją komórek zawierających studnię i roztworu próbki bez napromieniowania UVB.

A _jest absorbancją pożywki zawierającej studnię, ale bez komórek.

 

1.4.5 Pomiar zawartości melaniny

Do pomiaru zawartości melaniny zastosowano metodę lizy NaOH. Po leczeniu komórek72 godzinyJak opisano w sekcji 1.4.2, supernatant odrzucono, a studnie przemyto dwukrotnie PBS.100 μl wodnego roztworu NaOH zawierającego 10% DMSO (1 mol/l)dodano do każdej studzienki, a talerz umieszczono wPiekarnik 90 stopniDo1 godzina. Absorbancja przy490 nmmierzono za pomocą czytnika mikropłytek. Każdy eksperyment powtórzonotrzykrotnie, a zawartość melaniny (%) obliczono za pomocą równania (5).

 

1.5 Pomiar czynników zapalnych i wskaźników stresu oksydacyjnego

Po leczeniu komórek48 godzinjak opisano w sekcji 1.4.2,Komórki HacatZ każdej grupy zebrano za pomocą skrobaka komórkowego, odwirowano i zebrano supernatant. Stężenia IL -6 i tnf- mierzono zgodnie z instrukcjami zestawów ELISA.

Po leczeniu komórek48 godzin, Komórki Hacat zebrano za pomocą skrobaka komórkowego, poddawano powtarzającym się cykli zamrażania i rozmrażania w celu indukcji lizy komórek i wirowano na12, 000 RPM przez 10 minut w 4 stopnie. Supernatant został zebrany, a działaniaDARŃi stężeniaKOTmierzono za pomocą instrukcji zestawu ELISA.

 

1.6 Pomiar indeksu kombinacji

.Metoda indeksu kombinacji (CI)[20] zastosowano do oceny, czy połączenie PHG i GLA przy różnych stosunkach masy wykazywało synergistyczne działanie w hamowaniu aktywności tyrozynazy i przeciwutlenianiu. Wskaźnik kombinacji obliczono za pomocą równania (6).

 

W formule:

D1ID2reprezentują odpowiednie stężenia (g/l) dwóch leków w leczeniu skojarzonym potrzebnym do osiągnięciaAktywność x%.

Dxreprezentuje stężenie (g/l) każdej indywidualnej substancji, gdy jest używana samodzielnie do osiągnięciaAktywność x%.

.Oprogramowanie Compusynzostał użyty do obliczeń:

CI> 1Wskazuje na działanie antagonistyczne.

CI=1Wskazuje efekt addytywny.

CI <1Wskazuje efekt synergistyczny.

 

1.7 Analiza danych

Wszystkie dane zostały wyrażone jako„Średnia ± odchylenie standardowe (X̄ ± S)”, a dyskusje były oparte na średnich wartościach.

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciuGraphPad Prism 9.5. 0. Do porównań między wieloma grupami zastosowano jednokierunkową ANOVA (analiza wariancji). APreca p <0. 05został uznany za statystycznie istotny.