Synergistyczna odporność i ochrona u myszy poprzez współimmunizację szczepionkami DNA kodującymi białko szczytowe i inne białka strukturalne SARS-CoV-2

Abstrakcyjny:Pojawienie się nowych wariantów wirusa 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS CoV-2) spowodowało powtarzające się epidemie infekcji na całym świecie. Te wysoce zmutowane warianty zmniejszają skuteczność obecnych szczepionek przeciwko chorobie koronawirusowej 2019 (COVID-19), które zostały zaprojektowane tak, aby działać wyłącznie na białko kolca (S) pierwotnego wirusa. Z wyjątkiem S SARS-CoV-2, potencjał immunoprotekcyjny innych białek strukturalnych (nukleokapsyd, N; otoczka, E; błona, M) jako antygenów docelowych szczepionki jest nadal niejasny i warty zbadania. W tym badaniu opracowano syntetyczne szczepionki DNA kodujące cztery białka strukturalne SARS-CoV-2 (pS, pN, pE i pM), a myszy immunizowano trzema dawkami poprzez wstrzyknięcie domięśniowe i elektroporację. Warto zauważyć, że skojarzona immunizacja dwiema szczepionkami DNA wyrażającymi białka S i N indukowała wyższe przeciwciała neutralizujące i była skuteczniejsza w zmniejszaniu wiremii SARS-CoV-2 niż samo białko S u myszy. Ponadto, koimmunizacja pS pN lub pE + pM indukowała wyższą odporność komórkową specyficzną dla białka S po trzech immunizacjach i powodowała łagodniejsze zmiany histopatologiczne niż sam pS po prowokacji. Należy dokładniej zbadać rolę konserwatywnych białek strukturalnych SARS-CoV-2, w tym białek N/E/M, pod kątem ich zastosowania w projektowaniu szczepionek, takich jak szczepionki mRNA.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Słowa kluczowe: COVID-19; SARS-CoV-2}}; koimmunizacja; szczepionka DNA; białko kolca; białko strukturalne

1. Wstęp

Koronawirus 2 (SARS-CoV-2) jest przyczyną choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19), która jest przyczyną milionów infekcji i zgonów na całym świecie oraz zagraża zdrowiu ludzkiemu i światowej gospodarce . Chociaż skuteczne metody terapeutyczne są nadal niedostępne, ich postęp nastąpił szybko, włączając zastosowanie terapii komórkami CAR-T i nanotechnologii [1,2]. Szczepienia są skutecznym sposobem kontrolowania pandemii, a różne organy regulacyjne ds. zdrowia publicznego zatwierdziły do ​​stosowania kilka szczepionek [3,4]. Genom wirusa koronowego koduje cztery główne białka strukturalne, mianowicie białka kolca (S), nukleokapsydu (N), błony (M) i otoczki (E), które są odpowiedzialne za składanie wirionów i tłumienie odpowiedzi immunologicznej gospodarza [5 ] Białko S składa się z 1273 reszt aminokwasowych zawierających dwie podjednostki, mianowicie S1 i S2. Pośredniczy w przedostawaniu się wirusa i jest głównym celem opracowywania szczepionek przeciwko koronawirusowi [6–11]. Jednakże białko S SARS-CoV-2 charakteryzuje się dużą częstotliwością mutacji. Nic dziwnego, że w przypadku SARS-CoV-2, wirusa RNA, mutacja jest ciągła i nieunikniona. Od września 2020 r. pojawiło się pięć budzących obawy wariantów SARS-CoV-2 (VOC), w tym B.1.1.7 (Wielka Brytania, alfa), B.1.351 (RPA, Beta), P.1 (Brazylia, Gamma), B.1.617.2 (Indie, Delta) i B.1.1.529 (RPA, Omicron) (Andreano i Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Wszystkie mają kilka mutacji w białku kolca [12]. Warianty te zagrażają skuteczności obecnych szczepionek-19 przeciwko COVID, których celem jest wyłącznie białko kolczaste.

Białko N wirusa SARS-CoV-2 wiąże się z wirusowym RNA poprzez 140-domenę wiążącą RNA o długości 140-aminokwasowej w ich rdzeniu w sposób „koralik na sznurku”. Jest wysoce konserwatywne wśród koronawirusów, wykazując ~90% identyczności sekwencji z sekwencją SARS-CoV, a także jest jedynym białkiem strukturalnym wewnątrz wirionu [13]. Ponadto odgrywa ważną rolę w pakowaniu wirusowego RNA do kompleksu kapsydu rybonukleotydowego i jest niezbędny do replikacji wirusowego RNA, składania wirionów i uwalniania z komórek gospodarza [14]. W oparciu o duże podobieństwo sekwencji białka N w koronaawirusach można je zasugerować jako cel szczepionki o ochronie krzyżowej. Ustaliliśmy wcześniej, że skojarzona immunizacja dwiema szczepionkami DNA wyrażającymi białka E i M zapewnia częściową ochronę przed SARS-CoV-2 i tę metodę należy rozważyć podczas opracowywania szczepionki [15]. W zależności od dokumentu przeglądowego WHO zazwyczaj istnieje siedem strategii dotyczących kandydatów na szczepionki przeciwko SARS-CoV-2, które można dalej podzielić na trzy kategorie: pierwsza to szczepionki białkowe, w tym szczepionki z inaktywowanymi wirusami, szczepionki wirusopodobne szczepionki cząsteczkowe i podjednostkowe białka; po drugie, szczepionki genowe, w tym szczepionki zawierające wektory wirusowe, szczepionki DNA i szczepionki mRNA; po trzecie, połączenie podejścia opartego na białkach i genach, takiego jak szczepionki zawierające żywe atenuowane wirusy. Technologie DNA, jako nowatorskie strategie szczepionek opartych na genach, umożliwiają szybkie porównywanie wielu kandydatów na szczepionki i strategii podczas badań przedklinicznych [16,17]. Teoretycznie prawie wszystkie białka wirusowe są potencjalnymi immunogenami i celami szczepionek. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, immunogenność i potencjał ochronny syntetycznych szczepionek DNA w zakresie kodowania białek S i innych białek strukturalnych SARS-CoV-2 nie zostały jeszcze systematycznie opisane. Cztery szczepionki DNA wyrażające białka S, N, E i M1 SARS-CoV-2 oceniano pod kątem ich immunogenności i skuteczności ochronnej u myszy w celu zbadania immunologicznego działania S w połączeniu z innymi białkami strukturalnymi.

2. Materiały i metody

2.1. Komórki

Komórki Huh7.5 i ludzkie embrionalne komórki nerki 293T hodowano przez całe badanie w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2. Komórki hodowano w pożywce DMEM (HyClone, Logan, UT, USA), uzupełnionej 10% FBS (GEMINI Co., Szanghaj, Chiny) i 1% penicyliną-streptomycyną (Gibco, Nowy Jork, NY, USA). Potwierdzono, że wszystkie linie komórkowe nie wykazały skażenia mykoplazmą.

2.2. Konstrukcja szczepionek DNA kodujących SARS-CoV-2 S/N/E/M

Gen kodujący białko S/N SARS-CoV-2, zawierający N-końcową sekwencję Kozaka (GCCACC), po której następuje kodon inicjacyjny (ATG), zsyntetyzowano przy użyciu kodonu zoptymalizowanego pod kątem ssaków (GenScript Co., Nanjing , Chiny). Następnie sklonowano go do wektora ekspresyjnego pcDNA3.1 (+) poprzez trawienie EcoRI i XbaI i nazwano go pS/pN (szczepionki DNA) (Figura 1A). Skonstruowano i zidentyfikowano białko pE/PM w sposób opisany wcześniej [15]. Szczepionki przygotowano przy użyciu zestawów Maxiprep wolnych od endotoksyn (Qiagen, Pekin, Chiny), a sekwencje potwierdzono za pomocą sekwencjonowania DNA Sangera. Ekspresję białka S/N potwierdzono metodą Western blot i przeciwciałami anty-S (Sino Biological, Pekin, Chiny)/anty-N rozcieńczonymi w stosunku 1:1000. Eksperymenty te przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [15,18].

Rycina 1. Projektowanie i ekspresja konstruktów szczepionki białkowej SARS-CoV-2 S/N na bazie rekombinowanego DNA. (A) Schematyczny diagram szczepionek opartych na rekombinowanym DNA, kodujących białka wypustu (PS), nukleokapsydu (pN), otoczki (pE) i/lub błony (PM) SARS-CoV-2. (B) Ekspresję docelowego białka w szczepionkach DNA potwierdzono za pomocą analizy Western blot komórek 293T transfekowanych plazmidami pS/pN/pE/pM.

2.3. Szczepienia i wyzwania

Samice myszy BALB/c (Charles River Laboratories, Francja) w wieku 6 tygodni trzymano w Narodowym Instytucie Higieny Pracy i Kontroli Zatruć w środowisku o temperaturze 21°C i kontrolowanej wilgotności z 12-godzinnymi cyklami światło/ciemność. W międzyczasie zapewniono żywność i wodę ad libitum, a wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Chińskiego Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (China CDC). Badania były zgodne z obowiązującymi przepisami etycznymi.

Myszy podzielono losowo na pięć grup i immunizowano samym pS/pN lub wspólnie immunizowano pS + pN lub pS + pE + PM w dniach 0, 21 i 42 poprzez wstrzyknięcie domięśniowe plus elektroporację (35 mg/50 ml) (ryc. 2) [19,20]. W skrócie, szczepionki DNA wstrzyknięto do mięśnia piszczelowego przedniego (TA) i natychmiast poddano działaniu prądu elektrycznego za pomocą dwuigłowej elektrody rozmieszczonej w odstępie 5 mm (ECM830; BTX) z igłami. Pobrano surowicę od myszy do analizy humoralnej odpowiedzi immunologicznej, a śledziony myszy poddano obróbce w celu pomiaru komórkowej odpowiedzi immunologicznej (Figura 2).

Rysunek 2. Schemat szczepienia i prowokacji SARS-CoV-2. Przebieg czasowy szczepienia, prowokacji i pobierania próbek krwi/tkanek. Myszy BALB/C podzielono losowo na grupy.

Eksperymenty z prowokacją SARS-CoV-2 przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [15,21]. W skrócie, myszy znieczulono, a następnie poddano donosowej transdukcji 2,5 x 108 PFU Ad5-hACE2 w całkowitej objętości 45 µl. Pięć dni po transdukcji myszy znieczulono, a następnie poddano donosowej prowokacji 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) w całkowitej objętości 50 µl soli fizjologicznej bufor. Całość prac z żywym SARS-CoV-2 w modelach mysich przeprowadzono w laboratoriach Animal Biosafety Level 3 (ABSL-3).

2.4. Test immunoenzymatyczny

Testy immunoenzymatyczne (ELISA) przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [15]. W skrócie, białka S (zakupione od Sino Biological)/N (prezent od Song) rozcieńczone w buforze węglanowym (0,1 M, pH 9,6) opłaszczono 96-studzienkowe płytki EIA/RIA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) przez noc w temperaturze 4°C. Płytki blokowano 200 µl 10% surowicy koziej w PBS w temperaturze 37°C przez 2 godziny, a następnie pięciokrotnie przemywano PBST. Następnie dodano próbki surowicy rozcieńczone seryjnie w 2% surowicy koziej w PBS i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, a następnie pięciokrotnie przemywano PBST. Dodano kozie przeciwciało przeciwko mysiej IgG skoniugowane z HRP (1:5000) w temperaturze 37°C na 1 godzinę. Do każdej studzienki dodano w sumie 100 µl substratu TMB i reakcję zatrzymano 50 µl 2M H2SO4. Absorbancję odczytano przy długości fali 450 nm przy użyciu SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hongkong, Chiny).

Cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Eksperymenty z infekcją i neutralizacją pseudowirusów

Test neutralizacji pseudowirusa przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [21,22]. Wcześniej skonstruowano plazmid wyrażający białko S wirusa przodków [22]. Zsyntetyzowano wariant genu białka kolczastego SARS-CoV-2 Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (dar od Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Chiny) przy użyciu kodonu zoptymalizowanego pod kątem ssaków i sklonowanego do wektora pcDNA3.1, jak opisano wcześniej [22]. W skrócie, plazmidy wyrażające reporter lucyferazy i plazmidy wyrażające białko S kotransfekowano do komórek HEK 293T przy użyciu odczynnika do transfekcji DNA X-treme GENE HP. Hodowlę komórkową odświeżono 6 godzin po transfekcji, a supernatant zawierający pseudowirusa zebrano po 48 godzinach i przechowywano w temperaturze -70°C. W teście neutralizacji pseudowirusa równą mieszaninę surowica-wirus inkubowano następnie w 37 objętościach supernatantu zawierającego pseudowirusa, a następnie dodano do rozcieńczonej surowicy. ◦C przez 1 godz. Następnie pożywkę do hodowli komórek Huh7.5 zastąpiono 100 µl mieszaniny surowica-wirus i inkubowano w temperaturze 37°C przez 12 godzin. Równolegle badano komórki hodowane wyłącznie z pseudowirusami SARS-CoV-2. Następnie pożywkę zastąpiono DMEM (2% FBS), a inkubację inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Następnie zmierzono sygnał lucyferazy przy użyciu zestawu lucyferazy świetlika Bright-Glo (Promega).

2.6. Test neutralizacji SARS-CoV-2

W tym eksperymencie wykorzystano SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). W skrócie, surowice rozcieńczono dwukrotnie z początkowego rozcieńczenia 1:10, zmieszano z równą objętością (10–15 pfu/studzienkę) żywego SARS-CoV-2 i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, po czym dodano je do zaszczepionych komórek Vero. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 48 godzin zaobserwowano efekt cytopatyczny (CPE) i zebrano 100 µl supernatantu hodowli w celu ekstrakcji kwasu nukleinowego i fluorescencyjnej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Medianę dawki neutralizującej (ND50) obliczono metodą Reeda–Muncha [15].

2.7. Test IFN-ELISpot

Pule peptydów obejmujące całe białko S/N/E/M jako kolejne 15-mery nakładające się na 10 aminokwasów zsyntetyzowano przez Scilight Biotechnology, LLC. W fiolce znajdowało się około 2,5 mg każdego oczyszczonego peptydu z puli peptydów. Eksperyment przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [18]. W skrócie, płytki z 96-studzienkami (zestaw BD ELISPOT, USA) opłaszczono Ab anty-wychwytującym IFN i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Płytki blokowano pełną pożywką hodowlaną po trzykrotnym przemyciu. Splenocyty zebrano po uśmierceniu myszy w dniach 35 i 120. Świeże zawiesiny pojedynczych komórek z każdej grupy wysiano w ilości 5 x 106 na studzienkę i dodano peptydy. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 przez 22 godziny i wykrywano przy użyciu czytnika płytek ELISpot (Biosys, So. Pasadena, Kalifornia, USA). Jednostka tworząca plamkę (SFU) reprezentuje IFN- wydzielający komórki T.

2.8. Ocena ochrony u myszy po prowokacji SARS-CoV-2

Eksperymenty przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [15,21]. W skrócie, płuca pobrano po uśmierceniu myszy. Połowę tkanek wykorzystano do ekstrakcji kwasów nukleinowych, fluorescencyjnej reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym i TCID50. Drugą połowę wysłano do College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, w celu oceny patologicznej.

2.9. Analiza statystyczna

Testy t dla niesparowanych, dwukierunkowe testy ANOVA i test wielokrotnych porównań Dunnetta przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). wartości p < 0.05 uznano za istotne statystycznie (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Wyniki

3.1. Charakterystyka szczepionek DNA

Poziomy białek E i M wykrywano metodą Western blot. Zmierzyliśmy ekspresję kodowanych białek S/N/E/M wirusa SARS-CoV-2 w komórkach T HEK-293transfekowanych plazmidami pS/pN/pE/pM za pomocą analizy Western blot, stosując anty -S/przeciwciała anty-N i przeciwciało anty-6 x His w lizatach komórkowych. Prążki odpowiadały przewidywanej masie cząsteczkowej białek S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) i M (22–25 kDa) (ryc. 1B).

3.2. Silna i trwała produkcja IgG anty-S i/lub anty-N indukowana przez DNA pS i/lub pN

Od myszy BALB/c pobrano surowicę szczepionek w 35, 56, 96 i 120 dniu (Figura 2). Poziomy anty-S/anty-N IgG wykrywano za pomocą testu ELISA. Wielkość odpowiedzi IgG specyficznej dla S lub N indukowanej przez pS lub pN wzrosła w surowicy po pierwszej i drugiej dawce przypominającej. Miana anty-S i anty-N IgG były wyższe w grupie pS + pN niż w pozostałych grupach; jednakże różnica nie była istotna statystycznie (ryc. 3A, B). Nie wykryto silnych odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla białka E/M, co jest zgodne z wynikami poprzedniego badania (danych nie pokazano) [15].

Rysunek 3. Odpowiedzi komórek B na SARS-CoV-2 u myszy BALB/c. (A) Miana punktów końcowych wiązania IgG w surowicy dla białek SARS-CoV-2 S (A) i N (B). (C) Miana neutralizacji określono w oparciu o system pseudotypowanego wirusa SARS-CoV-2. (D) Miana neutralizacji anty-SARS-CoV-2 określono przy użyciu wirusa SARS-CoV-2. (E) Test neutralizacji oparty na systemie pseudotypowanego wirusa SARS-CoV-2 Omicron. Pokazano współczynniki hamowania dla surowic z grup próbnych (niebieski), pS (czerwony), pS + pN (zielony), pS + pE + pM (różowy) i pN (pomarańczowy). Słupki błędów reprezentują SEM, a wartości p obliczono przy użyciu dwuczynnikowej analizy ANOVA i analizy post hoc Sidaka, gdzie * p < 0,05

3.3. Wysoki poziom przeciwciał neutralizujących wywołany skojarzoną immunizacją szczepionkami pS i pN

Miana neutralizujące seryjnie rozcieńczonych próbek surowicy określono przy użyciu pseudotypowanego wirusa SARS-CoV-2. Najwyższy poziom przeciwciał neutralizujących (nAbs) zaobserwowano w grupie pS + pN, przy odwrotności średnich geometrycznych mian EC50 sięgających 2988 (w dniu 35) i 3578 (w dniu 56) (ryc. 3C). Podobne wyniki zaobserwowano przy użyciu testu mikroneutralizacji żywego wirusa (MN), w którym poziomy nAb w grupie pS + pN były wyższe niż w grupie S w dniach 56 i 96 (p < 0,05; ryc. 3D). Co więcej, poziomy nAb w grupie pS + pN w 56. dniu (druga dawka przypominająca) były znacząco wyższe niż te w 35. dniu (p < 0,05; Ryc. 3D).

Aktywność neutralizującą każdego schematu szczepionek przeciwko wariantowi SARS-CoV-2 Omicron określono dalej, korzystając z pseudotypowanej platformy i próbek surowicy. Profil neutralizacji wirusa Omicron w dniach 35 i 56 był podobny do profilu neutralizacji wirusa przodków (Figura 3E), co sugeruje, że traktowanie PS + pN miało siłę neutralizacji krzyżowej.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

3.4. Odpowiedzi komórek T wywołane szczepieniem DNA

Jak opisano wcześniej, odpowiedzi komórek T na antygeny SARS-CoV-2 S/N/E/M oszacowano za pomocą IFN-ELISpot, jak opisano wcześniej [15]. Zgodnie z oczekiwaniami, zarówno schematy PS + pN, jak i pS + pE + pM indukowały znacząco wyższe poziomy IFN + limfocytów T swoistych dla białka S w dniu 120 niż w dniu 35 (p < 0. 05; rysunek 4A). Co więcej, liczba komórek T IFN + specyficznych dla białka N w 120. dniu (druga dawka przypominająca) była znacząco wyższa niż w 35. dniu w grupie pS + pN (p < 0,05; Figura 4B). Wreszcie, liczba komórek T IFN+ specyficznych dla białka M w 120. dniu (druga dawka przypominająca) była znacząco wyższa niż w 35. dniu w obu grupach (p < 0,05; Figura 4D).

Rycina 4. Odpowiedzi komórek T na poszczególne białka strukturalne SARS-CoV-2 u myszy BALB/c. (A) Odpowiedzi komórek T mierzono za pomocą IFN-ELISpot w splenocytach stymulowanych przez 20 h nakładającymi się pulami peptydów obejmującymi SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, i (D) białka M. Słupki przedstawiają średnią ± SD. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu dwuczynnikowej analizy ANOVA i testu post hoc Sidaka, gdzie * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 i **** p < 0,0001.

3.5. Ochrona synergistyczna indukowana przez skojarzoną immunizację pS/pN lub pS/pE/pM

Następnie oceniliśmy skuteczność ochronną szczepionek DNA przy użyciu myszy hACE2 immunizowanych po prowokacji przodkowym wirusem SARS-CoV-2. Po prowokacji myszy w grupie próbnej wykazywały stopniową utratę wagi. W przeciwieństwie do tego, myszy immunizowane pS lub pS+ wykazywały łagodną utratę masy ciała bezpośrednio po zakażeniu, po której nastąpił powrót do zdrowia (Figura 5A). Nie wykryto żywego wirusa u myszy zaszczepionych pS, pS + pN lub pS + pE + pM. Co więcej, szczepienie pS + pN znacząco zmniejszyło liczbę kopii wirusowego RNA w porównaniu z liczbami uzyskanymi po samym szczepieniu pS (p=0.0228; Figura 5B). Co więcej, histopatologia płuc wykazała, że ​​myszy zarówno w grupie próbnej, jak i pN wykazywały ogniskowe zmiany zapalne, wgłobienie opłucnej, zapadnięcie pęcherzyków płucnych, wysoki poziom nacieku komórek zapalnych i obszary krwotoczne. Dla porównania, myszy leczone pS + pN lub pS + pE + pM wykazywały łagodniejsze zmiany histopatologiczne i niższe wyniki INHAND po prowokacji niż druga grupa (Figura 5C).

Rycina 5. Skuteczność ochronna szczepienia po prowokacji żywym wirusem SARS-CoV-2. (A) Myszy ważono codziennie (średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), n=4) przez trzy dni po prowokacji. (B) Miano zakaźnego SARS-CoV-2 w homogenatach płuc trzeciego dnia po prowokacji, jak określono za pomocą testu TCID5{{10}} i liczby kopii RNA. Statystycznie istotne różnice między grupami określono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie korekty wielokrotnych porównań Dunnetta (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 i **** p < 0,0001). (C) Analiza histopatologiczna płuc przy użyciu barwienia H&E.

4. Dyskusja

W tym badaniu skojarzona immunizacja dwiema szczepionkami DNA wyrażającymi białka S i N indukowała wysoki poziom nAb i była wysoce skuteczna w zmniejszaniu wiremii SARS-CoV-2 u myszy. Szczepionki DNA wyrażające białko S indukowały podwyższony poziom odporności komórkowej specyficznej dla białka S po trzech immunizacjach, gdy myszy były jednocześnie immunizowane białkami N/E i M i łagodziły zmiany histopatologiczne po prowokacji. Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwszy raport ujawniający synergistyczne wzmocnienie odporności i ochrony u myszy po zastosowaniu szczepionki DNA kodującej białko S, gdy są one jednocześnie immunizowane szczepionkami DNA kodującymi inne białka strukturalne SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

W kilku badaniach zaobserwowano immunodominujące epitopy komórek B w regionach antygenu N. Szczepionki oparte na N zwykle nie mogą indukować nAbs, prawdopodobnie dlatego, że białko N nie jest prezentowane na powierzchni wirusa. Warto zauważyć, że jednoczesna immunizacja białkami S i N indukowała wyższy poziom nAb przeciwko wirusowi przodków i wirusowi Omicron SARS-CoV-2 w porównaniu z innymi grupami. Zwiększone odpowiedzi nAb są powiązane z lepszym usuwaniem wirusa i skutecznością ochronną. Nasze wyniki wykazały, że leczenie pS + pN było skuteczniejsze niż samo leczenie pS w zmniejszaniu miana wirusa SARS-CoV-2 po prowokacji. Z poprzedniego badania wynika, że ​​chomiki zaszczepione szczepionką zawierającą białka M i N były chronione przed poważną utratą masy ciała i patologią płuc, a także miały znacznie zmniejszone miano wirusa w jamie ustnej i gardle i płucach po prowokacji SARS-CoV-2, co jest zgodne z naszymi wynikami [23]. Niestety, zmniejszenia miana wirusa nie można konkretnie przypisać białku M ani N, a w tym badaniu nie oceniano poziomów nAb. Jedno z badań szczepionki mRNA SARS-CoV-2 wykazało, że koimmunizacja S + N indukowała zwiększoną odpowiedź limfocytów T CD8+ specyficzną dla S i aktywność przeciwciał neutralizujących, zapewniając lepszą ochronę płuc przed wirusem Delta wariant w porównaniu z samym S, co jest zgodne z wynikami tego badania [24]. W innym badaniu wykazano, że białko N zakaźnego wirusa zapalenia żołądka i jelit sprzyja syntezie przeciwciał neutralizujących, gdy świńskie komórki TGEV-IMMUNE stymulowano in vitro kombinacją białek S i N, a efekt ten można wyjaśnić odpowiedzią pomocniczych limfocytów T na białko N [25].

Immunodominujące epitopy CD4+/CD8+ komórek T w regionach antygenu N zidentyfikowano już wcześniej. W kilku badaniach wykazano, że szczepionki oparte na białku N SARS-CoV-2 skutecznie indukują komórkową odpowiedź immunologiczną. Grupa S + N wykazała podwyższony poziom odporności komórkowej specyficznej dla białka S po trzech immunizacjach. Jedno badanie szczepionki mRNA SARS-CoV-2 wykazało, że kombinatoryczna S + N indukowała zwiększoną odpowiedź limfocytów T CD8+ specyficzną dla S w porównaniu z samym S, co jest zgodne z naszymi wynikami [24]. W innym badaniu stwierdzono, że odpowiedzi komórek T na antygeny S i N po samym szczepieniu pierwotnym zawierającym podwójny antygen hAd5 S + N były równoważne odpowiedziom u pacjentów wcześniej zakażonych SARS-CoV-2-, a modele przewidywania komórek T in silico wiązanie epitopu z HLA sugeruje, że odpowiedzi komórek T na szczepionkę hAd5 S + N zachowają swoją skuteczność przeciwko wariantowi B.1.351. Co więcej, osocze od pacjentów zakażonych wcześniej SARS-CoV-2-wykazywało wyższe powinowactwo wiązania z komórkami wyrażającymi podwójny antygen S-Fusion + konstrukt N-ETSD niż z samym hAd5 S-Fusion, co dodatkowo sugeruje, że immunogenność Szczepionka zawierająca podwójny antygen S + N jest lepsza niż szczepionka zawierająca pojedynczy antygen S [26].

Nie wykryto żywego wirusa w płucach, a utrata masy ciała po prowokacji została złagodzona w grupach pS, pS + pN i pS + pE + pM, podczas gdy leczenie pN nie zmniejszyło skutecznie miana wirusa. Odkrycia te podkreślają niezbędność i skuteczność białka S jako celu szczepionki. Warto zauważyć, że współimmunizacja pS i pN miała lepszy wpływ na klirens wirusa niż pS lub pN. W grupie pS + pE + pM wykazano mniej zmian histopatologicznych w płucach, co jest zgodne z wynikami naszego poprzedniego badania [15]. Grupa S + N miała niską liczbę kopii wirusowego RNA w płucach, zmniejszoną utratę masy ciała i szybki czas powrotu do zdrowia po prowokacji SARS-CoV-2 w porównaniu z grupą immunizowaną samym S/N, co było zgodne z wynikami wyniki tego badania. Jednakże żadna z grup nie wykryła miana przeciwciał neutralizujących, co można wytłumaczyć różnicami w odmianie szczepionki i zwierzętach doświadczalnych [26]. W jednym badaniu szczepionki wektora adenowirusa SARS-CoV-2 stwierdzono, że szczepionka S zapewniała ostrą ochronę mózgu jedynie w przypadku jednoczesnej immunizacji ze szczepionką N [27]. W innym badaniu opracowano szczepionki Tri: ChAd, Bi: ChAd i Mono: ChAd wyrażające odpowiednio białka S1/N/RdRp, N/RdRp i S1 i przetestowano je na modelu zwierzęcym B.1.351. W płucach Mono: ChAdlungs zaobserwowano rozległą patologię, podczas gdy płuca Bi: ChAd i Tri: ChAd okazały się prawie wolne od tej patologii [28].

Co więcej, nieszczepione zwierzęta miały wysokie miano wirusa w płucach, podczas gdy leczenie Tri:ChAd znacząco zmniejszyło miano wirusa o 3,5 log. Dla porównania, zarówno szczepionki Bi: ChAd, jak i Mono: ChAd jedynie umiarkowanie zmniejszały miano wirusa. Wyniki te sugerują, że działanie ochronne szczepionki zawierającej podwójny antygen S/N przeciwko wariantom może być lepsze niż działanie szczepionki zawierającej pojedynczy antygen S, co jest zgodne z naszymi wynikami [28]. W kilku badaniach stwierdzono, że u myszy immunizowanych białkiem N po zakażeniu SARS-CoV rozwija się ciężkie zapalenie płuc [29–31]. Wcześniejsze badania donosiły również, że immunizacja szczepionką wektorową adenowirusową eksprymującą białko N wirusa zapalenia wątroby u myszy chroni myszy przed śmiertelną infekcją, co pokazuje, że białko N może generować efekt ochronny [32]. Co więcej, grupa immunizowana szczepionką DNA CRT/N miała znacznie obniżone miano wirusa po prowokacji, przy czym wirus krowianki eksprymował białko N SARS-CoV [33].

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Jedno badanie dotyczące białka S wykazało, że skojarzona szczepionka DNA/białko indukowała zarówno odporność humoralną, jak i komórkową lepiej niż sama szczepionka DNA/białko [8]. Szczepionki ukierunkowane wyłącznie na białko S wykazały zmniejszoną skuteczność w ochronie przed łagodną do umiarkowanej chorobą COVID-19 wywoływaną przez nowe warianty. Rola konserwatywnych białek strukturalnych SARS-CoV-2, w tym białek N/E/M, zasługuje na uwagę przy projektowaniu i stosowaniu szczepionek, ponieważ mutacje nie mają na ogół wpływu na indukowane szczepionką odpowiedzi komórek T przeciwko konserwatywnym epitopom . Jedno z badań wykazało, że 17 lat po wybuchu epidemii w 2003 r. pacjenci, którzy wyzdrowiali z SARS (n=23) nadal posiadali komórki T pamięci długotrwałej, reagujące na białko N SARS-CoV, które wykazywały silną reaktywność krzyżową z SARS CoV{ {15}} Białko N, co dodatkowo potwierdza zastosowanie białka N jako krzyżowo ochronnego celu szczepionki [34]. Badanie to wykazało, że koimmunizacja pS/pN była związana z wyższą odpowiedzią nAb, lepszym usuwaniem wirusa i lepszą komórkową odpowiedzią immunologiczną i może zapewniać lepszą ochronę po prowokacji SARS-CoV-2 w porównaniu z samym pS. Ponadto wykazano, że warianty SARS-CoV-2 zakażają wiele gatunków zwierząt, a u niektórych dzikich zwierząt i zwierząt domowych zaobserwowano przenoszenie wirusa z człowieka na zwierzę [7]. Dlatego weterynaryjna szczepionka SARS-CoV-2 wymaga większej uwagi. Ponadto nanotechnologia może być potężnym narzędziem w optymalizacji szczepionek i zasługuje na większą uwagę [2].

Badanie to ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, zaobserwowaliśmy strategię szczepionek DNA jedynie u myszy BALB/c, a przyszłe badania powinny ocenić immunogenne skutki tych schematów szczepień w innych modelach zwierzęcych. Po drugie, potrzebne są dodatkowe badania, aby w pełni zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw wzmocnionych odpowiedzi limfocytów T CD8 specyficznych dla nAb i S, indukowanych przez współimmunizację przy użyciu białek S i N, oraz wykorzystać tę wiedzę do optymalizacji leczenia COVID-19 projekt szczepionki. Wreszcie funkcja przeciwciał specyficznych dla białka N zasługuje na dalsze badania.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Podsumowując, w tym badaniu oceniano potencjał immunoochronny jednoczesnej immunizacji białkami S, N, E i M SARS-CoV-2. Kilka szczepionek ukierunkowanych wyłącznie na białko S ma zmniejszony efekt ochronny w stosunku do pojawiających się odmian szczepów. Nasze wyniki położą podwaliny pod opracowanie reaktywnej krzyżowo szczepionki przeciwko COVID-19, która będzie kontrolować obecne i pojawiające się warianty SARS-CoV-2 oraz zapobiegać potencjalnym pandemiom koronawirusa.

Bibliografia

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petuchow, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Zastosowanie terapii komórkami CAR-T poza onkologią: choroby autoimmunologiczne i infekcje wirusowe. Biomedycyna 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; i in. Nanotechnologia przeciwko nowemu koronawirusowi (koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2): diagnostyka, leczenie, terapia i perspektywy na przyszłość. Nanomedycyna 2021, 16, 497–516. [Odniesienie]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, Odporność stadna S. COVID-19: gdzie jesteśmy? Nat. Ks. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smalll, F.; Millera, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Immunologiczne rozważania na temat strategii szczepionek-19 przeciwko COVID. Nat. Ks. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Analiza strukturalna genomu SARS-CoV-2 i przewidywania dotyczące interakcji człowieka. Kwasy nukleinowe Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jacksona, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mechanizmy wnikania SARS-CoV-2 do komórek. Nat. Wielebny Mol. Biol Komórkowy. 2022, 23, 3–20. [Odniesienie]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lion, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; i in. Kandydat na szczepionkę z liniowym DNA, kodujący domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2, wywołuje silną odpowiedź immunologiczną i przeciwciała neutralizujące u kotów domowych. Mol. Tam. Metody Klin. Rozw. 2023. [Odn. krzyżowy]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Szczerbakow, DN; Rudometow, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, Nevada; i in. Immunogenność skojarzonej szczepionki DNA/białko przeciwko COVID-19. Byk. Do potęgi. Biol. Med. 2023, 1–4. [Odniesienie]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; i in. Okrągłe szczepionki RNA przeciwko SARS-CoV-2 i nowym wariantom. Komórka 2022, 185, 1728–1744.e16. [Odniesienie]

10. Corbett, KS; Edwards, Dania; Leist, Republika Południowej Afryki; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, Connecticut; DiPiazza, Atlanta; i in. Projekt szczepionki mRNA przeciwko SARS-CoV-2 umożliwił przygotowanie prototypu patogenu. Natura 2020, 586, 567–571. [Odniesienie]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; i in. Kandydat na szczepionkę glikoproteinową SARS-CoV-2 NVX-CoV2373 immunogenność u pawianów i ochrona u myszy. Nat. komuna. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; i in. Odporność hybrydowa poprawia limfocyty B i przeciwciała przeciwko wariantom SARS-CoV-2. Natura 2021, 600, 530–535. [Odniesienie]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, dyrektor generalny; Hassan, MI Wgląd w genom, strukturę, ewolucję, patogenezę i terapie SARS-CoV-2: podejście do genomiki strukturalnej. Biochim. Biofizyka. Akta Mol. Podstawa. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Indyjska nowa szczepionka DNA przeciwko-19 DNA dla młodzieży i dorosłych to nowość. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Ręka.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; i in. Szczepionki DNA wykazujące ekspresję białek otoczki i błony zapewniają częściową ochronę przed SARS-CoV-2 u myszy. Przód. Immunol. 2022, 13, 827605. [Odn. krzyżowe]

16. Tebas, P.; Kraynyak, Kalifornia; Patel, A.; Maslow, JN; Jutro, poseł; Sylwester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; i in. Śródskórna szczepionka SynCon®Ebola GP DNA jest stabilna temperaturowo i bezpiecznie wykazuje korzyści w zakresie immunogenności komórkowej i humoralnej u zdrowych ochotników. J. Zarażać. Dis. 2019, 220, 400–410. [Odniesienie]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walkera, Senat; Schultheis, K.; Purwar, M.; i in. Immunogenność kandydata na szczepionkę DNA przeciwko COVID-19. Nat. komuna. 2020, 11, 2601. [Odn.Krzyż]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Piosenka, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; i in. Jednoczesna immunizacja szczepionkami CHIKV VLP i DNA wywołuje obiecującą odpowiedź humoralną u myszy. Przedni immunol. 2021, 12, 655743. [Odn.Krzyż]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Szczepienie dwiema szczepionkami DNA wyrażającymi białko NS3 wirusa zapalenia wątroby typu C ukierunkowane na komórki dendrytyczne wywołuje wyższy heterologiczny potencjał ochronny u myszy. Łuk. Wirol. 2015, 160, 2517–2524. [Odniesienie]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Wzmocniony efekt immunizacji DNA oraz elektroporacji in vivo za pomocą kombinacji rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B-plazmidów PreS1 i S-PreS1. Clin. Szczepionka Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [Odniesienie]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; i in. Szczepionka mRNA przeciwko COVID-19 o strukturze typu rdzeń-powłoka, charakteryzująca się korzystnym wzorcem biodystrybucji i obiecującą odpornością. Transmisja sygnału. Celuj tam. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Rozwój i skuteczność pseudotypowanego układu SARS-CoV-2 określona metodą skuteczności neutralizacji i testu hamowania wejścia in vitro. Biosaf. Zdrowie 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Galic, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Replikująca szczepionka z wektorem bakteryjnym wyrażająca białka błonowe i nukleokapsydowe-2 SARS-CoV, chroni przed ciężką chorobą-19-podobną do COVID u chomików. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; i in. Kombinatoryczne szczepienie mRNA zwiększa ochronę przed wariantem delta SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Anton, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Współpraca białek strukturalnych pasażowalnego wirusa zapalenia żołądka i jelit (TGEV) w indukcji in vitro przeciwciał specyficznych dla wirusa. Rozdzielczość wirusa 1996, 46, 111–124. [Odniesienie]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Krawiec, N.; Mróz, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; i in. Pojedyncza immunizacja rekombinowanymi wirusami krowianki ACAM2000 wykazującymi ekspresję białek typu spike i nukleokapsydów chroni chomiki przed chorobą kliniczną spowodowaną SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Klasa, J.; Cholera.; Richner, JM A SARS CoV-2 szczepionka nukleokapsydowa chroni przed dystalnym rozprzestrzenianiem się wirusa. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marżok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Tak, G.; Luo, X.; i in. Podawanie przez błonę śluzową dróg oddechowych szczepionki przeciw COVID-19 nowej generacji zapewnia solidną ochronę zarówno przed pierwotnymi, jak i wariantowymi szczepami SARS-CoV-2. Komórka 2022, 185, 896–915.e19. [Odniesienie]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Zwiększona ekspresja białka nukleokapsydu SARS-CoV w tytoniu i jego immunogenność u myszy. Szczepionka 2009, 27, 5001–5007. [Odniesienie]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; i in. Wcześniejsze szczepienie białkiem nukleokapsydu związanym z ciężkim ostrym zespołem oddechowym (SARS) (SARS-CoV) powoduje ciężkie zapalenie płuc u myszy zakażonych SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [Odniesienie]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Simowie, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; i in. Skuteczność szczepionki u starzejących się myszy poddanych prowokacji rekombinowanym wariantem epidemii i odzwierzęcego ogniska niosącego SARS-CoV. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, Wirginia; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, wirus zapalenia wątroby myszy PJ Mouse i białka nukleokapsydowe wyrażane przez wektory adenowirusowe chronią myszy przed śmiertelną infekcją. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Zawieszony, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, Mc; Viscidi, R.; Tsai, YC; On ja.; Chen, PJ; i in. Wytwarzanie i charakterystyka szczepionek DNA ukierunkowanych na białko nukleokapsydu koronaawirusa ciężkiego ostrego zespołu oddechowego. J. Wirol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, At; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; i in. Specyficzna odporność limfocytów T na SARS-CoV-2-w przypadku COVID-19 i SARS oraz niezainfekowane grupy kontrolne. Natura 2020, 584, 457–462. [Odniesienie]