Ukierunkowanie na dehydrogenazę mleczanową A za pomocą katechiny powoduje ponowne uwrażliwienie komórek raka żołądka SNU620/5FU na 5-fluorouracyl, część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

2.5. Leczenie CA i 5Fu indukuje apoptozę mitochondrialną zależną od ROS

Ponieważ hamowanie LDHA bezpośrednio zwiększa mitochondrialne ROS i utratę jego potencjału błonowego, a następnie indukując apoptozę [16,29], zbadano czynniki związane z apoptozą za pośrednictwem mitochondrialnych ROS. Pojedyncze leczenie CA lub 5FU nieznacznie zwiększyło poziom mitochondrialnego ROS w komórkach SNU620/5FU przy pomiarze cytometrią przepływową przy użyciu MitoSOX. Jednak jednoczesne leczenie CA i 5FU znacznie zwiększyło produkcję mitochondrialnego ROS. Ta zwiększona produkcja ROS została odwrócona przez Mito-TEMPO, przeciwutleniacz ukierunkowany na mitochondria (rysunek 5A-C). Zahamowanie wzrostu po traktowaniu CA i 5FU odzyskano również po traktowaniu Mito-TEMPO w komórkach SNU620/5FU (Figura 5D). Ponadto apoptozę oceniano za pomocą barwienia aneksyną V-FITC/PI w komórkach SNU620/5FU. Jednoczesne traktowanie CA i 5FU zwiększyło liczbę komórek apoptotycznych wśród komórek SNU620/5FU (Figura 6A, B). Morfologiczna fragmentacja jądra komórkowego pojawia się podczas apoptozy i może być obserwowana przez barwienie 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) [30,31]. Stwierdzono, że fragmentacja DNA znacznie wzrosła w grupie równoleczonej w porównaniu z grupą kontrolną (Figura 6C). Na koniec zbadano biomarkery apoptozy, w tym Bcl-2, Bax, kaspazę-9, kaspazę-3 i PARP. Kaskada proapoptotyczna wzrosła po równoczesnym traktowaniu CA i 5FU w komórkach SNU620/5FU (Figura 6D). Te odkrycia sugerują, że jednoczesne traktowanie CA i 5FU indukuje apoptozę w komórkach SNU620/5FU.

Rycina 5. Jednoczesne traktowanie katechiną(CA) i 5-fluorouracylem(5FU) zwiększa produkcję mitochondrialnych ROS:(A)SNU620/5FU komórki były traktowane wskazanymi stężeniami CA,5FU（10 μM） i Mito -TEMPO~20 μM） przez 48 godzin. Mitochondrialne ROS komórek mierzono za pomocą analizy FACS przy użyciu MitoSOXTM Red; (B) wykres słupkowy pokazuje odsetek komórek, które były pozytywne pod względem barwienia MitoSOX; (C)obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego (X100) komórek SNU620/5FU barwionych MitoSOX przedstawiono; (D) żywotność komórek zmierzono za pomocą testu MTT. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Rysunek 6. Wzrost apoptozy przez jednoczesne leczenie katechiną (CA) i 5-fluorouracylem (5FU); Komórki SNU620/5FU traktowano CA （10 μM） i/lub 5FU （10 μM） przez 48 h∶（A） liczbę komórek apoptotycznych analizowano za pomocą analizy FACS przy użyciu barwienia PI-Anneksyną V; (B) wykres słupkowy wskazuje odsetek komórek we wczesnej i późnej fazie apoptozy. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

3. Dyskusja

W tym badaniu do scharakteryzowania i oceny chemooporności na 5FU użyto komórek SNU620/5FU, które zostały ustalone przez długotrwałą ekspozycję na 5FU z seryjnym wzrostem stężenia leku [32]. Doniesiono, że komórki rodzicielskie SNU620 zawierają mutanta p53 z homozygotyczną delecją w eksonie 5 [33]. W oparciu o mikromacierz DNA, kilka genów zaangażowanych w chemooporność, w tym syntetaza tymidylanowa, specyficzne dla uszkodzenia białko wiążące DNA 2, klusteryna i midkina, jest podwyższonych w komórkach SNU620/5FU [32]. W kilku wcześniejszych badaniach wykorzystano linię komórkową SNU620/5FU jako model do oceny skuteczności leków in vitro przeciwko oporności na 5FU poprzez antymitozę, aktywację AMPK i sygnalizację receptora kannabinoidowego [34-36]. Jednak charakterystyka metaboliczna i poziomy ekspresji genów związanych z metabolizmem w komórkach SNU620/5FU i ich rola w chemooporności nie zostały w dużym stopniu zbadane.

Tutaj wykazaliśmy, że komórki SNU620/5FU mają zaawansowane fenotypy glikolityczne, w tym zwiększoną produkcję mleczanu i ekspresję enzymów związanych z konwersją pirogronianu do mleczanu, takich jak LDHA. Fosforylacja PDHA1, reprezentująca zmniejszoną aktywność PDH przez podwyższone PDK2 i PDK3, również wzrosła w komórkach opornych na SNU620/5FU w porównaniu z komórkami macierzystymi SNU620. Jednak OCR nie był znacząco obniżony w komórkach opornych. Możliwym wyjaśnieniem tej rozbieżności jest plastyczność odżywcza komórek nowotworowych dla cyklu TCA, to znaczy aminokwasy lub acetylo-CoA pochodzący z kwasów tłuszczowych, a nie tylko acetylo-CoA pochodzący z glukozy, mogą dostarczać substraty do cyklu TCA [37]. W korelacji z tym komórki raka żołądka oporne na 5FU promują łodygę poprzez mitochondrialne utlenianie kwasów tłuszczowych [38]. Ponadto oporność na 5FU wiąże się ze zwiększoną masą i aktywnością mitochondriów, w tym z ekspresją enzymów łańcucha transportu elektronów (ETC) i zużyciem tlenu [39, 40]. Dlatego skupiliśmy się na modulacji LDHA w celu ponownego uwrażliwienia oporności na 5FU. W oparciu o nasze wyniki, hamowanie aktywności LDHA za pomocą oksamianu lub CA skutecznie hamowało wzrost opornych komórek SNU620/5FU i przywracało ich wrażliwość na traktowanie 5FU. Wyniki te wykazały dobrą korelację z wynikami poprzednich badań, w których stwierdzono, że genetyczne lub farmakologiczne hamowanie LDHA skutecznie zmniejsza oporność na chemioterapię, w tym na 5FU [19,41,42]. Tak więc założyliśmy, że hamowanie LDHA może być wystarczające do tłumienia oporności na 5FU w komórkach SNU620/5FU.

Cistanche może poprawić odporność

Kilka syntetycznych cząsteczek, takich jak oksaminian, FX11, PSTMB i GNE-140, zostało uznanych za małocząsteczkowe inhibitory LDHA [11,43]. Wśród nich, FX11 został zgłoszony jako uczulający na chemioterapię w opornych komórkach nowotworowych [44]. Jednakże, chociaż wiele inhibitorów LDHA jest analizowanych pod kątem zatwierdzenia jako nowe leki przeciwnowotworowe, żaden z nich nie został jeszcze zatwierdzony. W związku z tym do wytworzenia nowych inhibitorów LDHA potrzebna jest większa liczba kandydatów podobnych do leków [45]. Naturalne związki uważano za potencjalne zasoby leków przeciwnowotworowych, szczególnie w przezwyciężaniu chemooporności jako terapii skojarzonej [46,47]. Dlatego ukierunkowanie na metabolizm nowotworów, zwłaszcza metabolizm glukozy, za pomocą naturalnych produktów pochodzenia roślinnego jest nowym trendem badawczym w zakresie rozwoju nowych leków przeciwnowotworowych [48].

Co więcej, kilka doniesień sugeruje, że produkty naturalne, takie jak gossypol, galloflawina, krocetyna, maszyna A i EGCG, są silnymi inhibitorami LDHA [43,49,50]. Chociaż spośród nich, gossypol ma najsilniejsze działanie hamujące LDHA (IC50=9,8 uM), hamuje również aktywność LDHB, który przekształca mleczan w pirogronian [51]. Nasze wyniki wykazały, że EGCG, uznany inhibitor LDHA i uczulacz na chemioterapię 5FU [22-25], wywiera hamujący wpływ zarówno na aktywność LDHA, jak i LDHB. Wśród inhibitorów LDHA pochodzących z produktów naturalnych wykazujących specyficzne dla LDHA aktywności hamujące, takie jak maszyna A(IC50 =84 μM）, krocetyna （IC50 =54.9 μM） i CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA wykazał najlepszy efekt supresyjny na aktywność LDHA w odniesieniu do wartości ICsn.Chociaż struktury chemiczne CA i EGCG są bardzo podobne, z wyjątkiem dodatkowego ugrupowania kwasu galusowego, ich selektywności hamujące były nie to samo.Ponadto pomimo tego, że CA jest najprostszym związkiem, w porównaniu z jego pochodnymi, wykazywał najlepsze działanie hamujące zarówno na produkcję mleczanu, jak i aktywność LDHA. Dlatego należy przeprowadzić szeroko zakrojone badanie zależności struktura-aktywność, aby wykazać CA jako potencjalny nowy szkielet do opracowania swoistych i silnych inhibitorów LDHA.

Wiadomo, że EGCG jest konkurencyjnym inhibitorem NADPH. Ponadto EGCG hamuje translokację i reprodukcję oksydazy NADPH [52-54]. Jednak zgodnie z wynikami modelowania molekularnego CA i EGCG są strukturalnie zlokalizowane w różnych miejscach (ryc. 3A, B). Ponadto nie wykazały korelacji w swoistości w hamowaniu aktywności LDHA i LDHB, które wykorzystują NADH oraz NAD plus jako kofaktor. Na podstawie tych danych założyliśmy, że CA nie ma bezpośredniej korelacji z EGCG w mechanizmie konkurowania z NAD(P)H. Nawiasem mówiąc, hamowanie LDHA przez kilka inhibitorów, takich jak FX11, GSK 2837808A, NCI-737 i NCI-006, zmniejszyło wytwarzanie NADt i zwiększyło akumulację NADH, zmniejszając w ten sposób stosunek NAD plus /NADH[16,17,55]. Apoptoza indukowana przez szlak uszkodzenia DNA zależny od p53/NAD jest również podnoszona przez hamowanie LDHA za pomocą siRNA lub chemicznego inhibitora NH-2 [56]. Szlak sygnałowy GCN2-ATF4 został również opisany jako kolejny mechanizm odpowiedzialny za apoptotyczną śmierć komórek indukowaną przez inhibitor LDHA, GSK 2837808A [17]. Ponieważ stosunek NAD/NADH odgrywa kluczową rolę w homeostazie redoks i proliferacji komórek [5758], CA jako inhibitor LDHA może wpływać na komórki rakowe oporne na 5FU poprzez modulację stosunku NAD plus/NADH.

CA indukował śmierć komórkową zarówno w rodzicielskich komórkach SNU620, jak i SNU620/5FU opornych na 5FU. Jednak śmierć komórkowa wywołana CA była zależna od LDHA poprzez zubożenie shRNA w komórkach SNU620/5FU. Ponadto jednoczesne traktowanie CA i 5FU wykazało dodatkowe działanie przeciwnowotworowe na komórki oporne na 5FU. Jak wcześniej donoszono [16,59], hamowanie LDHA zwiększa ROS iw konsekwencji hamuje wzrost komórek nowotworowych. W przypadku zahamowania LDHA metabolizm energetyczny został przekształcony z glikolizy do cyklu TCA i mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej [60]. W ten sposób komórki nowotworowe wytwarzają więcej ROS, co powoduje uszkodzenie błony mitochondrialnej i apoptozę indukowaną przez mitochondria [61,62]. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, CA indukuje apoptotyczną śmierć komórek poprzez mitochondrialny szlak zależny od ROS. Zwiększona zdolność obrony ROS i zmniejszone sygnały apoptotyczne to wspólne właściwości komórek nowotworowych chemoopornych, szczególnie w komórkach opornych na 5FU 3,63. Co więcej, zmiany w metabolizmie raka, szczególnie w metabolizmie glukozy, również prowadzą do oporności na chemioterapię poprzez zmianę aktywności komórek, takich jak nieprawidłowa naprawa DNA, zwiększona autofagia, zmniejszona apoptoza, obrona przed ROS i zwiększone wydzielanie egzosomów [964,651 . Tak więc ukierunkowanie CA na enzymy glikolityczne, w tym LDHA, może być alternatywną strategią przezwyciężania chemooporności, zwłaszcza w przypadku raka żołądka opornego na 5FU. Ogólnie rzecz biorąc, szybko dzielące się nowotwory złośliwe są bardzo wrażliwe na inhibitory syntezy DNA, w tym 5FU, w porównaniu z normalną tkanką. Jednak niektóre komórki nowotworowe mogą rozwinąć oporność na leczenie poprzez kilka mechanizmów, jak opisano wcześniej [34-36]. Jednoczesne leczenie związkami bioaktywnymi i konwencjonalną chemioterapią ma większy wpływ w porównaniu z pojedynczym związkiem na spowolnienie rozwoju oporności |66. Dlatego efekty biologiczne określonych fitochemikaliów o udowodnionym działaniu cytotoksycznym, podawanych z konwencjonalną chemioterapią w celu ukierunkowania na szerszy zakres szlaków sygnałowych w komórkach rakowych, w tym metabolizm raka i funkcje mitochondrialne, powinny być lepsze niż pojedyncze związki w leczeniu raka, ponieważ mogą opóźniać rozwój odporności [67]. W tym badaniu połączenie CA i 5FU wykazało wyższe hamowanie żywotności komórek w porównaniu z pojedynczym leczeniem. Ponadto wykazaliśmy, że hamowanie aktywności LDHA i następująca po niej apoptoza mitochondrialna za pośrednictwem ROS może być mechanizmem leżącym u podstaw uczulającego działania CA na komórki oporne na 5FU (Figura 7).

Oprócz siły i specyficzności hamowania LDHA, CA jest bezpieczniejszy niż wcześniej ustalone inhibitory LDH pochodzące z produktów naturalnych. Ponadto CA jest dobrze znanym składnikiem chemicznym zielonej herbaty, a jego bezpieczeństwo i właściwości farmakodynamiczne zostały potwierdzone w poprzednich badaniach [68-70]. Jednak dokładna ocena toksyczności jednoczesnego podawania CA i 5FU nie została jeszcze przeprowadzona. Ponadto w tym badaniu nie badano skuteczności CA in vivo w komórkach nowotworowych opornych na 5FU. Jednak wcześniejsze badania donoszą o skuteczności przeciwnowotworowej in vivo CA i jego pochodnych w przezwyciężaniu chemooporności, w tym oporności na 5FU w ludzkim raku żołądka i okrężnicy [71-77]. W tym badaniu skupiliśmy się na hamowaniu LDHA jako głównym mechanizmie molekularnym CA przezwyciężania oporności na 5FU. Dlatego też, aby opracować CA jako nowy adiuwant dla opornych na chemioterapię komórek nowotworowych, należy ocenić skuteczność i bezpieczeństwo jednoczesnego leczenia CA i 5FU in vivo poprzez szeroko zakrojone badania na zwierzętach, w tym modele ksenoprzeszczepów i dobre oceny toksyczności laboratoryjnej.

4. Materiały i metody

4.1.Materiały

Przeciwciała przeciwko poli(ADP-rybozie)polimerazie, kaspazie-3 i kaspazie-9 zakupiono w firmie Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Przeciwciała przeciwko LDHA, dehydrogenazie gliceraldehydu 3-fosforanu (GAPDH) i PDHA1 zakupiono w Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), a te przeciwko fosforo-PDHA1 i PDK3 zakupiono z Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, USA). Ponadto przeciwciała przeciwko PDK2 i PDK4 zakupiono od Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), przeciwciała przeciwko PDK1 uzyskano z Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), a te przeciwko komórkom B chłoniak -2(Bcl-2) i białko X związane z Bcl-2- zakupiono od Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX zakupiono w Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Chemikalia i odczynniki, w tym 3-(4,5-dimetylotiazol-2-il)-2,5-bromek difenylotetrazoliowy (MTT),4',{{22} }diamidyno-2-fenyloindol, oksaminian, dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy, CA i pochodne CA (EC GC, EGC i EGCG) zakupiono w firmie Merck (Merck, Darmstadt, Niemcy). - dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (postać utleniona) zakupiono w Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Tokio, Japonia).

4.2.Kultura komórkowa

Ludzki rak żołądka SNU620, SNU620/5FU i AGS, rak trzustki Panic-1 i MIA PaCa-2 oraz komórki raka okrężnicy LS174T i RKO uzyskano z Koreańskiego Banku Linii Komórkowych (KCLB, Seul, Korea). ). Komórki SNU620, SNU620/5FU, AGS i LS174T hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)(Welgene, Daegu, Korea), uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). )(Gibco, New York, NY, USA) i 1 procent penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) oraz komórki Panc-1, MIA PaCa-2 i RKO hodowano w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (Welgene ) zawierający 10 procent inaktywowanej termicznie FBS i 1 procent penicyliny/streptomycyny. Wszystkie komórki hodowano w nawilżonym CO, inkubatorze w 37°C i 5% CO2.

4.3. Test żywotności komórek

Poziomy cytotoksyczności CA i 5FU w komórkach SNU620 i SNU620/5FU mierzono za pomocą testu MTT. Komórki hodowano na płytkach 24-dołkowych (2 x 104 komórek/dołek) ze wskazanymi stężeniami CA i 5FU przez podany dzień. Następnie do każdego dołka dodano roztwór MTT (2,0 mg/ml), po czym inkubowano przez 3-4h w 37°C i 5% CO w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie pożywkę hodowlaną usunięto i uzyskano absorbancję kryształów formazanu z żywych komórek. Dodano DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu i zmierzono to przy 540 nm stosując czytnik Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.4. Wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnik zużycia tlenu (OCR)

ECAR i OCR, wskazujące odpowiednio komórkowe szybkości glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej, były monitorowane za pomocą analizatora Seahorse XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), jak opisano wcześniej [78, 79]. W skrócie, 60,000 komórek SNU620 lub SNU620/5FU na studzienkę wysiano na sześciostudzienkowe płytki Seahorse XF w pożywce RPMI uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną. Po 30 min inkubacji, pożywkę z każdego dołka zastąpiono 80 µl wstępnie ogrzanej pożywki bez surowicy z 5 mM oksamianem, standardowym inhibitorem LDH [11]. Komórki następnie inkubowano w 37°C przez 24 godziny. Po inkubacji pożywkę z każdego dołka zastąpiono 180 µl podgrzanej pożywki XFbase (zawierającej 10 mM glukozę, 2 mM glutaminę i 1 mM pirogronian sodu; pH 7,4) w celu zmierzenia ECAR i OCR. Wyniki analizowano przy użyciu oprogramowania Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5.Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR)

Całkowity RNA wyekstrahowano przy użyciu zestawu RiboEx Total RNA Extraction Kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea), a cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu do odwrotnej transkryptazy (Promega, Madison, WI, USA). W odwrotnej transkrypcji użyto 1 ug całkowitego RNA , a całkowita ilość zsyntetyzowanego cDNA wynosi 20 µl. Każdy zestaw użyto zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościową reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu systemu StepOneTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) z Real HelixgPCR Zestaw (NanoHelix, Daejeon, Korea), na 40 cykli składający się z 15 s w 95 st. C i 1 min w 60 st. Względne poziomy mRNA znormalizowano do poziomów 18S rybosomalnego RNA, który służył jako endogenna kontrola. stosowane do qRT-PCR są wymienione w Tabeli 1.

4.6. Analiza blotów Westerna

Komórki przemyto 1x PBS i całkowite białka wyekstrahowano z komórek przy użyciu buforu RIPA i 1% buforu do lizy NP-40 zawierającego tabletki koktajlu inhibitorów proteazy (Roche, Bazylea, Szwajcaria). Każde stężenie białek mierzono za pomocą testu białkowego Bio-Rad. Z każdej próbki frakcjonowano równe ilości białka przez 8-15 procent SDS-PAGE, a następnie białka przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (GE Healthcare, Monachium, Niemcy) za pomocą elektroforezy. Błony zablokowano w temperaturze pokojowej (20-25 stopni) przez 1 godzinę przy użyciu 5% odtłuszczonego mleka w proszku i inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 4 stopniach przez noc. Następnie membrany te płukano trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej 1x Tris przez 10 min. Specyficzne pasma białek mierzono za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Ekspresja białek była regulowana przez GAPDH. 4.7. Test produkcji mleczanu

Wytwarzanie mleczanu mierzono w pożywce hodowlanej komórek SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T i RKO. Komórki te inkubowano przez 1 dzień w 37°C, a pożywkę hodowlaną zastąpiono następnie pożywką wolną od czerwieni fenolowej, po czym inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Pożywkę każdej komórki oceniano następnie przy użyciu komercyjnego zestawu do testów fluorometrycznych mleczanu (BioVision, Milpitas, CA, USA).

4.8. Testy aktywności LDHA i LDHB

Aby wykryć aktywność LDHA, wskazane stężenia CA inkubowano przez 20 min w buforze zawierającym 2 mM pirogronian, 20 µM NADH i 20 mM HEPES-K plus （pH7,2）. Dla aktywności LDHB zastosowano bufor zawierający 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM NAD plus i 2 M L-mleczan sodu. W skrócie, 10 nanogramów każdego z oczyszczonych rekombinowanych białek LDHA i LDHB zastosowano do testów aktywności LDHA i LDHB in vitro. Jeden mikrogram całkowitego białka z lizatów komórkowych zastosowano do wewnątrzkomórkowych oznaczeń aktywności LDHA i LDHB jako źródło enzymu. Fluorescencję NADH przy długości fali wzbudzenia 340 nm i długości fali emisji 460 nm wykrywano za pomocą spektrofluorometru (Spectramax M2; Molecular Devices), jak opisano wcześniej [80]. Aktywność LDHA mierzono przez zmniejszoną ilość NADH, podczas gdy aktywność LDHIB oceniano mierząc ilość NADH przekształconego z NADplus.

4.9. Interakcja białko-małe cząsteczki

Interakcja między białkiem a małymi cząsteczkami została przewidziana za pomocą programu Pyrex. W Pyrex zastosowano cząsteczki LDHA (PDB ID: 1110) oraz struktury 2D CA i EGCG otrzymane z bazy danych związków NCBI PubChem. ID CA wynosił 9064, a EGCG 65064. Względny rozkład ładunku powierzchniowego pokazano z obszarem kwasowym na czerwono, obszarem zasadowym na niebiesko i obszarem obojętnym na biało. Wiązania wodorowe w kompleksach LDHA odpowiednio z CA lub EGCG pokazano jako czarne kropkowane linie. Sekwencje uzyskano z UniProt (https://www.uniprot.org, dostęp 9 listopada 2020 r.) z numerami dostępu P00338 (LDHA).

4.10.Transfekcja krótkiego RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA)

Zastosowano wektor próbny pLKO.1 i wektor shRNA nakierowany na LDHA, jak opisano wcześniej [50]. Komórki wysiano na sześciostudzienkowych płytkach (2 x 10 stopni komórek/studzienkę) i inkubowano przez noc. Komórki SNU620/5FU transfekowano polietylenoiminą (PED) (transfekcja Polyplus, Ilkirch, Francja), gen i stosunek PEI wynosił 1:3. Następnie transfekowane komórki traktowano 1 ug/ml puromycyny przez 1 tydzień. Kontrolną linię komórkową wytworzono po zakażeniu zaszyfrowanym plazmidem.

4.11. Nadekspresja LDHA

Plazmid pDEST27-LDHA skonstruowano przez subklonowanie cDNA LDHA (zakupionego z Korea Human Gene Bank, Daejeon, Korea) do wektorów pDEST27 (Invitrogen). Przeprowadzono dwa zestawy subklonowanych dla LDHA. W celu rekonstrukcji LDHA komórki SNU620/5FU-shLDHA transfekowano pDEST27-LDHA i pustym plazmidem pDEST27. W skrócie, komórki hodowano do 70 procent konfluencji. Następnie komórki traktowano mieszaniną zawierającą 3 ug DNA i Lipofectamine 2000 (Invitrogen) przez 48 godzin. Po inkubacji komórki selekcjonowano za pomocą 200 ug/ml G418 przez 1 tydzień. Następnie, aby potwierdzić skuteczność transfekcji, przeprowadziliśmy test Western blot.

4.12.Analiza apoptozy

Komórki apoptotyczne wykrywano przy użyciu zestawu Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki wysiano na sześciostudzienkowych płytkach (2 x 10° komórek/studzienkę) i traktowano wskazanymi stężeniami CA i 5FU przez 2 dni. Po 2 dniach traktowania komórkę przemyto 1x PBS. Komórki zawieszono w 500 μl buforu wiążącego i potraktowano 5 μl aneksyny V-FITC i 5 μl jodku propidyny （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）, a następnie inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemność. Intensywność fluorescencji badano za pomocą BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Test wykrywania mitochondrialnych reaktywnych gatunków tlenu (ROS)

Wytwarzanie mitochondrialnych ROS wykryto przy użyciu wskaźnika MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Thermo Fisher Scientific). Komórki wysiano na sześciostudzienkowych płytkach 2 x 10 stopni komórek/studzienkę） i Mito-TEMPO（20 μM; Sigma-Aldrich® poddano wstępnej obróbce przez 1 godzinę przed leczeniem lekiem. Komórki ponownie zawieszono w 1 ml 1x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej （PBS）, po czym dodano 5 µM MitoSOX. Następnie komórki inkubowano przez 10 min w 37°C. Intensywność fluorescencji analizowano za pomocą BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Obraz fluorescencyjny wykrywano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie, 100x) (mikroskop Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy).

4.14. Barwienie jądra DAPI

SNU620/5FU wysiano na płytce 24-studzienkowej (5 x 104 komórek/studzienkę) i traktowano wskazanymi stężeniami CA i 5FU przez 48 godzin. Po przemyciu 1x PBS komórki ponownie zawieszono w 1-mL 1x PBS. Następnie komórki barwiono 4ug/ml DAPI przez 30 min w temperaturze pokojowej i badano pod mikroskopem fluorescencyjnym (powiększenie, 200x) (Carl Zeiss).

4.15. Analiza statystyczna

Wyniki żywotności komórek, produkcji mleczanu, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, aktywności LDHB, apoptozy i mitochondrialnego ROS przedstawiono w stosunku do wartości kontrolnych i wyrażono jako średnia ± błąd standardowy średniej z trzech niezależnych eksperymentów. Różnice powyżej średniej wartości każdej grupy analizowano testem t-Studenta, podczas gdy różnice między grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji z testem post hoc Tukeya przy użyciu programu GraphPad Prism (wersja 5.0, GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA).

5. Wnioski

Podsumowując, oporne komórki raka żołądka SNU620/5FU mają fenotypy glikolityczne, w tym podwyższoną produkcję mleczanu i wyższą ekspresję LDHA niż komórki rodzicielskie SNU620. Ograniczenie glikolizy za pomocą CA, jako specyficznego inhibitora LDHA, uwrażliwia komórki SNU620/5FU na 5FU. Dodatkowo, jednoczesne traktowanie CA i 5FU zwiększyło mitochondrialne ROS i apoptotyczną śmierć komórek w komórkach opornych na 5FU. Nasze odkrycia sugerują, że CA może być obiecującym kandydatem do opracowania leku adiuwantowego, który zmniejsza oporność na chemioterapię opartą na 5FU poprzez ograniczanie aktywności LDHA.

Materiały uzupełniające: Poniższe są dostępne online pod adresem https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, Rysunek S1: Wpływ 5FU na żywotność komórek SNU620/5FU, Rysunek S2: Wzrost SNU620 i komórki SNU620/5FU mierzone przez zliczanie komórek, Rysunek S3: Poziomy produkcji mleczanu w komórkach SNU620 i SNU620/5FU, Rysunek S4: Ekspresja izotypów PDK w komórkach SNU620 i SNU620/5FU, Rysunek S5: Wpływ oksaminianu na żywotność SNU620 i Komórki SNU620/5FU, Rysunek S6: Wpływ EGCG na aktywność LDHA i LDHB, Rysunek S7: Wpływ katechiny (CA) na poziomy ekspresji białek p-PDHA1, PDHA1 i PDK, Rysunek S8: Analiza kalorymetrii izotermicznej (ITC) LDHA i CA, Figura S9: Ekspresja LDHA w komórkach SNU620/5FU transfekowanych shLDHA, Figura S10: Pomiar fenotypów glikolitycznych i żywotności komórek w różnych komórkach rakowych, Figura S11: Surowe dane z testu Western blot.

Ten artykuł pochodzi z Int. J. Mol. Nauka. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms