Obecny stan neuroprotekcji we wrodzonych chorobach serca Część 1

Abstrakcyjny:

Obecność ektopowego DNA w cytoplazmie powoduje stan zapalny i śmierć komórki. Powszechnie donoszono, że wyciek jądrowego DNA do cytoplazmy można wykryć głównie za pomocą cyklicznej syntazy GMP-AMP (cGAS).

DNA to cząsteczka określająca informację genetyczną każdej osoby, znajdująca się w każdej naszej komórce. Ostatnie badania pokazują, że DNA może przedostawać się do cytoplazmy pewnymi drogami i wpływać na naszą pamięć.

Zjawisko to jest powszechne u osób starszych i osób z zaburzeniami funkcji poznawczych. Kiedy DNA przedostaje się do cytoplazmy, zakłóca normalne funkcje komórki i zwiększa ryzyko utraty pamięci i zaburzeń poznawczych.

Jednak nie musimy czuć się przygnębieni i beznadziejni z tego powodu. Istnieje wiele sposobów na poprawę pamięci i zdolności poznawczych, które pomogą nam zachować zdrowy mózg.

Po pierwsze, należy prowadzić zdrowy tryb życia. Obejmuje to stosowanie zrównoważonej diety, odpowiednią ilość snu, umiarkowane ćwiczenia i redukcję stresu. Praktyki te promują zdrowie mózgu, unikając w ten sposób wycieku DNA i poprawiając pamięć.

Po drugie, wymagany jest trening poznawczy. Może to obejmować granie w gry matematyczne, czytanie, uczenie się nowych umiejętności itp. Działania te mogą pomóc stymulować mózg i promować neurogenezę, aby uniknąć wycieku DNA.

Na koniec utrzymuj pozytywne nastawienie. Niestabilność emocjonalna i nadmierny stres mogą powodować zmiany w chemii mózgu, które sprzyjają wyciekowi DNA. Dlatego musimy nauczyć się pozytywnie stawić czoła wyzwaniom życia i zachować optymistyczne nastawienie.

Podsumowując, chociaż wyciek DNA do cytoplazmy może wpływać na pamięć, możemy poprawić zdrowie mózgu, uniknąć wycieku DNA i ostatecznie poprawić naszą pamięć, przyjmując odpowiedni styl życia, angażując się w trening poznawczy i utrzymując pozytywne nastawienie. Pamięć i zdolności poznawcze. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola to tradycyjny chiński materiał leczniczy, który ma wiele unikalnych efektów, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność Cistanche Deserticola wynika z wielu zawartych w niej składników aktywnych, w tym kwasu garbnikowego, polisacharydów, glikozydów flawonoidowych itp. Składniki te mogą promować zdrowie mózgu na różne sposoby.

Kliknij Poznaj 10 sposobów na poprawę pamięci

Niedawno donieśliśmy, że cytoplazmatyczny dwuniciowy DNA pochodzący z mitochondriów (dsDNA), który uniknął degradacji lizosomalnej, indukuje znaczną cytotoksyczność w komórkach hodowanych i in vivo. Przyjmuje się, że cytoplazmatyczny mitochondrialny DNA ma związek z różnymi chorobami i zaburzeniami, co potwierdza coraz więcej publikacji. Z drugiej strony obecna metoda oceny mitochondrialnego DNA w cytoplazmie może nie być ilościowa.

Tutaj szczegółowo przedstawiamy metodę oceny ektopowych inkomórek mitochondrialnego DNA. Metoda ta jest przydatna w badaniach podstawowych, a także w badaniu starzenia się, choroby Parkinsona, choroby Alzheimera, niewydolności serca, chorób autoimmunologicznych, raka i innych schorzeń.

Słowa kluczowe: ektopowy DNA; mitochondrialne DNA; mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (TFAM); choroba Parkinsona.

1. Wstęp

DNA zawiera informacje ważne dla przeżycia i dziedziczenia i należy je chronić przed różnymi stresorami, w tym utleniaczami i mutagenami. Komórki eukariotyczne zawierają mitochondria, które w procesie oddychania tlenowego wytwarzają energię wraz z wieloma aktywnymi formami tlenu.

Zatem w komórce eukariotycznej DNA występuje w jądrze lub mitochondriach, upakowane odpowiednio w błonie jądrowej lub błonie mitochondrialnej. Jednakże DNA może być obecny w cytoplazmie w pewnych warunkach, np. podczas infekcji wirusowych lub niewirusowych [1– 4].

Nawet w niektórych stanach niezakaźnych (na przykład w przypadku starzenia się lub różnych chorób związanych z wiekiem lub nowotworu) DNA może przedostać się do cytoplazmy z jądra lub mitochondriów [5–7].

DNA w cytoplazmie może mieć charakter zapalny i toksyczny dla komórek. Powszechnie donoszono, że wyciek jądrowego DNA do cytoplazmy indukuje zapalenie, cytotoksyczność i fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP), głównie poprzez cykliczny stymulator syntazy GMP-AMP (cGAS) szlaku genów interferonu (STING) [ 5,6].

Niedawno donieśliśmy, że wykazano, że cytozolowy dwuniciowy DNA (dsDNA) pochodzenia mitochondrialnego uciekający przed degradacją lizosomalną indukuje cytotoksyczność i neurodegenerację w komórkowych modelach choroby Parkinsona [8]. Na obecność lub wzrost takiego ektopowego DNA często wskazywały reprezentatywne obrazy mikroskopowe i poszlaki, a nie sam wzrost wycieku DNA.

Oczekuje się, że ocena tego ektopowego DNA będzie zyskiwać coraz większe znaczenie nie tylko w badaniach podstawowych, ale także w badaniach nad starzeniem się i innymi chorobami, takimi jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczne, niewydolność serca, choroby autoimmunologiczne, cukrzyca, niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) i nowotwory. Doniesiono, że szlak cGAS–STING ma kluczowe znaczenie nie tylko w procesie starzenia, ale także w patogenezie tych chorób [8–17].

Prawdopodobnie z powodu warunków oksydacyjnych wokół mitochondriów i braku skutecznego systemu naprawy mitochondrialnego DNA, mitochondrialny DNA jest znacznie bardziej podatny na mutacje lub uszkodzenia niż DNA jądrowy [18,19].

W przeciwieństwie do DNA jądrowego, DNA mitochondrialny występuje w wielu kopiach w pojedynczej komórce i jest syntetyzowany w razie potrzeby. Dlatego ryzyko przedostania się mitochondrialnego DNA do cytoplazmy może być znacznie większe podczas starzenia się lub w przypadku chorób nowotworowych, takich jak zaburzenia związane z wiekiem lub dysfunkcja mitochondriów lub nowotwory.

Wykrywanie i pomiar takiego cytoplazmatycznego DNA mitochondrialnego może mieć znaczenie w zrozumieniu patogenezy różnych chorób i starzenia się, a także może stać się biomarkerem i celem terapeutycznym.

Opracowaliśmy półilościową metodę oceny ektopowego wycieku mitochondrialnego DNA do cytoplazmy i tutaj szczegółowo opisujemy tę metodę. Praca ta umożliwia obiektywną ocenę wycieku mitochondrialnego DNA i jest przydatna w badaniu różnych patologii chorobowych.

2. Materiały i metody

2.1. Linie komórkowe, leczenie siRNA i ilościowa analiza PCR (qPCR).

Komórki HeLa uzyskano z komórek raka szyjki macicy pochodzących od pacjentki (ATCC,CCL-2). Komórki HeLa hodowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 w pożywce Dulbecco Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonia) uzupełnionej 10% płodowym bydlęcym (FBS) (Biowest, Nuaillé, Francja) i roztworem penicyliny i streptomycyny ( 100 jednostek/ml penicyliny G i 100 µg/ml siarczanu streptomycyny, Wako, Osaka, Japonia).

Dzień przed transfekcją komórki HeLa wysiano na płytki z gęstością 600 komórek/µl. Ekspresję interesujących genów wyciszono w komórkach HeLa przy użyciu siRNA Stealth RNAi (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A, TFAM: HSS144251, glukocerebrozydaza, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) w odczynniku transfekcyjnym Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) zgodnie z instrukcją producenta (końcowe stężenie RNA 10 nM).

Trzy dni po knockdown siRNA wyizolowano całkowity komórkowy RNA przy użyciu odczynnika TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta (Thermo Fisher Scientific). Szablony cDNA zsyntetyzowano z oczyszczonego RNA przy użyciu zestawu ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) ze starterami oligo (dT)20. QPCR przeprowadzono przy użyciu TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Japonia) i analizowano w Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). Startery PCR użyte w niniejszym badaniu to GBA forward (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA Reverse (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM forward (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM Reverse (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA),-3-dehydrogenaza fosforanowa (GAPDH) forward (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) i GAPDH odwrotny (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism w wersji 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA). Do porównania średnich arytmetycznych pomiędzy dwiema grupami wykorzystano dwustronny test t-Studenta. Dane przedstawiono jako średnie i ± błędy standardowe średnich.

2.2. Immunofluorescencyjne wykrywanie ektopowego mitochondrialnego DNA i analiza obrazu

Dzień przed transfekcją komórki HeLa wysiano na płytki z gęstością 600 komórek/µl. Ekspresję interesujących genów wyciszono w komórkach HeLa przy użyciu siRNA Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) w odczynniku transfekcyjnym Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) zgodnie z instrukcją producenta (końcowe stężenie RNA 10 nM).

Trzy dni po knockdown siRNA komórki poddano barwieniu immunofluorescencyjnemu. Do wykrywania mitochondrialnego DNA, przeciwciała anty-dsDNA (Abcam, Cambridge, UK, klon 35I9, nr kat. ab27156, RRID: AB_470907 lub EMD Millipore, Billerica, MA, USA, klon AC-30-10 , nr kat. CBL186, RRID: AB_11213573) wykazały lepszy stosunek sygnału do szumu niż Hoechst 33258, DAPI lub Picogreen. Tutaj połączyliśmy trzy przeciwciała pierwotne: przeciwciało anty-dsDNA (DNA 35I9) (Abcam, nr kat. ab27156, RRID: AB_470907), przeciwciało anty-histon-H2B (Abcam, nr kat. ab134211) i przeciwciało anty-ciepło- przeciwciało przeciwko białku szoku-60 (Hsp60) (Abcam, nr kat. ab46798, RRID: AB_881444).

Można wybrać inne przeciwciała lub znakowane fluorescencyjnie histonem lub alternatywnie można zastosować Hsp60, ale konieczne jest zoptymalizowanie warunków potrójnego barwienia dla każdej kombinacji.

Komórki przemyto dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrwalono lodowatym metanolem przez 10 min w temperaturze 4°C. Alternatywnie do utrwalenia można zastosować 4% paraformaldehyd (PFA), ale sygnały tła wydają się znacznie większe w próbkach utrwalonych PFA. Po utrwaleniu komórki przemyto trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami z Tween 20 (PBST) przez 5 minut każdy. Komórki permeabilizowano PBS zawierającym 0,2% (w/v) Triton X-100 przez 10 minut.

Po trzykrotnym przemyciu PBST przez 5 minut, komórki inkubowano z 2% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBST przez 30 minut. Komórki inkubowano z pojedynczym przeciwciałem pierwotnym, przeciwciałem antyhiston-H2B (1/400, Abcam, nr kat. ab134211) rozcieńczonym w 2% (w/v) BSA w PBST O/N w 4°C. Po trzykrotnym przemyciu PBST przez 5 minut, komórki inkubowano z Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anty-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, nr kat. {{17 }}) rozcieńczony w 2% (w/v) BSA w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).

Po trzykrotnym przemyciu PBST po 5 minut, komórki inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałem anty-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, nr kat. ab27156, RRID: AB_470907) i anty-dsDNA -Przeciwciało Hsp60 (1/400, Abcam, nr kat. ab46798, RRID: AB_881444) rozcieńczone w 2% (w/v) BSA w PBST nanoszono na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc (O/N) w temperaturze 4◦C.

Po trzykrotnym przemyciu PBST przez 5 minut, komórki inkubowano z silnie adsorbowaną krzyżowo skoniugowaną Alexa Fluor 680-Donkey anty-króliczą IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, nr kat. A10043 , RRID: AB_2534018) ​​i Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam nr kat. ab150108, RRID: AB_2732073) rozcieńczone w 2% (w/v) BSA w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Komórki przemywano trzykrotnie PBST za każdym razem przez 5 minut, a próbkę analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego A1R+ (Nikon, Tokio, Japonia).

For more information:1950477648nn@gmail.com