Globalna częstość występowania przewlekłej choroby nerek (PChN) rośnie wraz ze starzeniem się populacji

Skontaktuj się z oscar.xiao@wecistanche.com, aby uzyskać więcej informacji

Tło:Zwłóknienie jest jedną z najczęstszych patologicznych cech procesu starzenia się nerek, a zwłóknienie w starzejących się nerkach pogarsza również proces przewlekłej choroby nerek (PChN). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) jest powszechnie stosowanym lekiem botanicznym w chińskim folklorze. Jednak niewiele badań wykazało jego działanie farmakologiczne. To badanie miało na celu zbadanie wpływu etanolowego ekstraktu CF na zwłóknienie nerek u myszy SAMP8 i identyfikację potencjalnie aktywnych związków.

Metody:Jako modele zwierzęce użyto myszy ze skłonnością do starzenia 8 (SAMP8), a różne dawki mukowiscydozy podawano przez zgłębnik przez jeden miesiąc. Aby obserwować stopień starzenia nerek u myszy za pomocą barwienia -galaktozydazą. Do oceny zwłóknienia nerek u myszy zastosowano barwienie Massona i poziomy ekspresji Col-1I, a-SMA i FN. Zmierzono poziomy ekspresji białka szlaku Nrf2 i szlaku Wnt/-katenina/RAS w nerkach. Oraz -galaktozydaza ( -gal) indukowała komórki NRK-52E jako model in vitro do badania przesiewowego aktywnych składników CF.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Wyniki:Ekstrakt etanolowy CF znacząco hamował aktywność galaktozydazy nerkowej i poziomy ekspresji myszy Coll, a-SMA i FNin SAMP8 oraz poprawiał barwienie Massona u myszy SAMP8. CF znacznie obniżyła poziom białka w moczu, kreatyniny, azotu mocznikowego i poziomu TNF-a i IL-1 w surowicy u myszy SAMP8 i znacząco zwiększyła poziomy SOD i GSH-Px. Ponadto CF aktywował szlak Nrf2 i blokował szlak Wnt/-katenina/RAS w nerkach myszy. Poza tym,3,4-dihydroksyfenyloetanol (SDC-0-14,16) i (3,4-dihydroksyfenyloetanol-8-O-[4-O-trans -kafeoilo- -D-apiofuranozy-(1→3)- -D-glukopiranozyl (1→6)]- -D-glukopiranozyd (SDC-1-8) zostały wyizolowane z CF , co zmniejszyło starzenie się komórek NRK-52E i być może aktywnych składników mukowiscydozy pełniących rolę przeciwstarzeniową.

Wnioski:Nasze eksperymenty pokazały, że etanolowy ekstrakt CF może łagodzić zwłóknienie nerek u myszy SAMP8 poprzez szlak Wnt/-katenina/RAS. A SDC-0-14,16 i SDC-1-8 mogą być materialną podstawą do wywierania przez mukowiscydozę efektów związanych ze starzeniem się nerek.

Słowa kluczowe:Starzenie się, Corallodiscus flabellata, Nerka, Zwłóknienie nerek, SAMP8, Starzenie, Wnt/-katenina/RAS

Wstęp

Globalna częstość występowania przewlekłej choroby nerek (PChN) rośnie wraz ze starzeniem się populacji i stanowi znaczne obciążenie dla społeczeństwa [1-3]. Najczęstszą patologiczną manifestacją PChN jest pewna postać zwłóknienia nerek[4]. Podobnie zwłóknienie nerek jest również jednym z objawów starzenia się nerek [2]. Badania wykazały, że stres oksydacyjny, stan zapalny, sygnalizacja Wnt/-katenina, układ renina-angiotensyna-aldosteron (RAS) i rapamycyna (mTOR) są powiązane z PChN wywołaną starzeniem [5]. Zwłóknienie nerek w starzejących się nerkach jest ściśle związane z aktywacją szlaku sygnałowego Wnt/-kateniny i RAS [6]. Po aktywacji Wnts, katenina w cytoplazmie jest translokowana do jądra, gdzie wiąże się z rodziną czynników transkrypcyjnych czynnika wiążącego wzmacniacz limfoidalny (LEF)/czynnika transkrypcyjnego czynnika komórek T (TCF) i inicjuje transkrypcję dalszych genów docelowych. Co ciekawe, region promotorowy genu RAS zawiera również miejsca wiązania LEF/TCF, co pozwala kateninie promować wiązanie LEF-1 z tymi miejscami[7].cholesterol cistanche,Dlatego ukierunkowanie na szlak sygnałowy Wnt/-katenina/RAS może być potencjalną strategią terapeutyczną w przypadku zwłóknienia nerek [8, 9]. W ostatnich latach terapia zastępcza zwłóknienia nerek produktami naturalnymi przyciągnęła uwagę wielu badaczy [10]. . Xiaoyan Shen i wsp. stwierdzili, że ginsenozyd Rgl łagodził włóknienie kłębuszków nerkowych podczas starzenia się nerek poprzez hamowanie aktywacji inflamasomu NLRP3 u myszy SAMP8 [11]. W badaniu tym zbadano wpływ ekstraktu C. flabellate (CF) na zwłóknienie nerek u myszy SAMP8 ze szlaku Wnt/-katenina/RAS.

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Mukowiscydoza jako roślina lecznicza w Chinach została po raz pierwszy odnotowana w „Dian Nan Ben Cao. Cała roślina jest powszechnie stosowana w leczeniu czerwonki, przedwczesnego wytrysku, choroby pęcherzyków nasiennych i chorób nerek na terenach należących do mniejszości etnicznych w Chinach [12]. Istnieje niewiele doniesień na temat mukowiscydozy we współczesnych badaniach.Badania farmakologiczne w naszym laboratorium wykazały, że ekstrakt z mukowiscydozy miał działanie moczopędne i łagodził niewydolność wątroby wywołaną przez lipopolisacharyd/D-galaktozaminę i uszkodzenia mózgu u szczurów [13, 14]. ujawniło, że glikozydy fenyloetanoidowe i flawonoidy są głównymi składnikami chemicznymi mukowiscydozy [15,16] Celem tego badania było zbadanie wpływu ekstraktu mukowiscydozy na zwłóknienie nerek u myszy SAMP8 i wyjaśnienie jego możliwego mechanizmu, aby zapewnić eksperymentalne dowody na leczenie choroby nerek z mukowiscydozą opisane w starożytnych księgach.

Materiały i metody

Zbieranie i ekstrakcja materiału roślinnego

„Yunnan Chinese Herbal Medicine” odnotowuje, że CF można zbierać przez cały rok. Rośliny CF użyte w tym eksperymencie zebrano we wrześniu w hrabstwie Xixia w prowincji Henan w Chinach. Został zidentyfikowany przez profesora Suiqing Chen z Uniwersytetu Medycyny Chińskiej Henan, a okazy były przechowywane w laboratoryjnej bibliotece próbek.skutki uboczne cistanche deserticolaRośliny (1 kg) ogrzewano pod chłodnicą zwrotną z 50% etanolem (3 x 12 l, co 1 h) i mieszaninę przesączono przez 16 warstw gazy. Połączone filtraty osuszono na wyparce obrotowej przy użyciu liofilizatora. Ostatecznie procentowa wydajność 50% surowego ekstraktu CF w etanolu wyniosła 15,5%. Wysuszony ekstrakt przechowywano w lodówce do dalszego użycia. Materiały uzupełniające wymieniają odpowiednie dane dotyczące oznaczenia składnika ekstraktu CF.

Inny wcześniej opisany proces separacji został zastosowany w tym badaniu w celu uzyskania frakcji elucji wodą, 20% frakcji elucji etanolem, 30% frakcji elucji etanolem i 40% frakcji elucji etanolem z CF [13]. 40-procentową frakcję etanolu oddzielono przy użyciu kolumny Sephadex LH-20 i żelu krzemionkowego oraz oczyszczono metodą półpreparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), aby ostatecznie uzyskać związki takie jak SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(alkohol p-hydroksybenzylowy).

Zwierzęta i administracja

W tym badaniu wykorzystano sześciomiesięczne samce SAMP8 i odporne na starzenie myszy 1 (SAMR1) z przyspieszoną starzeniem z Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Tianjin (Tianjin, Chiny). Zwierzęta trzymano w kontrolowanych warunkach światła (12-h cykl światło/ciemność), temperatury (23-25 stopni C) i wilgotności (45-55 procent) i otrzymywały standardową dietę i wodę do libitum. Łącznie 48 myszy SAMP8 podzielono na cztery grupy eksperymentalne (n=12/grupę): myszy model SAMP8 (M), myszy SAMP8 z niską dawką ekstraktu CF w etanolu (CF-L, 387,5 mg/kg, dożołądkowo), myszy SAMP8, którym podawano ekstrakt etanolowy CF w średniej dawce (CF-M 775 mg/kg, dożołądkowo) i myszy SAMP8 w wysokiej dawce ekstraktu CF w etanolu (CF-H, 155 0 mg/ kg, dożołądkowo). Wszystkie myszy leczono doustnie przez 1 miesiąc. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Medycyny Chińskiej Henan i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji (Henan, China Approval Number: HACTCM-2018009060-19). Podczas eksperymentu w każdej z grup Con i M nastąpiła śmierć jednej myszy, a dwie myszy padły w grupie CF-H.

Pobieranie próbek

Pod koniec eksperymentu myszy trzymano pojedynczo w metabolicznych klatkach na 12-godzinne pobranie moczu. Myszy następnie znieczulono izofluranem i pobrano próbki krwi przez krwawienie pozaoczodołowe. Nerki każdej myszy zostały następnie usunięte chirurgicznie i utrzymywane w temperaturze 80 stopni do czasu analizy.

Hodowla komórkowa i badanie in vitro

Komórki NRK-52E zakupione z Banku Komórek Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny) hodowano w celu zbadania wpływu ekstraktu CF na starzenie się komórek spowodowane przez D-galaktozę (D-gal, S11050, Yuanye, Szanghai Chiny). Komórki NRK-52E hodowano w zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle's Dulbecco (DMEM, 12 100 046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni C i w obecności 5 procent , komórki CO. hodowano na płytkach 96-dołkowych lub 6-dołkowych do 80-85 procentu konfluencji, a następnie traktowano pożywką wzrostową zawierającą różne kombinacje leków: Pożywka plus D-gal ( 20 mg/mL）, pożywka plus D-gal plus CF（10, 25,50, 100 ug/ml）lub pożywka plus D-gal plus związek monomeryczny（10 μM） odpowiednio przez 48 h. Następnie metylotiazolilotetrazol ( Test MTT) zastosowano do wykrycia żywotności komórek, a barwienie galaktozydazą zastosowano do zaobserwowania starzenia się komórek.

Barwienie galaktozydazą związane ze starzeniem

Zamrożone nerki myszy pokrojone na skrawki o grubości 10-μm i komórki NRK-52E wybarwiono galaktozydazą związaną ze starzeniem się (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny) zgodnie z protokołami producenta.

Analiza histologiczna

Skrawki nerki utrwalono 4% buforowanym paraformaldehydem, a skrawki zatopione w parafinie o grubości 10-μm wybarwiono trichromem Massona (G1006, Service, Wuhan, Chiny) i obserwowano pod mikroskopem. Zabarwione na niebiesko obszary w skrawkach barwionych trichromem Massona mierzono ilościowo z sześciu losowo wybranych pól i analizowano za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus 6.0.

Pomiary biochemiczne

Próbki surowicy i homogenatu nerek rozmrożono do temperatury pokojowej, a poziomy dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Chiny), peroksydazy glutationowej (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Chiny), interleukina-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Wuhan, Chiny), czynnik martwicy nowotworu (TNF-, RK00027, ABclonal, Wuhan, Chiny), azot mocznikowy (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Chiny), kreatynina (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Chiny) w surowicy myszy, całkowite białko w moczu (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Chiny) w moczu myszy i poziomy ekspresji kolagenu typu I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, China), -aktyny mięśni gładkich (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, China), fibronektyny (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Chiny) w mysich tkankach nerki mierzono kolejno zgodnie z protokołem producenta zestawu testowego.

Analiza immunohistochemiczna

Analizę immunohistochemiczną przeprowadzono rutynową metodą [17]. Zastosowane przeciwciała obejmowały następujące: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin(17565-1-AP,Proteintech,Chicago, USA), receptory angiotensyny II typu 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), czynnik p-jądrowy 2- związany z czynnikiem 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania), pc-Fos(ab27793,Abcam, Cambridge, Wielka Brytania ), czynnik wzrostu tkanki łącznej (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Chiny). Skrawki obserwowano pod mikroskopem (Olympus, Tokio, Japonia).dawkowanie cistanche redditZmierz powierzchnię i zintegrowaną gęstość optyczną (IOD) obszaru z wyrażeniem opalenizny za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus 6.0 i oblicz średnią gęstość optyczną (MOD, MOD=IOD/powierzchnia) dla pół -analiza ilościowa.

Analiza Western blot

Test Western blot przeprowadzono w sposób opisany w poprzednim badaniu [18]. W skrócie, tkanki nerki homogenizowano w buforze do lizy i oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Chiny). Homogenaty poddano następnie elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu i zablokowano w buforze blokującym (4% odtłuszczone mleko w proszku) przez 90 minut. Następnie inkubowano je z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Wnt4; renina; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; podobne do Kelch białko 1 związane z ECH (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Chiny); -aktyna (AC026, Abclonal, Wuhan, Chiny) i dehydrogenaza gliceraldehydowa -3-fosforanowa (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Chiny)) przez noc w 4 stopniach, a następnie inkubacja z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z fluorem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej . Białka będące przedmiotem zainteresowania zeskanowano skanerem IR Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA), a natężenia sygnału określono ilościowo przy użyciu oprogramowania Image Studio. Poziomy białka znormalizowano względem p-aktyny lub GAPDH.

Analiza UPLC-Q-TOF-MS dla próbek nerki

Tkanki nerek zważono i homogenizowano w lodowatej soli fizjologicznej (wag./obj. =1:1). Następnie 1 ml acetonitrylu dodano do 200 μl próbek homogenatu tkankowego, po czym przeprowadzono ekstrakcję ultradźwiękową przez 30 min. Ekstrakt odwirowano przy 12,{7}} gi 4 stopniach przez 10 min. Supernatant pobrano do fiolki do analizy. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA), z systemem LC obejmującym kolumnę Acclaim RSLC 120 C18 （2,2 μm, 2,1x100 mm; Termonaukowe).korzyści z ekstraktu z cistancheFaza ruchoma składała się z rozpuszczalnika A (acetonitrylu) i wody z {{0}},1% kwasu mrówkowego (B). Rozdział przeprowadzono przez elucję gradientową w następujący sposób: 10-70 procent A od 0 do 3 min, 70-78 procent A od 4 do 13 minut, 78-90 procent A od 14 do 15 min, 90 procent -10 procent A od 15 do 16 minut i 10 procent A od 16 do 20 minut. Objętość wtrysku badanej próbki wynosiła 2 μl. Analizę spektrometrii mas (MS) przeprowadzono przy użyciu źródła ESI w następujących warunkach: napięcie kapilary w trybie dodatnim wynosiło 3,5 kV, a napięcie kapilary w trybie ujemnym wynosiło 3,2 kV. Ciśnienie w nebulizatorze wynosiło 2,0 bar, temperatura suchego gazu wynosiła 230 stopni, a natężenie przepływu 8 l/min.

Analiza statystyczna

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; do porównania między grupami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji. Wartość AP poniżej 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Wyniki

CF poprawiła starzenie się i zwłóknienie nerek u myszy SAMP8

Aby zbadać wpływ CF na nerki myszy SAMP8, zmierzono aktywność SA- -gal w nerkach. Na ryc. la, aktywność SA- -gal w tkankach nerek znacząco wzrosła w grupie M (wzmocnienie na niebiesko). Podawanie CF-L i CF-M znacząco hamowało aktywność -galaktozydazy w nerkach myszy SAMP8, podczas gdy poprawa przez CF-H nie była znacząca. Również wskaźnik nerkowy grupy modelowej był znacznie niższy niż w grupie kontrolnej (ryc. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF poprawiła czynność nerek, stres oksydacyjny i poziom stanu zapalnego u myszy SAMP8

Poza tym testowano wskaźniki funkcji nerek każdej grupy myszy, które obejmowały objętość moczu myszy przez 12 godzin, poziomy azotu Cr i mocznika w surowicy oraz poziomy białka w moczu. Jak pokazano na ryc. 2a-d, poziomy białka w moczu, Cr w surowicy i azotu mocznikowego w surowicy w grupie modelowej były znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej (ryc. 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche Czyngis-chanNastępnie zbadano, czy mukowiscydoza korzystnie moduluje stres oksydacyjny i stan zapalny w nerkach szybko starzejących się myszy. Jak pokazano na ryc. grupa Con. Po leczeniu CF powyższe wskaźniki uległy poprawie, zwłaszcza efekt poprawy CF-L i CF-M jest lepszy.

CF aktywował szlak Nrf2 w nerkach myszy SAMP8

Poziom ekspresji p-Nrf2 zmierzono w tkankach nerki w celu zbadania, czy szlak Nrf2 był zaangażowany w ochronne działanie CF (Fig. 3a-c) w niniejszym badaniu. Poziom ekspresji p-Nrf2 znacząco spadł w samej grupie SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

Aktywacja sygnalizacji osłabionej CF Wnt/-katenina/RAS w nerkach myszy SAMP8

W celu dalszego zbadania potencjalnego mechanizmu wywierania przez mukowiscydozę działania przeciwwłóknieniowego. Lokalizację białka przeprowadzono za pomocą immunohistochemii. Jak pokazano na rys. 4a, poziom ekspresji Wnt4 i

-katenina była indukowana głównie w komórkach kanalików nerkowych. Podobne wyniki zaobserwowano, gdy oceniono AGTR1, cele szlaku niższego szlaku sygnalizacji Wnt (ryc. 4a). Następnie określono ilościowo poziom ekspresji białka, a wyniki wykazały, że białka Wnt4, -katenina, renina i AGTR1 akumulowały się w tkance nerek myszy w grupie modelowej, podczas gdy CF znacząco hamował te zmiany (ryc. 4b-f ). Ponadto zlokalizowano i przeanalizowano ilościowo poziom ekspresji CTGF. Zgodnie z powyższymi wynikami, CTGF ulegał ekspresji głównie w kanalikach nerkowych, a CF wyraźnie hamował aktywność CTGF (ryc. 4d g).

CF i jego związki hamowały starzenie się komórek NRK-52E indukowane przez D-gal

Komórki NRK-52E indukowane przez D-gal zostały użyte do przesiewania pewnych składników aktywnych w mukowiscydozie, aby określić podstawę materiałową do leczenia starczych nerek ekstraktem z mukowiscydozy. Wyniki wykazały, że CF zwiększa żywotność komórek w sposób zależny od dawki, a związki

SDC-0-14,16 i SDC-1-8 wyizolowane z CF miały lepszy wpływ na proliferację komórek. Poza tym, 25 ug/ml CF i związki SDC-0-14,16 i SDC-1-8 wszystkie wykazywały efekt hamowania aktywności -galaktozydazy (Fig.5).

Analiza PCA poprawiająca CF w tkance nerek u myszy SAMP8 Przeprowadzono analizę głównych składników (PCA) w celu zbadania wpływu CF na myszy SAMP8. Jak pokazano na ryc. 6a, istniało oczywiste grupowanie między grupą kontrolną i modelową (R2X=0.542; Q2=0.38), co sugeruje, że endogenne metabolity myszy SAMP8 różniły się od SAMR1 myszy, co powoduje, że odbiegają od grupy SAMR1. Jak pokazano na ryc. 6b, różne grupy CF również zgrupowały się w różne klasy niż grupy kontrolne i modelowe, a grupy CF przesunęły się bliżej grupy kontrolnej, co wskazuje, że

Endogenne metabolity myszy SAMP8 poddanych interwencji CF były podobne do tych u myszy SAMR1.

Dyskusja

Ważną rolę w progresji PChN odgrywa starzenie się [19]. W miarę postępu zwłóknienia CKD, starzejące się komórki eksprymują i wydzielają czynniki profibrotyczne (TGF-, CTGF itd.) i czynniki prozapalne (IL-1, IL-6, TNF- itd. ), które są czynnikami wydzielniczymi związanymi ze starzeniem się, a tym samym przyspieszają włóknienie nerek [20, 21]. Obecnie tradycyjna medycyna chińska osiąga dobre wyniki w leczeniu zwłóknienia nerek przy mniejszej liczbie skutków ubocznych [22]. W badaniu tym zbadano interwencyjny wpływ ekstraktu CF na zwłóknienie nerek u myszy SAMP8. Szczep myszy wybrany do tego badania to SAMP8, który został opracowany w oparciu o długość życia, starzenie się i patologiczne oceny fenotypowe AKR/myszy i był modelem przyspieszonego starzenia wyłącznie pochodzenia genetycznego [23,24]. Badania wykazały, że zmiany w patologii nerek myszy SAMP8 (9 miesięcy) obejmują zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe i ogniskowe segmentowe stwardnienie kłębuszków nerkowych [25]. Stwierdzono, że zwłóknienie nerek u myszy SAMP8 było związane z wiekiem [6]. Dlatego przetestowaliśmy aktywność -galaktozydazy i

poziom zwłóknienia nerek u myszy SAMP8 i stwierdzili, że CF-L i CF-M poprawiły zwłóknienie nerek i aktywność -galaktozydazy u myszy SAMP8 (Fig. 1). Przetestowaliśmy również wydalanie moczu myszy. Zgodnie z wcześniej opublikowanymi badaniami wskazującymi, że mukowiscydoza uzyskana dwoma różnymi procesami ma działanie moczopędne [13], ekstrakt znacząco zwiększał objętość moczu myszy SAMP8. Ponadto niniejsze badanie wykazało, że suplementacja CF poprawiła czynność nerek, aktywność enzymów antyoksydacyjnych i poziomy czynników zapalnych u myszy SAMP8 (ryc. 2).

System Keap1-Nrf2 zwrócił w ostatnich latach uwagę wielu naukowców ze względu na swoje właściwości przeciwutleniające i przeciwzapalne. Jego farmakologiczny potencjał w leczeniu chorób nerek był szeroko badany w badaniach nieklinicznych i klinicznych [26]. Nrf2 jest głównym regulatorem transkrypcji genów związanych ze statusem redoks i działaniem antyoksydacyjnym [27]. Badania wykazały, że fosforylacja jest wymagana do aktywacji Nrf2 i indukcji genu docelowego [28]. Aktywacja Nrf2 poprawiła progresję PChN, zapobiegając stresowi oksydacyjnemu i utrzymując komórkową homeostazę redoks [29]. Jako kluczowy czynnik transkrypcyjny, Nrf2 odgrywa kluczową rolę w obronie przed stresem oksydacyjnym poprzez regulację jego przeciwutleniaczy i enzymów detoksykacyjnych [30]. Kim i in. donoszą, że resweratrol, jako silny aktywator Nrf2, łagodził postępujące uszkodzenie nerek związane z wiekiem [31]. W niniejszym badaniu CF poprawiła atenuację Nrf2 w nerkach myszy SAMP8 bez wpływu na poziom ekspresji Keapl, co sugeruje, że surowy ekstrakt CF może poprawić uszkodzenia oksydacyjne w nerkach poprzez aktywację szlaku Nrf2 (ryc. 3).

Zwłóknienie nerek charakteryzuje się nadmiernym odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) prowadzącym do powstania blizn w miąższu nerki [32]. Uważa się, że transformujący czynnik wzrostu- (TGF- ) jest kluczową cytokiną w nadaktywacji fibroblastów [33, 34]. Oczywiście ukierunkowanie tylko na szlak sygnałowy TGF jest niewystarczające do zmniejszenia zwłóknienia nerek. Niektóre badania wykazały, że CTGF, Wnt/-katenina, układ renina-angiotensyna, stres oksydacyjny i tak dalej, były zaangażowane w zwłóknienie nerek [35-37]. Wnt/-katenina jest ewolucyjnie zachowaną ścieżką sygnalizacyjną zaangażowaną w regulację homeostazy tkanek, rozwój narządów i naprawę uszkodzeń [38]. Cisternas i in. omówili pro-włókniste działanie sygnalizacji Wnt zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i nerkach [39]. Coraz więcej dowodów wykazało, że szlak sygnalizacyjny Wnt/-katenina odgrywa kluczową rolę w regulacji rozwoju i progresji zmian zwłóknieniowych nerek po urazie [40-42]. Sygnał Wnt/-katenina jest stosunkowo cichy w nerkach zdrowych osób dorosłych i jest aktywowany, gdy nerki zostaną poddane różnego rodzaju uszkodzeniom [43].

U ssaków rodzina Wnt ma co najmniej 19 członków rodziny krytycznych dla rozwoju nerek. Co najmniej 15 z tych członków rodziny jest różnie podwyższonych w starzejącej się nerce, w tym Wnt4 [6]. Wyniki niniejszego badania wykazały, że poziom ekspresji białka Wnt4 w nerkach myszy SAMP8 był znacznie wyższy niż u myszy SAMR1, co zostało zweryfikowane zarówno przez analizę Western blot, jak i analizę immunohistochemiczną (ryc. 4a, d i f). Przypadkowo podwyższono również poziom ekspresji białka -kateniny. Ponadto, zarówno Wnt4 jak i katenina ulegały ekspresji w komórkach nabłonka kanalików nerkowych, jak wykazała analiza immunohistochemiczna (Fig. 4a if). Wnt/-katenina wywoływała zwłóknienie nerek poprzez indukcję wielu fibrogennych genów, takich jak składniki RAS, metaloproteinaza macierzy -7 (MMP-7), inhibitor 1 aktywatora plazminogenu (PAI-1) i Ślimak [37 ]. Zhou i in. opisali Wnt/-kateninę jako główny regulator upstream, który kontroluje ekspresję wszystkich badanych składników RAS w nerkach [44]. Zhou i wsp. wykorzystali szczurzy model 5/6 nefrektomii (5/6 NX), aby pokazać poziomy ekspresji głównych składników RAS w mózgu i nerkach, takich jak angiotensynogen, enzym konwertujący angiotensynę i AT angiotensyny II {{25 }}receptor był znacznie podwyższony. Podwyższony poziom ekspresji był hamowany przez centralny bloker Wnt, który był wektorem wirusa związanego z adenowirusem z nadekspresją genu DKK1 [45]. Podobnie, niniejsze badanie wykazało, że AGTR1 był nadal eksprymowany w nabłonku kanalików nerkowych, a poziomy ekspresji reniny i AGTR1 w tkankach nerek myszy SAMP8 były znacznie wyższe niż u myszy SAMR1 (Fig. 4a i dg). Wyniki te wskazują, że szlak sygnalizacyjny Wnt/-katenina/RAS został aktywowany w nerkach myszy SAMP8, a CF skutecznie hamował aktywację tego szlaku.

CTGF pełni wiele funkcji biologicznych, w tym promuje mitozę komórek chemotaktycznych, indukując adhezję oraz promując proliferację komórek i syntezę ECM [35,46]. CCN2 (CTGF) moduluje sygnalizację Wnt przez wiązanie się z białkiem 5/6 związanym z receptorem lipoprotein o małej gęstości (LRP5/6) w celu dalszego pośredniczenia w zwłóknieniu [39, 47]. Inne badania wykorzystywały wyciszanie genów, aby odkryć i potwierdzić, że Nrf2 reguluje szlak Wnt poprzez regulację poziomu ekspresji CTGF, wpływając na chorobę śródmiąższową nerek. Również Nrf2 regulował poziom transkrypcji CTGF głównie za pośrednictwem regulatora transkrypcji CTGF c-Fos [48]. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że ​​CTGF i pc-Fos ulegały ekspresji głównie w komórkach nabłonka kanalików nerkowych, a pc-Fos były również dystrybuowane w kłębuszkach nerkowych. Analiza ilościowa wykazała, że ​​poziom ekspresji obu białek był hamowany przez CF (Fig. 3b i e oraz 4a i c). Na koniec, analiza PCA została wykorzystana do dalszego sprawdzenia, czy CF poprawił uszkodzenie nerek u myszy SAMP8 (ryc. 6). Niniejsze badanie dostarczyło dowodów na to, że mukowiscydoza nie tylko aktywowała sygnalizację Nrf2, ale również polegała na Nrf2 w celu zrównoważenia stresu oksydacyjnego i zapalenia, hamowała sygnalizację Wnt/-katenina/RAS oraz poprawiała starzenie się nerek i włóknienie nerek. Jednak w tym eksperymencie stwierdziliśmy również niespójną poprawę wpływu CF na barwienie Massona i SA- -gal. Spekuluje się, że może to być spowodowane niespójnym postępem starzenia się nerek i zwłóknieniem nerek u myszy SAMP8. Stopień starzenia nerek u myszy w tym eksperymencie może być poważniejszy niż zwłóknienie. Dlatego łagodzący wpływ CF-H na starzenie się nerek u myszy SAMP8 nie był tak oczywisty jak w przypadku zwłóknienia nerek.

Jako monosacharyd redukujący, D-galaktoza jest szeroko stosowana w różnych chorobach związanych z wiekiem in vivo i in vitro. Stwierdzono, że D-gal powoduje starzenie się i uszkodzenie komórek NRK-52E [49], indukuje starzenie się ludzkich komórek nabłonka kanalika proksymalnego nerki (komórki HKC-8) i zwiększa poziom ekspresji dwóch nerkowych białka markerowe zwłóknienia FN i a-SMA [6]. W tym badaniu D-gal zastosowano do indukcji komórek NRK-52E in vitro. Stosując test MTT i barwienie -galaktozydazą do wykrywania związków izolowanych z CF, stwierdzono, że SDC-0-14,16 i SDC-1-8 zwiększają żywotność komórek indukowaną przez D-gal i hamują indukowaną D-gal starzenie się komórek (ryc. 5). Sugerowały one, że SDC-0-14,16 i SDC-1-8 mogą być istotną podstawą mukowiscydozy do opóźnienia starzenia się nerek. SDC-1-8 jest jednym z glikozydów fenyloetanoidowych. Stwierdzono, że glikozydy fenyloetanoidowe wydłużają żywotność Caenorhabditis Elegans [50], wykazując działanie przeciwstarzeniowe [51] i neuroprotekcyjne [52-54]. Stanowią one kierunek dla naszych dalszych badań nad farmakologicznymi skutkami mukowiscydozy.

Wnioski

Podsumowując, badania in vivo wykazały, że mukowiscydoza zmniejsza zwłóknienie nerek u starszych myszy. Niektóre potencjalne składniki aktywne zostały znalezione w eksperymentach in vitro. Odkrycia te zapewniły wsparcie farmakologiczne w leczeniu chorób nerek za pomocą mukowiscydozy i ukierunkowały dalsze badania nad aktywnymi składnikami mukowiscydozy.

Ten artykuł pochodzi z Cao et al. BMC Medycyna komplementarna i terapie (2022) 22:52