Indukcja wytrenowanej odporności obwodowej w trzustce pobudza aktywność przeciwnowotworową do kontrolowania progresji raka trzustki, część 2

Dyskusja

Podczas gdy przemyt β-glukanu został wcześniej scharakteryzowany, specyficzny tropizm β-glukanu do trzustki nie został wcześniej opisany37. Pokazujemy, że rozdrobniony glukan może przemieszczać się bezpośrednio do trzustki, a także może być fagocytowany przez makrofagi, które następnie przemieszczają się do trzustki. Zależność między jamą otrzewnej a trzustką nie została dobrze zdefiniowana, a badania dotyczące patofizjologii ostrego zapalenia trzustki (AP) wykazały, że makrofagi otrzewnowe są głównym czynnikiem przyczyniającym się do odpowiedzi zapalnej w AP, co potwierdza związek między otrzewną i trzustki38.

Nasze dane obrazowe rzeczywiście pokazują, że makrofagi otrzewnowe, które fagocytują WGP znakowane izotopem, przemieszczają się głównie do trzustki. Badania nad uszkodzeniem wątroby dodatkowo potwierdziły ten model dynamicznej wymiany komórek między jamą otrzewnej a narządami miąższowymi, która jest niezależna od krążenia 39. Razem sugeruje to, że nawet w warunkach homeostatycznych istnieje podstawowy poziom wymiany komórek odpornościowych między trzustką i jamy otrzewnej, które można wykorzystać w ustawieniu cząstek -glukanu.

Makrofagi są ważną częścią wrodzonego układu odpornościowego ludzkiego organizmu i pełnią potężne funkcje identyfikacji, fagocytowania i usuwania bakterii i obcych substancji. Zapalenie przyzębia, przewlekła choroba zakaźna charakteryzująca się zapaleniem dziąseł i utratą kości wyrostka zębodołowego, jest główną przyczyną utraty zębów u dorosłych. Obecnie jest jasne, że niszczenie tkanek w zapaleniu przyzębia jest spowodowane odpowiedzią immunologiczną gospodarza na infekcję, a makrofagi, jako ważny element odpowiedzi immunologicznej gospodarza, odgrywają ważną rolę w występowaniu i rozwoju stanu zapalnego.

Dlatego musimy poprawić odporność w naszym codziennym życiu. W naszych badaniach odkryliśmy, że Cistanche może wzmacniać odporność. Dodanie Cistanche do wrzącej wody w celu przygotowania herbaty Cistanche i picie jej 1-2 razy dziennie może wzmocnić funkcje odpornościowe organizmu, ponieważ zawiera aktywne składniki, takie jak polisacharydy, flawonoidy, alkaloidy itp., które mogą poprawić funkcja odpornościowa organizmu. Jednocześnie dodanie Cistanche do zupy lub owsianki raz lub dwa razy w tygodniu może wzmocnić odporność.

Kliknij, aby poznać czysty produkt cistanche

Podczas gdy w tym badaniu badano WGP glukanu w postaci cząstek stałych, interesujące może być również zbadanie, czy rozpuszczalny glukan pochodzący z drożdży wykazuje podobny mechanizm tropizmu i sygnalizacji w trzustce. Wiadomo, że rozdrobnione glukany przekazują sygnały bezpośrednio przez dektynę{4}}, podczas gdy uważa się, że rozpuszczalne glukany działają poprzez szlak zależny od CR{6}}, wywierając swoje właściwości przeciwnowotworowe40,41. Jedno z badań wykazało, że podawanie IP rozpuszczalnego glukanu powodowało przemieszczanie się do krwi obwodowej i APC w otrzewnej, śledzionie i szpiku kostnym, co wskazuje, że pomimo różnych mechanizmów sygnalizacji molekularnej, podobna zdolność do aktywacji wytrenowanej odporności może być możliwa42. Jednak biorąc pod uwagę, że nasze dane wskazują, że ten transport jest zależny od dektyny{12}}, tylko glukan w postaci cząstek może wykazywać bezpośredni transport do trzustki, zarówno w postaci cząstek stałych, jak i rozpuszczalny, co może inicjować mechanizmy wytrenowanej odporności.

Co więcej, wcześniejsze badania, które charakteryzowały przemyt rozpuszczalnego glukanu wstrzykniętego dożylnie, wykazują przemyt do śledziony, nerek i wątroby, chociaż nie wspominają o tropizmie do trzustki43. Ponieważ trzustka nie była wcześniej uważana za cel handlu -glukanem, nie jest jasne, czy trzustka po prostu nigdy nie była badana, czy też handel trzustką nie występuje.

Przyszłe badania powinny dotyczyć biodystrybucji zarówno rozpuszczalnego, jak i rozdrobnionego glukanu różnymi drogami podawania.

- Transport glukanu do trzustki ma wieloczynnikowy wpływ na populacje odpornościowe obecne w trzustce. Po pierwsze, przybycie glukanu do trzustki bezpośrednio wpływa na populacje immunosupresyjnych makrofagów M2 obecnych w trzustce, o których wiadomo, że są ważne w promowaniu guzów trzustki. Dane CyTOF i scRNA-Seq wykazały prawie całkowite zniknięcie rezydentnej populacji makrofagów 7 dni po podaniu WGP. Co ciekawe, zniknięcie rezydentnej populacji makrofagów zbiega się bezpośrednio z wzajemnym pojawieniem się populacji makrofagów Ly6Clo. Ta populacja makrofagów Ly6Clo ma podobne markery fenotypowe do populacji rezydentów, chociaż bardziej pochyla się w kierunku fenotypu M1.

Jest zatem prawdopodobne, że rezydentne makrofagi wchodzą w kontakt z β-glukanem, który przedostał się do trzustki, i komórki te ulegają repolaryzacji, przyjmując w ten sposób inny fenotyp komórkowy, co skutkuje utworzeniem unikalnego klastra. Po drugie, przybycie β-glukanu do trzustki skutkuje wzmocnioną sygnalizacją chemokin/receptorów chemokin, która rekrutuje prozapalne Ly6CHi naciekające makrofagi pochodzące z monocytów z obwodu do trzustki. Stwierdzono, że dwadzieścia cztery godziny po podaniu WGP poziom CCL2 w lizatach całej trzustki wzrasta 30-krotnie. W związku z tym pokazujemy, że silny napływ komórkowy zależny od glukanu do trzustki zależy od CCR2.

Podczas gdy skupiamy się na dynamice przedziału mieloidalnego ze względu na obserwowane znaczenie sygnalizacji CCR2 / CCL2, nastąpiło interesujące początkowe wzmocnienie klastra 11 w dniu 3, a następnie zniknięcie do dnia 7 po leczeniu WGP. Klaster 11 scharakteryzowano jako ILC2 w oparciu o ekspresję kilku markerów, takich jak KLRG1, IL{8}}, IL-13 i ICOS. Wiadomo, że ILC2 są komórkami długotrwale rezydującymi w tkankach44. Ostatnie badania wykazały, że aktywacja lokalnych ILC2 przez specyficzne tkankowo alarmyny indukuje ich proliferację, migrację węzłów chłonnych i rozsiew krwi. Wykazano, że ILC2 z kilku tkanek, takich jak jelita i płuca, dostają się do krwi przez wyciskanie z tych zaburzonych tkanek i migrują do innych tkanek, takich jak wątroba44-46.

Taki mechanizm mógłby wyjaśnić początkowy wzrost, a następnie zanik ILC2 w trzustce. Biorąc pod uwagę, że ILC2 były ostatnio zaangażowane w odpowiedź guzów trzustki na immunoterapię47, uzasadnione są dalsze badania, które badają wpływ WGP i inicjację wyszkolonej odporności na populację ILC2 trzustki.

Chociaż zainicjowanie napływu prozapalnych komórek odpornościowych do trzustki jest samo w sobie ważne, to CCR2 plus Ly6CHi infiltrujące populacje makrofagów pochodzących z monocytów z peryferii wykazują cechy wyszkolonej odporności, która niesie najważniejsze implikacje jako indukcja obwodowa odporność trzustki nie została jeszcze scharakteryzowana. Ta indukowana wytrenowana odporność jest również związana z przeprogramowaniem metabolicznym i epigenetycznym.

Chociaż wiadomo, że CCR2 jest ważnym receptorem w rekrutacji monocytów, jest to również pierwsza wskazówka, że ​​sygnalizacja CCR2 na monocytach jest niezbędna do ustanowienia odporności wytrenowanej obwodowo. Należy zauważyć, że CCR2 plus monocyty/makrofagi zostały powiązane z przerzutami i progresją nowotworu48,49. Jednak nasze dane sugerują, że rekrutacja przeprogramowanego, wyszkolonego CCR2 plus monocytów / makrofagów wywiera silne działanie przeciwnowotworowe.

Zostało to bezpośrednio wykazane w naszym eksperymencie z mieszanką, w którym myszy, które otrzymały komórki szpikowe CCR2 plus od myszy trenowanych WGP, wykazywały znacząco zmniejszone obciążenie nowotworem w porównaniu z myszami, które otrzymały komórki szpikowe CCR2- od tej samej tresowanej myszy.

Ponieważ wykazaliśmy, że w trzustce została wykształcona odporność obwodowa, pytamy, czy komórki te mogą zostać reaktywowane przez komórki nowotworowe lub ich wydzielane czynniki. Wykazano, że ponowna ekspozycja in vivo wyszkolonych WGP komórek szpikowych trzustki na pożywkę kondycjonowaną przez nowotwór energicznie wywołuje wytrenowaną odpowiedź. Kalafati i in. niedawno wykazali rolę granulocytów w wyszkolonych mechanizmach przeciwnowotworowych opartych na odporności21, jednak biorąc pod uwagę ich zastosowanie podskórnych modeli raka, obecnie zgłaszane badanie jest pierwszym przypadkiem sugerującym, że komórki szpikowe w określonym narządzie można wyszkolić, aby reagowały bezpośrednio na komórki nowotworowe tego samego narządu.

Dobrze ustalono, że komórki szpikowe są zdolne do bezpośredniego zabijania komórek nowotworowych poprzez mechanizmy fagocytozy i produkcji ROS50-54, a tutaj pokazujemy, że trening WGP znacząco zwiększa bezpośrednie funkcje przeciwnowotworowe zwiększonej fagocytozy komórek nowotworowych i cytotoksyczność za pośrednictwem ROS do komórki nowotworowe.

Ponadto, chociaż podkreślamy, że pożywki kondycjonowane przez nowotwór mogą reaktywować wyszkolone komórki szpikowe, identyfikujemy również specyficzny czynnik, MIF, w pożywkach kondycjonowanych przez nowotwór, który bierze udział w tej aktywacji. Dane te sugerują, że indukcja wytrenowanej odporności może uczestniczyć w mechanizmach nadzoru immunologicznego guza. Na przykład, we wczesnych stadiach rozwoju nowotworu, nowotwory wydzielają rozpuszczalne czynniki, które mogą ponownie stymulować wyszkolone komórki wrodzone, co prowadzi do wyeliminowania tych komórek nowotworowych.

Następnie tłumaczymy to zrozumienie potencjału przeciwnowotworowego wyszkolonych wrodzonych komórek szpikowych, które dostają się do trzustki, na ortotopowe modele PDAC, gdzie obserwujemy dramatyczny spadek obciążenia nowotworem i wzrost przeżywalności myszy, którym podano tylko jedno podanie WGP. Ponadto wykazujemy, że komórki odpowiedzialne za kontrolę nowotworu to głównie wyszkolone komórki CCR2 plus komórki pochodzące ze szpiku. W przeciwieństwie do innych proponowanych modeli kontroli nowotworu, które wydają się być całkowicie napędzane przez indukcję centralnie trenowanej odporności w BM21, zamiast tego w tym modelu wczesny transport WGP do trzustki i wynikająca z tego produkcja CCL2 w trzustce rekrutuje rekrutów CCR2 plus komórki szpikowe z obwodu, które są głównie odpowiedzialne za działanie przeciwnowotworowe. WGP przekierowując bezpośrednio do trzustki również repolaryzuje makrofagi M{7}} rezydujące w tkankach w kierunku makrofagów podobnych do M1-, które również mogą hamować postęp nowotworu.

Podczas gdy redukcja guza obserwowana u myszy, którym wszczepiono guzy KPC, które zostały zmieszane z wyszkolonymi komórkami CCR2 plus, była znacząca, nie była tak uderzająca jak u myszy, którym podano IP WGP. Potwierdza to, że działanie przeciwnowotworowe IP WGP jest dwojakie; rekrutacja CCR2 plus wytrenowanych przeciwnowotworowych komórek szpikowych do trzustki i repolaryzacja rezydujących makrofagów pronowotworowych działają wspólnie, aby wywołać wrodzone odpowiedzi przeciwnowotworowe, które prowadzą do zmniejszenia obciążenia nowotworem w modelach PDAC.

Zauważamy również wysoką ekspresję MHCII na tych wyszkolonych monocytach / makrofagach, która prawdopodobnie odgrywa rolę w przetwarzaniu antygenu nowotworowego i komunikacji z komórkami T w celu wywołania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko nowotworowi. Co ciekawe, chociaż potwierdziliśmy, że te mechanizmy przeciwnowotworowe nie zależą od adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, zaobserwowaliśmy znaczny wzrost liczby limfocytów T CD8 plus obecnych w nowotworach CCR2 plus z domieszką. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że zaobserwowano, że komórki szpikowe w guzach wykazują wysoki poziom PD-L1 i że obecność wyszkolonych komórek CCR2 plus w trzustce wydawała się rekrutować limfocyty T CD8 plus, uznaliśmy, że WGP może nasilać działanie anty -terapia PD-L1.

Zgodnie z literaturą sama terapia mAb anty-PD-L1 nie przyniosła korzyści w zakresie przeżycia, podczas gdy połączenie WGP i anty-PD-L1 działało synergistycznie, dając lepsze wyniki przeżycia niż sam WGP55. Sugeruje to, że wyszkolone wrodzone komórki odpornościowe mogą aktywować nabyte komórki odpornościowe w TME, jednak mikrośrodowisko immunosupresyjne prawdopodobnie wymaga dalszego przezwyciężenia przez jednoczesne działanie anty-PD-L1. Co ważne, pomimo poprawy przeżywalności wszystkie myszy w końcu uległy nowotworowi, więc dalsze badania nad optymalizacją tego leczenia pod względem dawkowania i liczby zabiegów są uzasadnione.

Immunosupresyjne komórki szpikowe odgrywają kluczową rolę w tworzeniu immunosupresyjnego TME w PDAC. Tutaj wykazujemy zdolność do angażowania tych komórek szpikowych w ustawianie PDAC poprzez indukcję wyszkolonej wrodzonej odporności w trzustce.

Co ważne, wykazaliśmy również, że zdolność do inicjowania wytrenowanej odporności w trzustce nasila terapeutyczne efekty immunoterapii, takiej jak terapia immunoblokadami punktów kontrolnych anty-PD-L1. Nadając dalsze zastosowanie kliniczne tym odkryciom, wykazujemy również, że indukcja wyszkolonej odporności w warunkach adiuwantowych może zmniejszyć rozmiar guza i przedłużyć przeżycie. Odkrycia te podkreślają potencjał zastosowania β-glukanu do terapeutycznego celowania w komórki szpikowe w obrębie TME i podkreślają, że indukcja obwodowej wytrenowanej odporności w trzustce może odgrywać istotną rolę w przeprogramowaniu supresyjnego TME PDAC, co może skutkować przedłużeniem życia pacjentów zdiagnozowano tę śmiertelną chorobę.

Metody

Oświadczenie etyczne.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Komitet Instytucjonalnej Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu w Louisville. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi protokołami 19471 i 19536.

myszy.

We wszystkich eksperymentach stosowano samce i samice myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Myszy C57BL / 6 J typu dzikiego (WT) zakupiono w Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) lub wyhodowano w ośrodku dla zwierząt wolnym od specyficznych patogenów (SPF) Uniwersytetu w Louisville. Myszy C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin-1−/−) opisano wcześniej56. Myszy CCR2 z globalnym nokautem zakupiono z Jackson Laboratory. Myszy Albino C57BL/6 zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr Jonathana Warawy z University of Louisville. Myszy NOD/SCID/IL2r Null (NSG) zakupiono w Jackson Laboratory. Maksymalny rozmiar guza dopuszczony przez IUCAC wynosił nie więcej niż 2000 mm3. Myszy monitorowano codziennie pod kątem wzrostu guza i uśmiercano, gdy ciężar guza przekraczał ograniczoną wielkość. Myszy utrzymywano w 12-h cyklu ciemności/światła w temperaturze pokojowej z kontrolowaną wilgotnością (około 55 procent).

Wszystkie zwierzęta trzymano w obiekcie z barierą i do eksperymentów wykorzystywano tylko zdrowe myszy. Wszystkie myszy miały po nas co najmniej 6 tygodni, a wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi dostarczonymi przez Ośrodek Hodowli Gryzoni (RRF) i zatwierdzonymi przez Komitet Instytucjonalnej Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) z Uniwersytetu w Louisville.

Przygotowanie -glukanu.

Wysoko oczyszczony rozdrobniony glukan w postaci rozdrobnionych całych cząstek glukanu (WGP) wyizolowanych z Saccharomyces cerevisiae dostarczyła firma Biothera. Przed użyciem WGP delikatnie sonikowano przez 15 s, dwa razy, stosując Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer), aby upewnić się, że agregaty zostały rozbite.

Przygotowanie i wykorzystanie DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) w stężeniu 2 mg/ml zmieszano z zawiesiną 20 mg/ml WGP w buforze boranowym (pH 10,8). Całość inkubowano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin z ciągłym mieszaniem. Po inkubacji WGP odwirowano i przemyto pięć razy zimnym sterylnym DPBS wolnym od endotoksyn (Sigma-Aldrich) lub do momentu, gdy supernatant nie zawierał już widocznego DTAF. Stężenie doprowadzono do 10 mg/ml w wolnym od endotoksyn DPBS do przechowywania. Około 1 mg DTAF-WGP wstrzyknięto IP myszom C57BL/6 i Dectin-1}-/− i narządy zebrano 3 dni później.

Przygotowanie 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) zmieszano z DeferoxamineSCN (2,7 mg, w 0,8 ml DMSO) i zawieszono w 10 ml buforu węglanu sodu (0,1 M, pH 9,4) przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności delikatnie wstrząsając. Następnie WGP znakowany deferoksaminą przemyto wodą dejonizowaną (10 × 40 ml) i 30 mg WGP znakowanego deferoksaminą zmieszano z 3 mCi szczawianu 89Zr w 2 ml buforu Tris•HCl (0,5 M, pH 7,5) i następnie inkubowano w temperaturze 37 oC przez 60 min z wytrząsaniem. Następnie 89Zr-WGP odwirowano i przemyto 3 ml sterylnego PBS. Radioaktywność 89Zr-WGP mierzono kalibratorem dawki i stosowano w badaniach in vitro i in vivo.

Biodystrybucja i skan PET/CT przy użyciu 89Zr-WGP.

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) / tomografii komputerowej (CT) przeprowadzono u myszy C57BL / 6 i Dectin -1 -/- 48 godzin po wstrzyknięciu IP 1 mg czystego 89Zr-WGP lub wstrzyknięciu 1 × 106 otrzewnej makrofagi, które hodowano wspólnie z 25 ug/ml 89Zr-WGP przez 2 godziny, a następnie delikatnie przemyto w celu usunięcia nadmiaru 89Zr-WGP. Myszy skanowano przez 15 minut za pomocą Siemens R4 MicroPET, a następnie przez 10 minut tomografii komputerowej. Do akwizycji i rekonstrukcji sygnału PET wykorzystano oprogramowanie Siemens IAW, a do łączenia i analizy danych obrazowych wykorzystano oprogramowanie Siemens IRW.

Pod koniec badania obrazowego myszy uśmiercono i pobrano narządy będące przedmiotem zainteresowania. W celu biodystrybucji pobrano 50 ul krwi obwodowej stosując technikę krwawienia pozagałkowego. Mózg, serce, płuca, wątrobę, śledzionę, nerki, trzustkę, jelito grube, jelito cienkie, żołądek, kość udową, kawałek skóry z boku myszy i mięsień prosty uda pobrano, zważono i umieszczono w Automatyczny licznik gamma 2470 Wizard (PerkinElmer) do pomiaru radioaktywności każdej tkanki. Wartości CPM obliczono stosując oprogramowanie Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Przetwarzanie trzustki.

Po eutanazji pobrano trzustkę myszy i delikatnie pocięto na mniejsze kawałki za pomocą sterylnych nożyczek. Zawieszono je w 15 ml probówce w kompletnej pożywce (RPMI) z 1X buforem do trawienia składającym się z 300 U/ml kolagenazy I, 60 U/ml hialuronidazy i 80 U/ml DNazy (Sigma). Umieszczono je w obracającym się inkubatorze w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 na 15–20 minut. Bufor trawiący następnie zgaszono lodowatym kompletnym RPMI 1640 i przemyto. Komórki przepuszczono przez sterylny nylonowy filtr koszykowy 40 µm i małe niestrawione fragmenty tkanki rozbito sterylnym korkiem strzykawki w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczych komórek. Jeśli w próbce stwierdzono obecność znacznej liczby krwinek czerwonych (RBC), przeprowadzano lizę RBC przez dodanie 2 ml sterylnego 10x ACK (Thermo Fisher Scientific).

Administracja WGP in vivo.

Myszom podano pojedynczą dawkę 1 mg dootrzewnowo delikatnie sonikowanego WGP, kulki polistyrenowe 3 μm (Sigma-Aldrich) lub mikrosfery fluorescencyjne 3 μm (Polysciences) (wszystkie 1 mg w 200 ul sterylnego PBS) lub 200 ul sterylnego PBS w dniu 0. W typowych badaniach odporności, 7 dni po początkowej dawce IP, myszy uśmiercono przy użyciu CO2, a trzustkę wraz z innymi tkankami będącymi przedmiotem zainteresowania usunięto i poddano obróbce. W badaniach miareczkowania dawki 0,5, 1 i 2 mg WGP podawano IP w 200 ul sterylnego PBS. Do badań miareczkowania w czasie myszom wstrzyknięto 1 mg WGP, a trzustkę zebrano po 24 godzinach, 48 godzinach, 3, 7, 10, 16 i 30 dniach później.

Restymulacja ex vivo.

Aby ocenić wyszkolony fenotyp komórek jednojądrzastych u myszy traktowanych WGP lub PBS ex vivo, po obróbce trzustki, zawiesiny komórek trzustkowych wysiano na 24-studzienkowe płytki i stymulowano LPS (10 ng/ml), supernatantem z hodowli KPC i Pan02 komórki (40 procent) i rekombinowany MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF był hojnym darem od dr Roberta Mitchella z University of Louisville i był prokariotycznym sprzymierzeńcem wyrażanym, oczyszczanym i ponownie fałdowanym, jak opisano wcześniej57. Komórki hodowano w DMEM i inkubowano w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 przez 5–6 godzin w obecności 1X brefeldyny A (BioLegend). Komórki następnie zebrano za pomocą skrobaczki do komórek, przemyto, osadzono, a następnie wybarwiono pod kątem wewnątrzkomórkowej ekspresji cytokin.

Test treningu i ponownej stymulacji in vitro.

Makrofagi otrzewnowe lub posortowane komórki CD11b plus z trzustki myszy umieszczono w studzienkowej płytce na 2 godziny w temperaturze 37 stopni i 5% CO2, aby umożliwić przyczepienie się komórek do płytek, po czym pływające komórki delikatnie przydechowy. Przyłączone komórki delikatnie przemyto sterylnym PBS, a następnie ponownie zawieszono w 1 ml DMEM składającego się z 10 procent FBS i 1 procent penicyliny/streptomycyny.

W celu wstępnego treningu komórek do odpowiedniego dołka dodano 25 μg/ml rozdrobnionego WGP, 25 μg/ml 3 μm mikrocząstek polistyrenu (Sigma-Aldrich) lub 100 μl PBS i inkubowano przez 24 godziny. Po 24 godzinach studzienki delikatnie przemyto w celu usunięcia początkowego bodźca i dodano świeży DMEM i komórki inkubowano z 5% CO2 w 37 stopniach przez 7 dni. Po 7 dniach pożywkę odessano i zastąpiono świeżą pożywką, a komórki ponownie stymulowano LPS (100 ng/ml), supernatantem komórek KPC lub Pan02 (40 procent) lub PBS jako kontrolą. Dwadzieścia cztery godziny po stymulacji supernatanty zebrano i użyto w teście ELISA dla TNF- i IL-6.

Pożywki kondycjonowane przez nowotwór.

Około 1 x 106 komórek KPC lub Pan02 hodowano w sześciostudzienkowej płytce w 4 ml kompletnego DMEM w 37 stopniach i 5% CO2. Po 3 dniach supernatanty zebrano i przechowywano w -80 stopniach w porcjach do stosowania jako pożywka kondycjonowana przez nowotwór. Jako kontrolę, trzustkę myszy C57BL/6 przetworzono w zawiesinę pojedynczych komórek i 1 x 106 tych komórek hodowano w sześciostudzienkowej płytce w 4 ml kompletnego DMEM i w 37 stopniach i 5% CO2, i supernatanty również zebrano po 3 dniach. Jako kontrolę, trzustkę myszy naiwnych przetwarzano w zawiesinę pojedynczych komórek i umieszczano w sześciostudzienkowej płytce na 1 dzień. Komórki nieadherentne wypłukano, a następnie komórki te hodowano przez 3 dni i zebrano supernatant.

Akwizycja makrofagów otrzewnowych.

Myszy uśmiercono i 5 ml sterylnego RPMI wstrzyknięto do otrzewnej za pomocą strzykawki 25-. Brzuch masowano w celu uwolnienia makrofagów otrzewnowych. Wykonano małe nacięcie i zastosowano pipetę do przenoszenia w celu usunięcia zawiesiny. Następnie jamę otrzewnej przemyto kilka razy zimnym RPMI i komórki osadzono przy 458 x g.

Cytometrii przepływowej.

Zawiesiny pojedynczych komórek w PBS z 1 procentem FBS blokowano mysim blokiem Fc (anty-CD16/CD32) w 4 stopniach przez 15 minut. Znakowane fluorochromem przeciwciała dla żywotności (APC/Cy7) i dla markerów powierzchniowych CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) i CCR2 (R&D Systems) zostały używany. Informacje dotyczące wszystkich przepływów Ab podsumowano w tabeli uzupełniającej 3. Po 30 minutach inkubacji w ciemności w 4 stopniach, komórki przemyto zimnym PBS i przesączono przez filtr o oczkach 40 µm. Próbki pobrano za pomocą cytometru FACSCanto II (BD Biosciences) i przeanalizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Oprogramowanie FACSDiva w wersji 6 zostało użyte w FACSCanto do pozyskania wszystkich danych.

barwienie wewnątrzkomórkowe pod kątem ekspresji cytokin.

Po stymulacji komórki barwiono pod kątem pożądanych markerów powierzchniowych, jak opisano powyżej. Następnie komórki przemyto zimnym PBS i do probówek dodano 500 ul buforu utrwalającego (Biolegend), krótko worteksowano i inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min. Następnie dodano około 1 ml buforu do permeabilizacji (Biolegend) i próbki wirowano przy 458 x g przez 5 minut w 4 stopniach, a następnie jeszcze raz przemyto przy użyciu 1 ml buforu do permeabilizacji. Komórki ponownie zawieszono w 200 ul buforu permeabilizującego i komórki barwiono przeciwciałami przeciwko TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL{12}} i IFN lub odpowiednim izotypem kontrolnym przez noc w temperaturze 4°C. Następnie komórki przemyto, przesączono i zebrano dane za pomocą cytometru przepływowego.

Izolacja FACS CD11b plus makrofagów do treningu in vitro.

Trzustkę przetworzono w zawiesinę pojedynczych komórek, jak opisano powyżej. Komórki przemyto 1 ml PBS i inkubowano z blokiem Fc przez 10 minut w 4 stopniach, a następnie barwiono barwnikiem żywotności (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) i CD11b plus (APC) przez 30 minut w 4 stopniach. Komórki przemyto PBS i ponownie zawieszono w zimnym buforze MACS Running Buffer (Miltenyi Biotech). Żywotność Komórki CD45 plus CD11b plus sortowano stosując FACS Aria III (BD Biosciences). Komórki zebrano w 50 procentach FBS, 40 procentach PBS i 10 procentach HEPES (Corning). Po sortowaniu komórki przemyto PBS, a następnie wysiano do treningu in vitro, jak opisano powyżej.

ELIZA.

Supernatanty z komórek trenowanych in vitro wraz ze standardami analizowano przy użyciu zestawów ELISA dla mysiego TNF i IL-6 (BioLegend). Test przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta i wszystkie warunki przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Zastosowano również zestaw ELISA dla rMIF (systemy R i D) zgodnie z instrukcjami producenta do ilościowego oznaczenia rMIF w pożywkach kondycjonowanych przez nowotwór Pan02 i KPC oraz supernatancie z hodowanych nietraktowanych komórek trzustki. Aby określić ilościowo modyfikacje histonów, zakupiono zestawy ELISA (zestaw do oznaczania ilościowego tri-metylohistonu H3K4, zestaw do oznaczania ilościowego acetylo-histonu H3K27, zestaw do oznaczania ilościowego tri-metylohistonu H3K27 i zestaw do oznaczania ilościowego całkowitego histonu H3) od EpiGentek i przeprowadzono testy na podstawie danych producenta instrukcje. Mleczan mierzono za pomocą testu L-Lactate Kit I (Eton Bioscience).

Analiza Western blot.

Komórki CD11b plus z myszy, którym wstrzyknięto PBS lub wstrzyknięto WGP (24 godziny) rozdzielono przy użyciu mikrokulek CD11b (Miltenyi Biotech). Histon ekstrahowano zgodnie z instrukcją producenta (Active Motif, Inc.), a stężenie białka określono stosując oznaczenie ilościowe Bradforda. Białka histonowe rozdzielono za pomocą SDS-PAGE 15% żeli Tris-HCl i przeniesiono na membrany PVDF (Millipore). Membranę blokowano 5% BSA w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i inkubowano przez noc w 4 stopniach z pierwszorzędowymi przeciwciałami, w tym króliczym mAb tri-metylo-histonu H3 (lys4), acetylo-histonem H3 (lys27) XP mAb królika, tri-metylem -histon H3 (Lys27) królicze mAb i histon H3 XP królicze mAb (Cell Signaling Technology), następnie inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z HRP (GE Healthcare) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Membranę wywołano przy użyciu odczynnika Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) i wykryto za pomocą Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Prestained Protein Standards Precision Plus Protein Kaleidoscope zastosowano jako standardowy marker białkowy (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Po wyizolowaniu komórek CD11b plus z trzustki myszy u myszy traktowanych i nietraktowanych WGP, komórki przechowywano w TRIzolu. RNA wyizolowano i poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu amplifikacji odczynników do odwrotnej transkrypcji TaqMan (qRTPCR) przy użyciu jednokolorowego systemu wykrywania RT-PCR Bio-Rad MyiQ. Pokrótce, cDNA amplifikowano w 25 ul mieszaniny reakcyjnej składającej się z supermiksu SYBR Green PCR (Bio-Rad), 100 ng komplementarnej matrycy DNA i wybranych starterów (200 nM) stosując zalecane warunki cykli.

H plus E.

Siedem dni po wstrzyknięciu kulek PBS/mikrocząstek lub WGP trzustki zebrano i utrwalono w 4% formalinie na 1 tydzień, a następnie zatopiono w parafinie zgodnie ze standardowymi procedurami. Tkanki zatopione w parafinie pocięto na skrawki o grubości 5 mm i wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H & E) do analizy morfologicznej.

Pomiar amylazy w surowicy.

Amylazę surowicy mysiej mierzono przy użyciu zestawu Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) i stosowano zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, myszom wstrzyknięto WGP i 7 dni później pobrano krew od myszy stosując technikę krwawienia pozagałkowego. Próbki te zastosowano do oznaczenia amylazy w surowicy.

Wyczerpanie komórek T in vivo.

Komórki T zostały zubożone przy użyciu samego mAb anty-CD4, samego mAb anty-CD8 lub razem mAb anty-CD4 i anty-CD8. Przeciwciała zostały wykonane na miejscu. W tej procedurze wyczerpywania, myszom wstrzyknięto IP z WGP w dniu 1 i wstrzyknięto im również IP z 200 ug mAb w dniu 1 i dniu 4 podczas okresu leczenia. Myszy uśmiercono w dniu 7. (CD4 klon GK1.5, CD8 klon 53-6.72). Skuteczność wyczerpywania została potwierdzona w dniu 7.

Wyczerpywanie komórek NK in vivo.

Komórki NK zostały zubożone przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 µg mAb PK136 (wyprodukowane w laboratorium dr Jun Yana na Uniwersytecie w Louisville) w dniach -1 i 5 w okresie leczenia. WGP wstrzykiwano w dniu 0 iw dniu 7 zwierzęta uśmiercano i oceniano skuteczność usuwania komórek NK przez barwienie tkanek trzustki pod kątem NK1.1.

Wyczerpanie Ly6G.

Neutrofile usunięto przez wstrzyknięcie 300 µg mAb anty-Ly6G (Bio X Cell) lub kontroli izotypowej Rat IgG2a (Bio X Cell) w dniach -1, 2 i 6 podczas leczenia. Około 1 mg WGP wstrzyknięto IP w dniu 1. Myszy uśmiercono w dniu 7 i trzustkę oceniono pod kątem skuteczności wyczerpania. W guzie modelowym myszom wstrzyknięto 300 µg anty-Ly6G mAb lub kontrolnej izotypowej szczurzej IgG2a w dniach -2, 4, 10 i 16. Myszom podano WGP w dniu 0 i wszczepiono im ortotopowe guzy trzustki KPC w dniu 7. Myszy uśmiercano w dniu 21 i tkanki trzustki barwiono Ly6G w celu oceny skuteczności usuwania granulocytów w tym czasie.

Przygotowanie próbki do cytometrii masowej CyTOF.

Przeciwciała do cytometrii masowej zakupiono od Fluidigm lub wytworzono we własnym zakresie przez koniugację dostępnych w handlu oczyszczonych przeciwciał z odpowiednim izotopem metalu przy użyciu zestawów MaxPar X8 Polymer lub MCP9 Polymer (Fluidigm). Próbki trzustki od trzech myszy PBS i trzech 7-dniowych myszy WGP przetworzono na roztwór jednokomórkowy i przeprowadzono stymulację ex vivo, jak opisano powyżej. Komórki delikatnie zeskrobano z płytek za pomocą sterylnej skrobaczki do komórek, przemyto PBS i umieszczono w sterylnej probówce do hodowli. Zastosowano około 2 x 106 komórek na próbkę. Komórki najpierw barwiono pod kątem żywotności 5 uM cisplatyny (Fluidigm) w wolnym od surowicy RPMI 1640 przez 5 min w temperaturze pokojowej. Komórki następnie przemyto RPMI 1640 zawierającym 10 procent FBS przez 5 minut przy 300 x g. Komórki barwiono przeciwciałami powierzchniowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemywano dwukrotnie buforem barwiącym Maxpar Cell (Fluidigm).

W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych komórki następnie utrwalano 1 ml buforu 1X Maxpar Fix I przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemywano dwukrotnie 2 ml buforu 1X Maxpar Perm-S przez 5 minut przy 800 x g. Następnie dodawano koktajl cytoplazmatyczny/wydzielane przeciwciała i inkubowano z komórkami przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji komórki przemyto 1 ml buforu 1X Maxpar Perm-S przez 5 minut przy 800 x g i delikatnie osuszono, aby usunąć cały płyn z probówki.

Aby wybarwić antygeny jądrowe, komórki następnie zawieszono w 1 ml 1X buforu barwiącego antygen jądrowy Maxpar na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodano koktajl przeciwciał z antygenem jądrowym i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto dwukrotnie przez 5 minut przy 800 x g 2 ml buforu przepuszczalności barwiącego antygen jądrowy. Na koniec komórki utrwalano 1,6% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 125 nM IntercalatorIridium (Fluidigm) w temperaturze 4°C.

Akwizycja danych CyTOF.

Gdy komórki były gotowe do akwizycji, próbki przemyto dwukrotnie buforem do barwienia komórek (Fluidigm) i trzymano na lodzie w oczekiwaniu na akwizycję. Bezpośrednio przed akwizycją komórki zawieszono w 1:9 roztworze Cell Acquisition Solution: EQ 4 elementowe kulki kalibracyjne (Fluidigm). Zastosowano system Helios CyTOF i zgodnie z odpowiednimi procedurami uruchamiania i dostrajania próbki analizowano z szybkością mniejszą lub równą 500 zdarzeń na sekundę do 300 000 zdarzeń. Za pomocą oprogramowania CyTOF znormalizowano pliki FCS. Pliki FCS i pliki te były następnie gotowe do analizy danych.

Analiza danych CyTOF.

Dane CyTOF zostały przeanalizowane przy użyciu FlowJo, pakietu oprogramowania CytoBank58 oraz CyTOF workflow59, który zawiera pakiet pakietów dostępnych w R (r-project. org)60-63. Do analizy przeprowadzonej w ramach CyTOF wykorzystano pliki obszaru roboczego FlowJo wyeksportowane z Flow Workspace i CytoML61.

Sekwencjonowanie RNA: ekstrakcja i izolacja RNA.

Siedem dni po podaniu PBS lub WGP IP, zebrano trzustki, przetworzono w zawiesinę pojedynczych komórek, wybarwiono pod kątem żywotności, CD45 i CD11b i posortowano przy użyciu FACS Aria III. Próbki przygotowano w trzech powtórzeniach dla każdej grupy doświadczalnej. Po wyizolowaniu tych komórek szpiku, komórki przemyto 2x lodowatym PBS, a następnie poddano lizie Trizolem (Invitrogen). RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

Wyizolowany RNA sprawdzono pod kątem integralności przy użyciu systemu Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i oznaczono ilościowo przy użyciu testu fluorometrycznego Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Biblioteki mRNA-Seq wzbogacone w poli-A przygotowano zgodnie ze standardowym protokołem zestawu Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) przy użyciu 10 ng całkowitego RNA.

Wszystkie próbki zligowano adapterami Illumina i indywidualnie oznaczono kodem kreskowym. Brak dimerów adaptorowych i spójny rozmiar biblioteki ~300 bp potwierdzono przy użyciu Agilent Bioanalyzer 2100. Stężenie biblioteki i zachowanie podczas sekwencjonowania oceniono na podstawie standaryzowanego dodatku PhIX przy użyciu komórki przepływowej do sekwencjonowania Nano MiSeq firmy Illumina. 1,8 µm połączonych bibliotek z 1 procentowym dodatkiem PhiX załadowano do jednej komórki przepływowej do sekwencjonowania zestawu High Output Kit v2 w jednym cyklu NextSeq 500/{8}} i zsekwencjonowano na sekwencerze Illumina NextSeq 500, celując w 60 M odczytów 1x75 bp na próbkę.

sekwencjonowanie RNA.

Biblioteki przygotowano przy użyciu zestawu Universal Plus mRNA-seq z kwantyfikacją biblioteki NuQuant® (NuGen). Sześć próbek rozprowadzono na czterech liniach sekwencjonowania w jednej serii. 24 pojedyncze pliki surowego sekwencjonowania (.fastq)64 pobrano z BaseSpace65 firmy Illumina na serwer KBRIN w celu analizy. Kontrolę jakości (QC) surowych danych sekwencji przeprowadzono przy użyciu FastQC (wersja 0.10.1)66. Sekwencje dopasowano do referencyjnego genomu myszy mm10 przy użyciu STAR (wersja 2.6)67, generując pliki dopasowania w formacie bam. Różnicową ekspresję transkryptów kodujących białka ENSEMBL przeprowadzono stosując DESeq268,69. Surowe zliczenia uzyskano z plików w formacie bam wyrównanych do STAR przy użyciu HTSeq (wersja 0.10.0)70. Surowe zliczenia znormalizowano przy użyciu metody Relative Log Expression (RLE), a następnie przefiltrowano w celu wykluczenia genów z mniej niż dziesięcioma zliczeniami w próbkach71. Dane seq RNA zdeponowano z GEO o numerze GSE187464.

Sekwencjonowanie RNA: analiza wzbogacania zestawu genów.

Analiza wzbogacania zestawu genów (GSEA) została wykorzystana do dalszego scharakteryzowania biologii genów obejmujących warunki WGP vs PBS i ich różnice72. Zestawy genów uzyskano z bazy danych sygnatur molekularnych (MSigDB) dla procesów biologicznych ontologii genów (GO) i ścieżek Reactome. Dla każdego zestawu genów wszystkie badane lokalizacje genów w porównaniu myszy kontrolnych traktowanych WGP i PBS zostały posortowane od najwyższej do najniższej istotności przy użyciu wartości p. Takie podejście pozwala na włączenie bardzo znaczących genów regulowanych w górę iw dół do każdego zestawu genów, podejście, które dokładniej odzwierciedla warunki w ścieżce biologicznej. W tej analizie po tabeli wzbogaconych zestawów następuje wykres wzbogacenia przedstawiający profil wyniku wzbogacenia (ES) i pozycję członków zestawu genów na liście uporządkowanej według rangi.

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek: izolacja pojedynczych komórek i sekwencjonowanie RNA.

Żywe komórki CD45 plus posortowano z trzustki myszy, przemyto i ponownie zawieszono w 1x PBS (bez wapnia i magnezu) zawierającym 0,04 procent BSA. Wychwytywano pojedyncze komórki i konstruowano biblioteki cDNA z kodem kreskowym przy użyciu zestawu odczynników Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ (v3.1, 10X Genomics) i kontrolera Chromium, zgodnie z instrukcjami producenta. Biblioteki połączono i zsekwencjonowano przy użyciu konfiguracji 28 pz × 8 pz × 125 pz dla odczytu 1 × i7 indeks x odczyt 2 na Illumina NextSeq 500 z zestawem High Output Kit v2.5 (20024907) NextSeq 500/{18}}.

Od sekwencjonowania komórek: profilowanie ekspresji genów.

Pliki Bcl demultipleksowano do plików fastq przy użyciu oprogramowania CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Całkowita liczba zsekwencjonowanych odczytów wyniosła 506 913 062. Odczyty były dobrej jakości, jak określono w FastQC66. Liczby genów mierzono przy użyciu CellRanger „count”, wykorzystując genom referencyjny cell ranger-mm{9}}.0.0 dla myszy. Dla każdej próbki wygenerowano macierz zliczeń i jedną zagregowaną próbkę z oczekiwaną liczbą komórek ustawioną na 5000.

Surowe dane liczbowe określone przez CellRanger zostały wykorzystane jako dane wejściowe do niestandardowego potoku analizy w R, który wykorzystuje różne narzędzia do analizy pojedynczych komórek oparte na Seurat. Wykres kolana (rysunek uzupełniający 7b) przedstawia wykres przedstawiający rankingowe liczby UMI dla każdego kodu kreskowego komórki dla danych zagregowanych w trzech grupach. Komórki powyżej punktu przegięcia reprezentują możliwe dublety, podczas gdy komórki poniżej kolana reprezentują komórki tła. Miary kontroli jakości komórek analizowano przy użyciu Seurat v373, a kody kreskowe komórek o następujących cechach usunięto z analizy: niskie zliczenia (możliwe komórki tła) z odcięciem FDR 0, 01 z funkcji DropletUtils74 „emptyDrops”, wysokie zliczenia (możliwe komórki dubletowe) z większą liczbą zliczeń niż punkt przegięcia wykresu kolana, zawartość mitochondriów większa niż 30 procent i zawartość rybosomów większa niż 40 procent. Gen (cechy) dalej filtrowano w celu usunięcia wycofanych identyfikatorów genów i genów, które nie ulegały ekspresji w co najmniej dwóch komórkach. Zobacz uzupełniającą ryc. 7a, b dla początkowej i przefiltrowanej liczby kodów kreskowych i genów komórek.

Dane dotyczące ekspresji znormalizowano przy użyciu SCTransform75, w którym dokonano regresji genów cyklu komórkowego, zawartości rybosomów i zawartości mitochondriów. Komórki następnie zgrupowano i przeprowadzono redukcję wymiarów przy użyciu UMAP76. Początkowe nazwy klastrów zostały przypisane przy użyciu zmodyfikowanej techniki oceny wzbogacania GSVA77,78. Dla każdego z tych klastrów zidentyfikowano górne geny markerowe. Różnie eksprymowane geny porównujące każdy klaster z każdym innym klastrem (wszystkie porównania parami) określono przy użyciu Seurat73 i MAST79. dane scRNA-seq zdeponowano z GEO o numerze dostępu GSE187464.

Identyfikacja klastrów generowanych za pomocą scRNA-Seq.

Klastry niepochodzące z szpiku sklasyfikowano ogólnie jako komórki B (MS4A1), komórki plazmatyczne (SDC1), komórki T CD8 plus (CD3e, C8a), komórki T CD4 plus (CD3e, CD4), komórki regulatorowe T (T -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), limfocyty T δ (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) i komórki odporności wrodzonej typu 2 (ILC2) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS i Rxrg)80–82. Neutrofile zostały zidentyfikowane poprzez ekspresję MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 i ADAM8, chociaż mogą być niedostatecznie reprezentowane w tych analizach ze względu na ich niską zawartość RNA i wysokie poziomy wewnętrznych RNaz83. Konwencjonalne komórki dendrytyczne (cDC) zidentyfikowano za pomocą ekspresji ITGAX i ITGAE, a plazmacytoidalne DC (pDC) zidentyfikowano za pomocą ITGAX i Siglech.

Klasyfikacja klastrów mieloidalnych z scRNA-Seq.

Klaster 5 wyrażał ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- i nie wyrażał TNFAIP2, co wskazuje, że komórki te są rezydentnymi makrofagami. Cluster10 wyraził ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Klastry 3 i 4 wyrażały ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, co sugeruje, że oba są podzbiorami infiltrujących monocytów/makrofagów, chociaż wzmocnione geny zapalne wyrażane w klastrze 3 zostały użyte do identyfikacji klastra 3 jako naciekającego zapalenie monocytów/makrofagów .

Testy fagocytozy.

Trzustki myszy, którym wstrzyknięto PBS/mikrocząstki i myszy trenowanych in vivo WGP zebrano 7 dni po wstrzyknięciu i przetworzono, jak opisano wcześniej, w zawiesinę pojedynczych komórek. Około 2 x 106 przemyto 50-krotnym rozcieńczeniem HEPES w RPMI 1640, a następnie inkubowano w 100 μl tego roztworu przez 1 godzinę w 37 stopniach w celu aktywacji komórek. Invitrogen promuje Green S.

Aureus BioParticlesTM Fagocytosis Kit for Flow cytometry (Thermo Fisher Scientific) stosowano zgodnie z instrukcjami producenta. Około 100 μl rekonstytuowanych cząstek lub 1 x 106 komórek nowotworowych GFP plus KPC dodano do aktywowanych komórek trzustki i inkubowano przez 1 godzinę w 37 stopniach. Próbki delikatnie wirowano co 15 minut. Reakcję zatrzymano przez dodanie 1 ml zimnego PBS. Próbki inkubowano z blokiem Fc przez 10 minut w 4 stopniach, barwiono pod kątem żywotności, CD45, CD11b i F4/80 przez 30 minut w 4 stopniach, a następnie analizowano przy użyciu BD FACSCanto. Do analizy, po bramkowaniu żywymi komórkami i CD45, komórki, które fluoryzowały w kanale FITC określono jako fagocytujące.

Test cytotoksyczności.

Trzustki z myszy traktowanych WGP i PBS zebrano i populacje CD11b plus wyizolowano przy użyciu magnetycznych CD11b plus MicroBeads (Miltenyi Biotec) i autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Oczyszczone komórki CD11b plus następnie przemyto i zliczono, a następnie wysiano je w stosunku 1:20 komórki nowotworowe: komórki efektorowe w 96-płytce. Wszystkie próbki eksperymentalne przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Po wysianiu komórek CD11b plus do jednej zestaw komórek pochodzących z PBS i WGP na 1 godzinę przed dodaniem 5000 eksprymujących lucyferazę komórek KPC plus trzustki do wszystkich studzienek. Po 24 godzinach wspólnej hodowli płytki odwirowano i 20 µl supernatantu zmieszano ze 100 µl odczynnika Luciferase Assay Reagent (Promega). Aktywność lucyferazy mierzona w supernatancie korelowała z komórkami nowotworowymi, które zostały zabite przez komórki efektorowe i była mierzona przy użyciu luminometru (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Spontaniczny sygnał lucyferazy z wysianych komórek nowotworowych odjęto od pomiaru supernatantu. Wartości lucyferazy są reprezentowane jako względne jednostki światła (RLU).

Modele nowotworu in vivo raka trzustki.

Linia komórkowa KPC na tle C57BL/6 pochodząca z LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ plus ; Model myszy Pdx{7}}Cre (KPC) zakupiono od firmy Ximbio. Komórki te i Pan02, które były hojnym darem od dr Yong Lu z Wake Forest University, zostały użyte w ortotopowym modelu raka trzustki. Linia KPC transfekowana GFP i lucyferazą (KPCGFP plus Luc plus) była również hojnym wkładem dr Michaela Dwinella z Medical College of Wisconsin. Komórki te stosowano wyłącznie u myszy albinosów C57BL/6.

W celu wszczepienia guza myszy znieczulono izofluranem, a brzuch myszy przygotowano betadyną i udrapowano w sterylny sposób. Wykonano 2-centymetrową laparotomię w linii pośrodkowej, stosując technikę aseptyczną przy użyciu sterylnych narzędzi. Po laparotomii uzewnętrzniono trzustkę i śledzionę. Komórki nowotworowe zawieszono w lodowatym PBS i zmieszano w stosunku 1:1 z matrycą błony podstawnej Matrigel (Corning). 0,1 × 1{11}}6 komórek nowotworowych w 50 ul roztworu PBS-matrigel wstrzyknięto do ogona trzustki za pomocą strzykawki insulinowej 30-. Utworzenie się małego pęcherzyka wskazywało na udaną implantację. Otrzewną zamknięto powlekanym kwasem poliglikolowym plecionym wchłanialnym szwem 5/0, a skórę zamknięto jedwabnym plecionym niewchłanialnym szwem 5/0. (CP Medyczny). Buprenorfinę podawano w celu opanowania bólu do 72 godzin po operacji i monitorowano myszy.

Obrazowanie in vivo.

Myszom, którym wszczepiono ortotopowo komórki nowotworowe GFP plus lucyferaza plus KPC, wstrzyknięto IP w dawce 150 mg/kg masy ciała w 100 µl XenoLight D-Luciferin-K plus solny substrat bioluminescencyjny (PerkinElmer). Po 10 minutach myszy uśpiono izofluranem i umieszczono w urządzeniu Biospace Lab Photon Imager, które jest dedykowaną metodą optyczną in vivo o niskim poziomie oświetlenia do obrazowania bioluminescencyjnego i fluorescencyjnego. Pobrano obrazy myszy i wykorzystano je do pomiaru wielkości i wzrostu guza.

Model guza z domieszką.

Myszy trenowano 1 mg WGP i 7 dni później populacje CD11b plus CCR2 plus i CD11b plus CCR2- sortowano i mieszano 1: 1 z komórkami nowotworowymi KPC 1 x 105 komórek nowotworowych. Komórki wszczepiono ortotopowo myszom WT i 3 tygodnie później myszy uśmiercono i oceniono wielkość guza.

Terapia skojarzona z mAb anty-PD-L1.

Myszy C57BL / 6 leczono WGP w dniu -7 i wszczepiono im ortotopowe guzy trzustki KPC w dniu 0. Myszy traktowano 200 µg anty-mysiego anty-PD-L1 mAb (Bio X Cell) lub kontroli izotypowej Rat IgG2b (Bio X Cell) w dniach 3, 7 i 11. Następnie myszy monitorowano pod kątem przeżycia.

WGP jako leczenie.

Myszom C57BL/6 wszczepiono ortotopowe guzy trzustki KPC w dniu 0, aw dniach 4 i 11 myszy otrzymały 1 mg IP WGP lub PBS. Następnie myszy monitorowano pod kątem przeżycia.

Analiza statystyczna.

Wszystkie wyniki powtórzono co najmniej trzy niezależne razy w celu weryfikacji, o ile nie podano inaczej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. Dane analizowano za pomocą dwustronnego testu t-Studenta lub testu U Manna-Whitneya. Porównania wielu grup przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej lub dwukierunkowej analizy ANOVA, a następnie testów porównań wielokrotnych Tukeya. Analizy korelacji przeprowadzono przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona (rozkład normalny). Istotność statystyczną ustalono na poziomie p < 0,05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism w wersji 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Podsumowanie raportowania.

Więcej informacji na temat projektowania badań można znaleźć w podsumowaniu raportów z badań przyrodniczych, do którego link znajduje się w tym artykule.

Dostępność danych

W artykule podano dane źródłowe. Dane RNASeq są dostępne pod numerem dostępu GEO GSE187464, a dane scRNA-Seq są dostępne pod numerem dostępu GEO GSE187464 Dane źródłowe podano w tym artykule.

Otrzymano: 2 kwietnia 2021 r.; Przyjęto: 17 stycznia 2022 r.

Bibliografia

1. ACS. Fakty i liczby dotyczące raka 2020.

2. Rahib, L. i in. Prognozowanie zachorowań i zgonów na raka do 2030 r.: nieoczekiwane obciążenie rakiem tarczycy, wątroby i trzustki w Stanach Zjednoczonych. Rak Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW i Mahipal, A. Współczesne postępowanie w zlokalizowanym resekcyjnym raku trzustki. Raki 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Wyniki w leczeniu operacyjnym raka trzustki. J. Surg. onkol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. i in. Immunoterapia raka trzustki: aktualizacja z 2020 r. Leczenie raka. Wersja 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Inhibitory punktów kontrolnych w raku trzustki. Leczenie raka. Obj. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Inhibitory immunologicznego punktu kontrolnego w raku płuc i czerniaku. Semin. onkol. pielęgniarki. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Inhibitory immunologicznego punktu kontrolnego dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi: obecny krajobraz i przyszłe kierunki. Głowa. Szyja 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Regulacja i modulacja odporności przeciwnowotworowej w raku trzustki. Nat. immunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE i in. Badanie fazy 2 pojedynczego środka ipilimumabu (anty-CTLA-4) w leczeniu miejscowo zaawansowanego lub przerzutowego gruczolakoraka trzustki. J. Odporny. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM i in. Durwalumab z tremelimumabem lub bez u pacjentów z przerzutowym gruczolakorakiem przewodowym trzustki: randomizowane badanie kliniczne fazy 2. JAMA Onkol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ i in. Badanie fazy Ib/II gemcytabiny, nab-paklitakselu i pembrolizumabu w gruczolakoraku trzustki z przerzutami. Inwestować. Nowe narkotyki 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. w Pancreatic Cancer and Tumor Microenvironment (red. Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Mikrośrodowisko guza raka trzustki: krajobraz immunologiczny jest podyktowany cechami molekularnymi i histopatologicznymi. br. J. Rak 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Niedotlenienie jako bariera w immunoterapii gruczolakoraka trzustki. Clin. Tłumacz. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. Kinaza RIP1 napędza adaptacyjną tolerancję immunologiczną za pośrednictwem makrofagów w raku trzustki. Komórka rakowa 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG i in. Wyszkolona odporność: program wrodzonej pamięci immunologicznej w zdrowiu i chorobie. Nauka 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. i in. Metaboliczna indukcja wyszkolonej odporności poprzez szlak mewalonianu. Cela 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetyka i wytrenowana odporność. przeciwutleniacz. Sygnał redoks. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Wyszkolona terapia nanobiologiczna promująca odporność hamuje wzrost guza i nasila hamowanie punktu kontrolnego. Cela 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. i in. Wrodzony trening odpornościowy granulopoezy promuje aktywność przeciwnowotworową. Cela 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modulacja prekursorów mielopoezy jest integralną częścią wytrenowanej odporności. Cela 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Wyszkolona odporność: przeprogramowanie wrodzonej odporności w zdrowiu i chorobie. Annu Wielebny Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Rozwój i funkcja makrofagów rezydujących w tkankach u myszy. Semin. immunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Anatomia trzustki warunkuje pochodzenie i właściwości rezydujących makrofagów. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Czynnik transkrypcyjny MafB promuje przeciwzapalną polaryzację M2 i wypływ cholesterolu w makrofagach. nauka Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY i in. Przeciwzapalne działanie apocyniny, inhibitora oksydazy NADPH, w stanach zapalnych dróg oddechowych. immunol. Biol komórkowy. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. i in. Czynnik transkrypcyjny c-Maf jest punktem kontrolnym, który programuje makrofagi w raku płuc. J. Clin. Inwestować. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA i in. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek identyfikuje potencjalne sygnatury ekspresji genów makrofagów rezydujących w nerkach u różnych gatunków. J. Am. soc. Nefrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 reguluje odpowiedź immunologiczną poprzez modulowanie wzajemnej konwersji i funkcji efektorowych i regulatorowych komórek T. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Wady rekrutacji makrofagów i obrony gospodarza u myszy pozbawionych receptora chemokin CCR2. J. Exp. Med. 186, 1757-1762 (1997).

32. Kuziel, WA i in. Poważne zmniejszenie adhezji leukocytów i wynaczynienia monocytów u myszy z niedoborem receptora chemokin CC 2. Proc. Natl Acad. nauka USA 94, 12053-12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Konwersja monocytów podczas stanu zapalnego i urazu. miażdżyca. zakrzep. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. i in. Czynnik hamujący migrację makrofagów indukuje przejście nabłonka w mezenchymę, zwiększa agresywność guza i przewiduje wyniki kliniczne w resekcji gruczolakoraka przewodowego trzustki. Int. J. Rak 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. i in. Hamowanie MIF prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy w komórkach raka trzustki. J. Surg. Rez. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ i in. Peroksydacja lipidów wywołana reaktywnymi formami tlenu w apoptozie, autofagii i ferroptozie. Utleniony. Med. Komórka Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Pochodzący z drożdży -glukan w raku: nowe zastosowania tradycyjnego leku. Int. J. Mol. nauka 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Istotna rola monocytów i makrofagów w progresji ostrego zapalenia trzustki. Świat J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Rezerwuar dojrzałych makrofagów jamy ustnej, które mogą szybko atakować narządy trzewne, wpływając na naprawę tkanek. Cela 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. i in. Szlaki różnicowe regulujące wrodzone i adaptacyjne przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne przez rozdrobnione i rozpuszczalne glukany pochodzące z drożdży. Krew 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS i in. Aktywacja receptora odporności wrodzonej Dektyna-1 po utworzeniu „synapsy fagocytującej”. Przyroda 472, 471–475 (2011).

42. Masuda, Y. i in. Doustne podawanie rozpuszczalnych glukanów ekstrahowanych z Grifola frondosa indukuje ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną przeciwnowotworową i zmniejsza immunosupresję u myszy z nowotworem. Int. J. Rak 133, 108–119 (2013).

43. Ryż, PJ i in. Farmakokinetyka grzybowych (1-3)-beta-D-glukanów po podaniu dożylnym szczurom. Int. Immunofarmakol. 4, 1209-1215 (2004).

44. Huang, Y. i in. Zależny od S1P handel międzynarządowy wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 wspiera obronę gospodarza. Nauka 359, 114–119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Migracja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 rezydujących w płucach łączy alergiczne zapalenie płuc i odporność wątroby. Przód. immunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR i in. Szlaki specyficzne tkankowo wytłaczają aktywowane ILC2 w celu rozpowszechnienia odporności typu 2. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Włączanie odporności przeciwnowotworowej poprzez uwolnienie ILC2. Rozdz. komórki 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Różnorodność makrofagów zwiększa progresję guza i przerzuty. Cela 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ i in. CCL2 rekrutuje zapalne monocyty, aby ułatwić przerzuty raka piersi. Przyroda 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH i Cheung, NK Fagocytoza komórek nowotworowych przez ludzkie monocyty hodowane w rekombinowanym czynniku stymulującym tworzenie kolonii makrofagów. J. Exp. Med. 172, 231-237 (1990).

51. Jadus, MR i in. Makrofagi zabijają komórki nowotworowe glejaka T9 niosące błonową izoformę czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów poprzez szlak zależny od fagocytozy. J. Immunol. 160, 361-368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Fagocytoza komórek nowotworowych za pośrednictwem makrofagów: szansa na interwencję nanomedycyny. adw. Funkcja Matko. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Funkcja fagocytarna makrofagów związanych z nowotworem jako kluczowy wyznacznik kontroli progresji nowotworu: przegląd. J. Odporny. Rak 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB i Albina, JE Aktywowane mysie makrofagi indukują apoptozę w komórkach nowotworowych poprzez mechanizmy zależne lub niezależne od tlenku azotu. Rak Res. 54, 2462-2467 (1994).

55. Brahmer, JR i in. Bezpieczeństwo i aktywność przeciwciała anty-PD-L1 u pacjentów z zaawansowaną chorobą nowotworową. N. angielski J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. i in. Dektyna{1}} jest wymagana do obrony gospodarza przed Pneumocystis carinii, ale nie przed Candida albicans. Nat. immunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Oczyszczanie, bioaktywność i analiza struktury drugorzędowej mysiego i ludzkiego czynnika hamującego migrację makrofagów (MIF). Biochemistry 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: zapewnienie platformy analitycznej do analizy danych cytometrii społeczności i współpracy. bież. Szczyt. Mikrobiol. immunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. Przepływ pracy CyTOF: odkrycie różnicowe w wysokowydajnych wielowymiarowych zestawach danych cytometrycznych. F1000Rez. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: narzędzie do wykrywania klas z oceną pewności i śledzeniem przedmiotów. Bioinformatyka 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Infrastruktura do reprezentacji i interakcji z bramkowanymi i niebrakowanymi zestawami danych cytometrii. Wersja bioprzewodników (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML w celu udostępniania danych z cytometrii międzyplatformowej. Cytom. Część A: J. Int. soc. Analny. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: narzędzia do analizy danych cytometrii. Wersja pakietu R 1.10.3. HelenaLC/KATALIZATOR (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Format pliku Sanger FASTQ dla sekwencji z oceną jakości oraz warianty Solexa/Illumina FASTQ. Kwasy nukleinowe Res. 38, 1767-1771 (2010).

65. Illumina. Podręcznik użytkownika BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: narzędzie do kontroli jakości danych sekwencyjnych o dużej przepustowości.

67. Dobin, A. i in. STAR: ultraszybki uniwersalny aligner RNA-seq. Bioinformatyka 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Umiarkowane oszacowanie zmiany krotności i dyspersji dla danych RNA-seq za pomocą DESeq2. Genom Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. i in. Różnicowa analiza ekspresji genów i transkryptów eksperymentów RNAseq z TopHat i spinkami do mankietów. Nat. Protokół 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT i Huber, W. HTSeq – framework Pythona do pracy z danymi sekwencjonowania o dużej przepustowości. Bioinformatyka 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI i in. GO::TermFinder — oprogramowanie typu open source do uzyskiwania dostępu do informacji o ontologii genów i znajdowania znacznie wzbogaconych terminów ontologii genów powiązanych z listą genów. Bioinformatyka 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. i Goto, S. KEGG: encyklopedia genów i genomów z Kioto. Kwasy nukleinowe Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. i in. Kompleksowa integracja danych jednokomórkowych. Cela 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: odróżnianie komórek od pustych kropelek w danych sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA opartych na kroplach. Genom Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalizacja i stabilizacja wariancji danych seq pojedynczej komórki przy użyciu uregulowanej ujemnej regresji dwumianowej. Genom Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Redukcja wymiarowości do wizualizacji danych jednokomórkowych przy użyciu UMAP. Nat. Biotechnologia. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ i in. Ocena metod przypisania etykiet typu komórek do klastrów komórek z danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. F1000Rez. 8 Komunikat ISCB J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: analiza zmienności zestawu genów dla danych z mikromacierzy i sekwencji RNA. BMC Bioinformatyka. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. et al. MAST: elastyczne ramy statystyczne do oceny zmian transkrypcyjnych i charakteryzowania heterogeniczności w danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Genom Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Identyfikacja wrodzonych komórek limfoidalnych w danych z pojedynczej komórki RNA-Seq. Immunogenetyka 69, 439–450 (2017).

81. Entwistle, LJ i in. Fenotyp wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 płuc jest specyficzny dla kontekstu: określa wpływ szczepu, lokalizacji i bodźców. Przód. immunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR i in. Sygnały tkankowe odciskają tożsamość ILC2 z funkcją przewidywania. Nat. immunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Transkryptomika jednokomórkowa ludzkich i mysich raków płuc ujawnia konserwatywne populacje mieloidalne u osobników i gatunków. Immunitet 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Podziękowanie

Autorzy pragną podziękować dr Wolfgangowi Zachariasowi, dr Mei Zhang i Sabine Waigel z Brown Cancer Center Genomics Facility za ich pomoc w RNA-Seq i scRNASeq. Chcielibyśmy również podziękować dr Clintowi Gellerowi za korektę manuskryptu. Ta praca była wspierana przez NIH R01CA213990 i R01AI128818 (JY). CD i CTW były częściowo obsługiwane przez NIH P20GM135004. Część tej pracy została wykonana przy pomocy UofL Genomics Facility, która jest wspierana przez NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center i opłaty użytkowników. CyTOF przeprowadzono w Functional Immunomics Core wspieranym przez NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Sekwencjonowanie i wsparcie bioinformatyczne dla tej pracy zapewnili NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) i NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Treść tej pracy jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie reprezentuje oficjalnego stanowiska NIH ani Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (NIGMS).

Autorskie Wkłady

Firma AEG zaprojektowała i przeprowadziła eksperymenty, przeanalizowała dane, zinterpretowała wyniki i napisała manuskrypt. RS, CD i HG przyczyniły się do projektowania eksperymentów, pozyskiwania i analizy danych. MRW, XH i MZ pomagały w pozyskiwaniu danych i przygotowaniu materiałów. KA i ECR przyczyniły się do analizy obliczeniowej i interpretacji analiz RNA-Seq, a JHC i ECR przyczyniły się do analizy obliczeniowej i interpretacji analiz ScRNA-Seq. DT i CTW przyczynili się do analizy danych CyTOF. RAM, H.-gZ i YL dostarczyli materiały i kierowali projektem. RAM przeprowadził krytyczną recenzję. JY kierował projektem eksperymentu i ogólnym badaniem, interpretował dane, nadzorował badania i pomagał w pisaniu i recenzji manuskryptu.

Konkurujące interesy

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Dodatkowe informacje

Informacje dodatkowe Wersja online zawiera dodatkowe materiały dostępne pod adresem https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Korespondencję i prośby o materiały należy kierować do Jun Yan.

Informacje o recenzowaniu

Nature Communications dziękuje George'owi Millerowi i pozostałym anonimowym recenzentom za ich wkład w recenzowanie tej pracy. Dostępne są raporty recenzentów.

Przedruki i informacje o pozwoleniach są dostępne na stronie http://www.nature.com/reprints

Nota wydawcy Firma Springer Nature pozostaje neutralna w stosunku do roszczeń jurysdykcyjnych na opublikowanych mapach i powiązań instytucjonalnych.

Otwarty dostęp Ten artykuł jest objęty licencją Creative Commons Attribution 4.0 International License, która zezwala na używanie, udostępnianie, adaptację, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku lub w dowolnym formacie, pod warunkiem uznania oryginalnego autora (s) i źródło, podaj link do licencji Creative Commons i wskaż, czy wprowadzono zmiany.

Obrazy lub inne materiały osób trzecich zawarte w tym artykule są objęte licencją Creative Commons, chyba że zaznaczono inaczej w informacji o autorze materiału. Jeśli materiał nie jest objęty licencją Creative Commons, a zamierzone użycie jest niezgodne z przepisami prawa lub wykracza poza dozwolone użycie, konieczne będzie uzyskanie pozwolenia bezpośrednio od właściciela praw autorskich. Aby wyświetlić kopię tej licencji.

For more information:1950477648nn@gmail.com