Zarządzanie rozpuszczonym tlenem za pomocą polipropylenowego stycznika z membraną z pustymi włóknami wpływa na starzenie się wina

kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakcyjny

Tło: Liczne praktyki enologiczne mogą powodować nadmiar rozpuszczonego tlenu w winie, tym samym określając defekty sensoryczne i chromatyczne w perspektywie krótko- lub długoterminowej. Dlatego konieczne jest zapanowanie nad nadmiarem tlenu przed butelkowaniem. Metody: W tym badaniu, zarządzanie zawartością rozpuszczonego tlenu za pomocą aparatu kontaktowego z polipropylenową membraną kapilarną przeprowadzono w dwóch winach z różnych odmian winogron (Aglianico i Falanghina). Wina zostały przeanalizowane po 11-miesiącu leżakowania. Zawartość antocyjanów i aldehydu octowego oceniono metodą HPLC. Ponadto innefenolowyzwiązki i charakterystyki chromatyczne analizowano metodami spektrofotometrycznymi. Przeprowadzono analizy NMR i HR ESIMS w celu oceny liczby proantocyjanów i pigmentów polimerowych. Wyniki: Po 11 miesiącach leżakowania w obu winach stwierdzono spadek zawartości wolnego i całkowitego SO2 w stosunku do wartości początkowych. W winach o najwyższym poziomie rozpuszczonego tlenu zaobserwowano bardziej znaczącą stratę. Nie wykryto istotnych różnic pod względem parametrów kolorystycznych. W czerwonym winie o najwyższej zawartości tlenu, masywne tworzenie się polimerupigmentyi zaobserwowano reaktywne taniny BSA, w przeciwieństwie do win o niższym poziomie tlenu. Wniosek: Badanie wykazało, że kontaktor membranowy może okazać się skutecznym narzędziem do zarządzania rozpuszczonym tlenem w winach, aby zapobiec ich oksydacyjnemu psuciu się.

Słowa kluczowe: utlenianie; kontaktor membranowy; wino; pigmenty polimerowe

kliknij, aby uzyskać więcej informacji

1. Wstęp

Wino jest układem dynamicznym chemicznie i nawet po fermentacji jego skład ewoluuje podczas przechowywania. Te zmiany po fermentacji nazywane są starzeniem, ale należy odróżnić zmiany zachodzące podczas fazy dojrzewania (np. luzem przechowywania wina w cysternach lub beczkach), kiedy interwencja winiarza jest nadal dozwolona, ​​a miejsce w fazie dojrzewania, gdy wino zostało zamknięte w butelkach, a jedyna możliwa interwencja ogranicza się do wyboru najodpowiedniejszych warunków przechowywania.

Wśród związków win, fenole są najbardziej narażone na starzenie. Pochodzą z winogron(flawonoidyi nieflawonoidów) i stanowią jeden z najważniejszych parametrów jakości wina. Podczas produkcji wina i dojrzewania fenole ulegają głównieutlenianiereakcje, które nie tylko wpływają na sam skład fenolowy, ale również warunkują zmiany w zakresie cech sensorycznych, takich jak kolor i cierpkość.

Związki fenolowe są podstawowymi reagentami, które ulegają utlenieniu w obecności tlenu i metali (Fe3 plus Cu2 plus ), powodując kaskadę przemian chemicznych, które mogą skutkować nadmiernym zepsuciem wina [1]. Winoutlenianieskłada się z szeregu reakcji: po pierwsze, tlen jest redukowany do nadtlenku wodoru poprzez oddziaływanie z metalami przejściowymi, w tym jonami żelaza i miedzi, w obecności podjednostek katecholowych, które są utleniane do chinonów [2]. Chinony silnie reagują ze związkami nukleofilowymi, takimi jak antyoksydanty (dwutlenek siarki, glutation, kwas askorbinowy), pożądany aromat lotne tiole

(tj. 3-sulfanyloheksanol), niepożądane tiole aromatyczne (tj. siarkowodór), aminokwasy (tj. fenyloalanina, metionina) oraz liczne polifenole (głównie flawonole). Produkty tych reakcji mogą prowadzić do powstania skondensowanejpigmenty polimerowe— szczególnie ważne w winach czerwonych — lub nawet do utraty koloru i cech odmianowych [3]. W kolejnym etapie, cząsteczki żelaza lub miedzi reagują z nadtlenkiem wodoru w reakcji Fentona, dając rodnik hydroksylowy, silny utleniacz, zdolny do reagowania ze wszystkimi składnikami organicznymi proporcjonalnie do stężenia [4]. Najpowszechniejszym związkiem organicznym w winie jest etanol, który po utlenieniu przez rodnik hydroksylowy przekształca się w aldehyd octowy.

Jako konsekwencjeutlenianie, w czerwonym winie natywne pigmenty antocyjanów są szybko przekształcane w bardziej stabilne pigmenty poprzez różnego rodzaju reakcje, takie jak reakcje kondensacji za pośrednictwem aldehydów z taninami i reakcje cykloaddycji prowadzące do powstania proantocyjanów [5]. Reakcje utleniania przyczyniają się również do modyfikacji cierpkości wina poprzez zmianę struktury garbników w wyniku wewnątrz- i międzycząsteczkowych reakcji za pośrednictwem tlenu [6]. Te „ustabilizowane produkty” antocyjany lub pigmentowane taniny utrzymują się w winie znacznie dłużej niż w ich pierwotnych formach [7]. Dlatego małe ilości tlenu w czerwonym winie są ważne dla stabilizacji koloru lub cierpkości. Sam Pasteur w swoich badaniach nad winem wysnuł teorię, że tylko wtedy, gdy wino jest wystawione na działanie tlenu, może rozwinąć cechy, które czynią z niego dobrze dojrzały produkt wysokiej jakości. Podczas produkcji wina tlen odgrywa kluczową rolę w procesie fermentacji. Wspomaga syntezę biomasy drożdży i sprzyja zdrowej fermentacji. Kilka badań wykazało, że ryzyko zatrzymanych i powolnych fermentacji zmniejsza się po dodaniu tlenu w wysokości 10-20 mg/L [8].

W białych winach utlenianie zwykle wiąże się z istotnymi zmianami koloru. Brązowy kolor jest zwykle niepożądany, ponieważ jest oznaką utleniania białego wina stołowego. Brązowe zabarwienie może być wywołane przez utlenianie enzymatyczne lub chemiczne za pośrednictwem tlenu. Ten ostatni jest wolniejszy niż utlenianie indukowane enzymami. Wino białe jest ogólnie bardziej wrażliwe na O niż wino czerwone. Nawet niewielkie dodatki O. do białego wina mogą prowadzić do utraty aromatu, zwłaszcza owocowości z pojawieniem się nieprzyjemnych posmaków opisanych jako karmelowe, zjełczałe, pochodzące z paszy hodowlanej, miodowe i gotowane warzywa. Chinony wytworzone w wyniku utleniania mogą reagować z tiolami w reakcji addycji Michaela lub generować H2O2, jak podano powyżej. Środowisko utleniające we wszystkich fazach produkcji wina jest pozytywnie skorelowane z powstawaniem tych produktów. Podczas starzenia czerwonego wina w dębowych beczkach proces utleniania powoduje również powstawanie sotolonu poprzez utlenianie treoniny lub reakcję aldehydu octowego z kwasem -ketomasłowym. Degradacja oksydacyjna fenyloalaniny i -fenyloetanolu w beczce również prowadzi do wyższych stężeń fenyloacetaldehydu [9].

Jak opisano powyżej, tlen może mieć korzystny lub szkodliwy wpływ na jakość wina. Poziom ekspozycji wina na tlen podczas produkcji wina lub dojrzewania ma kluczowe znaczenie, ponieważ może wpływać na produkt końcowy. Singleton [10] oszacował ilość tlenu, jaką białe lub czerwone wino może wchłonąć, zanim pojawią się defekty oksydacyjne. W białym winie tolerancja wynosi około 10 saturacji powietrza w przeciwieństwie do czerwonego wina, które może tolerować ponad 30 saturacji powietrza (180 mLO2/L). Zalecił też około 10 nasyceń, aby poprawić jakość czerwonego wina.

Zarządzanie tlenem podczas faz winifikacji i przechowywania jest zatem ważne i musi być obsługiwane zgodnie z nabytą wiedzą, aby uniknąć pojawienia się cech oksydacyjnych. Po wyprodukowaniu wino zwykle przechodzi szereg praktyk stabilizacji, takich jak dekantacja, chłodzenie i filtracja, które mogą określić niekontrolowany dopływ tlenu. Ponadto, obecnie powszechne są nowe metody winifikacji, w których wykorzystuje się zbiorniki i systemy ze stali nierdzewnej umożliwiające kontrolowane mikrodostarczanie tlenu (mikro-natlenianie). Nawet jeśli poczyniono szczególne wysiłki, aby wyprodukować wina, które są jak najbardziej odporne na dalsze pobieranie tlenu, cały niekontrolowany rozpuszczony tlen w winie może determinować dalszy rozwój cech utleniających po butelkowaniu. W tym kontekście zastosowanie kontaktora membranowego do zarządzania tlenem w winie przed butelkowaniem może być skuteczną strategią w celu uzyskania najlepszych możliwych win.

Kontaktory membranowe są jednymi z najczęściej używanych systemów przemysłowych, a technologia ta okazała się przydatna w wielu zastosowaniach ciecz/ciecz i gaz/ciecz w fermentacji, farmaceutykach, oczyszczaniu ścieków, separacji chiralnej, produkcji półprzewodników, karbonizacji napojów, ekstrakcji jonów metali , ekstrakcja białek, usuwanie LZO z gazów odlotowych, destylacja osmotyczna i dealkoholizacja wina [11,12]. Jest to urządzenie, które osiąga transfer masy gaz/ciecz lub ciecz/ciecz bez rozpraszania jednej fazy w drugiej. Chociaż technologia kontaktora membranowego została wprowadzona jako narzędzie do zarządzania gazem w winach [13,14], do tej pory niewiele badań zajmowało się skutecznością jej zastosowania przed butelkowaniem w celu regulacji ewolucji białego i czerwonego wina podczas starzenia butelek.

W niniejszym badaniu przeprowadzono częściową deoksygenację dwóch win jednoodmianowych: Aglianico i Falanghina. Wpływ usuwania tlenu na kilka parametrów wina, takich jak zawartość wolnego i związanego SO2 i aldehydu octowego, oceniano po 1 miesiącu starzenia butelki. W przypadku czerwonego wina oceniano również wpływ na właściwości chromatyczne i główne związki fenolowe.

2. Wyniki i dyskusja

W tym badaniu dwa wina komercyjne (Aglianico (R) i Falanghina (W)) zostały poddane procesowi odtleniania przy użyciu technologii kontaktora membranowego w celu uzyskania trzech win o obniżonym poziomie rozpuszczonego tlenu (wysoki (H), średni (M), i niski (L) dla każdego wina) przed fazą butelkowania. Po 11 miesiącach starzenia butelki wpływ na dwutlenek siarki, aldehyd octowy, znaki chromatyczne,pigmenty polimerowe, oceniano VRF, BSA-garbniki i całkowity fenol S.

2.1. Dwutlenek siarki

Stężenie wolnego i całkowitego SO2 monitorowano po 11 miesiącach leżakowania w winie Aglianico (tabela 1). Dla wszystkich próbek zaobserwowano ubytek SO2 w zależności od czasu butelkowania (SO wolne, 18 mg/L, SO ogółem, 43 mg/L), a największy spadek wartości SO2 ogółem zaobserwowano w winach o wyższych zawartość tlenu podczas butelkowania (RHO2 i RMO2), zgodnie z oczekiwaniami.

Podczas procesu starzenia najbardziej obfite formy wolnego SO2 przy pH wina, jon wodorosiarczynowy (HSO, w równowadze z cząsteczkowym SO2), jest zużywany w reakcji z nadtlenkiem wodoru i kilkoma elektrofilowymi składnikami wina, takimi jak wytwarzane przez kaskadę utleniania, w tym chinon i aldehyd octowy [15]. W winnicach powszechną praktyką jest mierzenie tak zwanego „wolnego SO”, czyli sumy cząsteczkowego SO i jonów wodorosiarczynowych. Ten ostatni związek może tworzyć addukty kowalencyjne z elektrofilami, zwane spoiwami SO2, które można sklasyfikować jako słabe lub silne na podstawie stałej dysocjacji utworzonych adduktów siarczynowych. Te addukty siarczynowe nazywane są związanymi SO, a suma

wolnego i związanego SO daje "całkowite SO". Wolne i związane SO są ze sobą w równowadze w winie. Co więcej, podczas utleniania, dzięki równowadze między tymi dwiema formami SO2 i przez zużycie wolnego SO2, połączona forma jest uwalniana w celu przywrócenia równowagi. We wszystkich winach czerwonych poddanych obróbce, wartości wolnego SO2 poniżej 3,84 mg/L wykryto po 11 miesiącach starzenia butelek. Wartości te są znacznie poniżej limitu ilościowego oficjalnych metod analizy wolnego SO2 [16]; dlatego słuszniej jest uznać za nieistotną wartość wolnego SO, podczas gdy wartości SO ogółem były niższe w próbkach butelkowanych z wyższą zawartością tlenu rozpuszczonego (RHO2). Zmiana pomiędzy starzeniem swobodnym a kombinowanym może być powodem, dla którego wykryto malejące poziomy całkowitego SO2 w winach, ponieważ wzrastał poziom rozpuszczonego tlenu podczas butelkowania. Oprócz zużycia SO2 w wyniku reakcji utleniania, część może być również tracona podczas starzenia w wyniku reakcji dwutlenku siarki z flawanolami. Mechanizm powstawania produktów 4/β-sulfonowanych jest nadal niepewny. Przypuszcza się, że monomeryczne 4ß-sulfonowane pochodne powstają w wyniku katalizowanej kwasem depolimeryzacji proantocyjanidyn [17].

Stężenia wolnego i całkowitego SO2 (tab. 1) monitorowano po 11 miesiącach leżakowania w białym winie, którego zachowanie okazało się takie samo jak w czerwonym winie. Ponadto w tym przypadku wykryto utratę wolnego i całkowitego SO2 w stosunku do wartości początkowych (wolne SO,26 mg/L i tot. SO, 89 mg/L).Ponadto wina o wyższej zawartości tlenu przy butelkowanie (WHO2) wykazywało niższą zawartość wolnego i całkowitego SO2.

Aldehyd octowy, powstały w wyniku katalizowanego metalem utleniania etanolu podczas utleniania wina, był wyższy po 11 miesiącach starzenia w próbce WHO w odniesieniu do próbki WMO i WLO, zgodnie z oczekiwaniami, biorąc pod uwagę niższą zawartość wolnego i całkowitego SO w WHO, próbki (tabela 2). Ponieważ stosunek wagowy aldehydu octowego do dwutlenku siarki wynosi 1,4/1 (1,4 mg SO2 zużytego na 1 mg CH3CHO), możemy ocenić, że ilość aldehydu octowego w próbce WHO jest całkowicie połączona z SO (50 mg aldehydu octowego w połączeniu z 70 mg SO2) i biorąc pod uwagę znikome poziomy wolnego dwutlenku siarki po 11 miesiącach starzenia, oczekuje się, że dalsza ekspozycja na tlen może prowadzić do pojawienia się wolnego aldehydu octowego.

W winach czerwonych stężenie aldehydu octowego nie różni się pomiędzy analizowanymi próbkami. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że w obecności antocyjanów i wyższego stężenia flawanoli aldehyd octowy bierze udział w szeregu reakcji z tymi fenolami podczas starzenia. Jak omówiono poniżej, najważniejszą reakcją z udziałem aldehydu octowego, antocyjanów i flawonoli jest tworzenie się związków z mostkiem etylowym [18,19] i oligomerów połączonych z pierścień lub inne struktury typu polimerowego. Ostatecznie produkty te mogą zmieniać cechy sensoryczne wina [20], wpływając na niektóre kluczowe cechy wina, takie jak kolor, smak i cierpkość.

2.2. Wpływ na pigmenty i znaki chromatyczne

Dane dotyczące zawartości monomerycznych antocyjanów w czerwonych winach poddanych obróbce po 11 miesiącach starzenia butelek wykazały (tabela 3 i materiały uzupełniające rysunek S1) utratę -3-glukozydu malwidyny w próbce RHO2 przy wyższym stężeniu tlenu niż w RMO2 i RLO2. Konsekwentnie, wśród win wykryto różnice pod względem całkowitej zawartości antocyjanów (rysunek 1). Wino o niskim stężeniu tlenu podczas butelkowania wykazywało wyższe stężenie całkowitych antocyjanów natywnych w porównaniu do tych o wyższym stężeniu tlenu rozpuszczonego. Wpływ obróbki kontaktorem membranowym na różne klasy pigmentów, określony metodą Harbertsona, obejmował spodziewane znaczne niskie stężenie w SPP (krótkie pigmenty polimerowe) w próbkach RLO, w porównaniu z próbkami RHO2 i RMO2, które wykazały najwyższy wzrost tych ważnych stabilne związki (tabela 4). LPP (długie pigmenty polimerowe) nie różniły się znacząco we wszystkich próbkach. Pigmenty polimerowe (SPP i LPP) definiuje się jako pigmenty odporne na bielenie wodorosiarczynami. Powstają w wyniku reakcji antocyjanów z taninami podczas starzenia wina [21], co prowadzi do stabilizacji barwy w czasie. Główna różnica między tymi dwiema klasami pigmentów polega na tym, że w przeciwieństwie do SPP, LPP ma tendencję do wytrącania się z białkiem [22]. W miarę starzenia się czerwonego wina zwykle obserwuje się większe tworzenie LPP w porównaniu z SPP. Tak więc zmiany wykryte dla SPP, a nie dla LPP, mogą odzwierciedlać wczesny stan oksydacyjny win Aglianico po 11 miesiącach leżakowania. Zaangażowanie natywnych antocyjanów w reakcje dające nowe pigmenty polimerowe jest zgodne ze spadkiem całkowitych natywnych antocyjanów pokazanym w (Tabela 4) i z podobnymi efektami obserwowanymi w czerwonych winach podczas mikrooksygenacji [23].

W miarę starzenia się wina i poprzez różne ekspozycje na tlen, te polimerowe pigmenty nabierają kluczowego znaczenia dla koloru wina, a niewielkie ilości aldehydu octowego mogą reagować z antocyjanami, tworząc nowe stabilne czerwone pigmenty [19,24]. Fakt, że nie wykryto znaczących różnic w zakresie intensywności i odcienia barwy (tab. 5), mógł być prawdopodobnie spowodowany, jak już zaobserwowano w przypadku LPP, stosunkowo krótkim czasem starzenia.

2.3. Wpływ na pigmenty czerwonego wina: analizy NMR i HR ESIMS

W celu zrozumienia molekularnych podstaw obserwowanych zmian w winach poddanych działaniu różnych poziomów tlenu, próbki RHO2, RMO2 i RLO zostały poddane analizie opartej na NMR, jak opisano w sekcji 3. Dokładna kontrola otrzymane widma H-NMR trzech próbek nie ujawniły żadnej dostrzegalnej różnicy między trzema porównywanymi winami (materiały uzupełniające, rysunek S2). Dlatego zdecydowaliśmy się zbadać te same wina za pomocą HR ESIMS, biorąc pod uwagę wyższą czułość tej techniki w porównaniu ze spektroskopią NMR. Trzy wina frakcjonowano metodą HPLC/Vis przy użyciu kolumny C-18. Dla każdego wina uzyskano trzy frakcje: pierwszą frakcję zebrano od 15 do 25 min (frakcja 1), drugą od 25 do 30 min (frakcja 2) i wreszcie trzecią frakcję (frakcja 3) od 30 min do końca cyklu chromatograficznego. Zgodnie z danymi podawanymi w literaturze [25], w pierwszej frakcji spodziewano się występowania antocyjanów nieacetylowanych, natomiast w drugiej frakcji miały być zbierane potencjalne piranoantocyjaniny. Wszystkie trzy otrzymane frakcje (1-3) dla każdego z trzech analizowanych win (RHO, RMO i RLO) poddano pełnej analizie HR ESIMS w trybie jonów dodatnich. Załamanie 1 dla wszystkich win, wykryliśmy pik jonowy przypisany do -3-O-glukozydu malwidyny (493.1332;△{24}}.648; odpowiadający C23H2sO12 plus), podczas gdy piki jonowe związane z innymi powszechnymi antocyjany w winie, po wykryciu, wykazywały błędy powyżej 10 ppm i nie były uważane za wiarygodne (materiały uzupełniające rys. S3). W odniesieniu do frakcji 2 i 3 RMO2 i RLO okazały się one w zasadzie nakładać się na siebie, podczas gdy widma masowe z frakcji 2 i 3 RHO wino wykazywało kilka interesujących osobliwości. Dokładniej, we frakcji 2, we frakcji 2 zaobserwowano pik jonowy ze środkiem przy m/z517.1317(△=-4.569; odpowiadający C25H25O12). Ten pik przypisano Vitisin B (Materiały Uzupełniające Rysunek S4) [26]. W widmie masowym frakcji 3 RHO, dwa piki jonowe przy m/z809.2294(△=0.827; odpowiadające Ca0H4O18)(Materiały Uzupełniające Rysunek S5) i 1029.2871(△=-0.065 odpowiadające odpowiednio CsH53O25) (materiały uzupełniające, rysunek S6). Te piki jonowe wskazywały na występowanie pigmentów polimerowych. Pik przy m/z 809 przypisano dimerom z mostkiem etylidenowym składającym się z jednej jednostki -3-O-malwidyny i jednego ugrupowania (epi)katechiny [27I, a pik przy m/z1029 przypisano do etylideno- zmostkowany dimer złożony z dwóch jednostek malwidyny-3-O-glukozydowych, z których jedna występuje w postaci flavylium, a druga w postaci pseudozasadowej [28,29].

Vitis w B i pigmenty z mostkiem etylidenowym (m/z 809 i 1029) są wynikiem reakcji chemicznej między aldehydem octowym i antocyjaniną lub flawan-3-olami. Aldehyd octowy może działać jako nukleofil w pozycji alfa lub jako elektrofil w funkcji karbonylowej. Reakcja między nukleofilowym aldehydem octowym a elektrofilową pozycją C4 antocyjanów prowadzi do powstania Vitisin B, dość stabilnego związku klasyfikowanego jako piranoantocyjanina. Odwrotnie, gdy aldehyd octowy działa jako elektrofil poddając się atakowi nukleofilowemu przez C8, a w mniejszym stopniu nawet przez pozycje C6 flawan-3-oli lub antocyjanów, powstają dimery z mostkiem etylidenowym. Nic dziwnego, że Vitisin B i czerwone pigmenty zaobserwowaliśmy tylko w winie RHO2, ponieważ takie produkty, jak omówiono powyżej, powstają w reakcji aldehydu octowego z antocyjanami i flawan-3-olami, a aldehyd octowy jest głównie cząsteczką powstałe w wyniku procesu utleniania, któremu wina podlegały z biegiem czasu w wyniku narażenia na działanie tlenu atmosferycznego. W związku z tym w RHO z pewnością występują większe ilości aldehydu octowego niż w winach RMO i RLO, które wydają się być chronione przed dostępem tlenu do

2.4. Wpływ na VRF, BSA-Tanniny i fenole całkowite

Chociaż wkrótce po obróbce kontaktorem membranowym poziomy całkowitych fenoli były podobne w traktowanych winach, po 11 miesiącach starzenia butelek liczba całkowita fenoli była wyższa w próbce przy wyższych stężeniach tlenu podczas butelkowania, jak pokazano w Tabeli 6. Może to wynikać prawdopodobnie z roli tlenu w tworzeniu związków fenolowych bardziej reaktywnych z żelazem oraz z zmienności struktury molekularnej monomerycznych i polimerycznych struktur fenolowych, jak już pokazano w winach podlegających różnym poborom tlenu podczas starzenia [6]. Potwierdza to trend obserwowany w Tabeli 6 dla BSA reaktywnych względem garbników i flawanów reagujących na wanilinę oraz w Tabeli 4 dla SPP, które wykazały statystyczną różnicę po 11 miesiącach starzenia.

w większym stopniu niż RHO2.

Stężenia tanin reagujących na białka BSA oznaczono metodą Habertsona w RHO, RMO i RLO. Podczas starzenia zaobserwowano wzrost poziomu tanin reagujących na BSA w RHO2, co jest zgodne z możliwą polimeryzacją struktur taninowych [27]. ]. Rzeczywiście, Harbertson [30] wykazał, że strącanie BSA wzrastało w zależności od rosnącego stopnia polimeryzacji (lub wielkości) od trimerów do oktamerów. W konsekwencji każda zmiana w składzie i wielkości tanin może wpłynąć na ich zdolność do reagowania z BSA. Utlenianie tanin powoduje powstawanie wiązań wewnątrzcząsteczkowych oraz międzycząsteczkowych pomiędzy flawonoidami. To ostatnie powoduje, że polimery wydłużają się i stają się bardziej reaktywne w stosunku do białek ślinowych [31]. Tego typu reakcje mogą bowiem modyfikować strukturę garbników, a tym samym wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe z białkami [32].

Ponieważ cierpkość jest spowodowana agregacją indukowaną garbnikami i wytrącaniem białek ślinowych [33], wzrost BSA-tanin w RHO2 sugeruje, że zmiany

garbnikom w wyniku tych reakcji w procesie starzenia się może przyczynić się do modyfikacji percepcji cierpkości.

Flavany reagujące z waniliną (VRF) mogą zamiast tego dostarczać dalszych informacji związanych z wielkością skondensowanych tanin. W rzeczywistości wanilina reaguje z pierścieniem A flawanoli w pozycji 6 lub 8, ale także aldehyd octowy reaguje z tymi samymi pozycjami pierścienia A flawanoli. Dlatego też zmniejszenie VRF można uznać za pośrednią miarę oksydacyjnej polimeryzacji flawanoli związanej z reakcjami wywołanymi przez aldehyd octowy z udziałem garbników i antocyjanów [34].

W naszym badaniu nieco niższe stężenie VRF zaobserwowano w próbce RMO2. Brak wyraźnego trendu w funkcji ilości tlenu może wynikać z faktu, że cząsteczki te mogą również ulegać hydrolitycznemu rozszczepieniu w obecności tlenu poprzez nowe przegrupowania molekularne z utworzeniem nowych wiązań wewnątrz- i międzycząsteczkowych [6].

3. Materiały i metody

3.1. Wina

Użyto dwóch komercyjnych win czerwonych Aglianico i białych Falanghina produkowanych w południowych Włoszech przez winnicę Cantina del Taburno. Szczegóły próbek wraz z niektórymi parametrami podstawowymi przedstawiono w tabeli 7. Podstawowe parametry zostały określone zgodnie z kompendium OIV międzynarodowych metod analizy wina i moszczu (2007).

3.2. Zarządzanie tlenem wina

Zastosowano system przemysłowy ISIOX (Tebaldi srl) wyposażony w kontaktor membranowy gaz-ciecz (Liqui-Cel9, przepływ poprzeczny, South Lakes Dr. Charlotte, NC, USA, odcięcie 50 g/mol) i pompę odśrodkową ze stali nierdzewnej używany. Membrana zapewnia stały i dobrze określony interfejs do przenoszenia masy gaz/ciecz bez rozpraszania jednej fazy w drugą. Konstrukcja kontaktora membranowego (hydrofobowe włókno kapilarne) jest wykonana z polipropylenu „PP” i oferuje bardzo dużą powierzchnię kontaktu „gaz/ciecz” wynoszącą 20 m²2.

Proces odtleniania składa się z ciągłych cykli, w których N, próżnia lub kombinacja dwóch pierwszych procesów (mieszanka) krążąca po jednej powierzchni membrany polipropylenowej jest stopniowo wzbogacana tlenem pochodzącym z wina krążącego po drugiej stronie membrany. Siłą napędową procesu jest różnica ciśnień parcjalnych tlenu na membranie. Podczas tego procesu wino stale krąży z zamkniętego zbiornika do aparatu odtleniającego.

Aby osiągnąć wymagany poziom tlenu, zawartość tlenu w winie była monitorowana we wszystkich procesach, aż do osiągnięcia docelowego poziomu.

Sterowanie procesem odbywało się poprzez monitorowanie O, poziomu w winach za pomocą komputera PC wyposażonego w bardzo prostą logikę programowania i specyficzne czujniki monitorujące temperaturę i zawartość tlenu (system luminescencyjny, Hach Lange, zakres pomiarowy {{{{2} }}} do 20 mg/LO, rozdzielczość: 0,01 mg/L O2, dokładność: 0-5mg/LO2±0,1). Do kontroli ciśnienia wlotowego i wylotowego zastosowano elektroniczne presostaty, a także ciśnienie gazu w procesie i poziom podciśnienia.

Do wina zastosowano różne zabiegi odtleniające w celu uzyskania różnych próbek o różnej zawartości tlenu. Ilość tlenu w białym winie była odpowiednio biała Wysoka O2, WHO2=2.7 mg/L, biała Średnia O2, WMO2=1 mg/L, biała Niska O2, WLO2= 0. 25 mg/L.

Ilość tlenu w czerwonym winie wynosiła odpowiednio: czerwone wysokie O, RHO,=1 mg/l, czerwone średnie O2, RMO2=00,5 mg/l, czerwone niskie O2, RLO2=0 0,2 mg/L. Oba zestawy win filtrowano z dokładnością do 1 μm przed wstrzyknięciem do maszyny w celu uniknięcia zjawiska zanieczyszczenia i zwilżania błony [35].

3.3. Próbki butelkowanie i starzenie

Po obróbce wina butelkowano, a wszystkie butelki zamknięto za pomocą współwytłaczanych syntetycznych zamknięć Nomacorc (Nomacorc SA, Thimister Clermont, Belgia)select green 100, które umożliwiają przechodzenie tlenu przez korek w kontrolowany (0,4 mg O2 po 3 miesiącach, 0,7 mg O, po 6 miesiącach, 1,2 mg O, po 12 miesiącach i 1,1 mg O, rok po pierwszym roku starzenia). Butelki starzono przez 11 miesięcy w 15 stopniach.

3.4. Metody analizy

3.4.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa oznaczanie aldehydu octowego

Analizy aldehydu octowego przeprowadzono przez derywatyzację próbki doświadczalnej wina i HPLC.

Analiza derywatyzacji była następująca: 100 μL próbki wina dodano do fiolki, po czym dodano 20 μl świeżo przygotowanego roztworu SOA o stężeniu 1,120 mg/L, 20 μl 25% kwasu siarkowego, odczynnik Carlo Erba 96% ） i 140 μl 2 g /L2,4-odczynnik dinitrofenylohydrazynowy. Po wymieszaniu roztwór pozostawiono do przereagowania przez 15 min w temperaturze 65 stopni, a następnie szybko ochłodzono do temperatury pokojowej [36].

Stosowanym HPLC był aparat Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Włochy, Mediolan, Włochy) wyposażony w sterownik systemu SCL-10AVP, dwie pompy LC-10ADVP do wytworzenia wymaganego gradientu rozpuszczalnika , detektor SPD-M 10 AVP i pełny system wstrzykiwania Rheodyne model 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). Rozdział przeprowadzono na kolumnie Waters Spherisorb (C18, podłoże cząstek krzemionki, ODS2 250x4,6 mm, średnica cząstek 5 µm, wielkość porów 80 A) wyposażonej w kolumnę ochronną. Optymalną wydajność rozdziału uzyskano stosując szybkość przepływu 0,75 ml/min, temperaturę kolumny 35 stopni; rozpuszczalnikami fazy ruchomej były:(A)0,5 procentowy kwas mrówkowy (Sigma Aldrich większy lub równy 95 procent) w wodzie mili-Q (Sigma Aldrich) i (B) acetonitryl (Sigma Aldrich większy lub równy 99,9 procenta) ; protokół elucji gradientowej był następujący: 35 procent B do 60 procent B(t=8min), 60 procent B do 90 procent B(t=13min), 90 procent B do 95 procent B(t{{29 }} min, 2-min wstrzymanie), 95 procent B do 35 procent B（t=17 min, 4-min wstrzymanie）, całkowity czas przebiegu, 21 min, nastrzyki próbek 50 μL i detekcję przeprowadzono przez monitorowanie sygnałów absorbancji przy 365 nm.

The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Dla każdego powtórzenia eksperymentalnego przeprowadzono trzy powtórzenia analityczne.

3.4.2. Analizy antocyjanów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Analizy natywnych antocyjanów przeprowadzono aparatem HPLC Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Włochy, Mediolan, Włochy) wyposażonym w sterownik systemu SCL-10AVP, dwie pompy LC-10ADVP do wytworzenia wymaganego gradientu rozpuszczalnika, detektor SPD-M 10 AVP oraz system iniekcji pełny model Rheodyne 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). Zgodnie z metodą opisaną w OIV Compendium of International Methods of Analysis of Wine and Musts [37].

Rozpuszczalniki HPLC były następujące: rozpuszczalnik A: woda mili-O (Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy)/kwas mrówkowy (Sigma-Aldrich większy lub równy 95 procent)/acetonitryl (SigmaAldrich większy lub równy 99,9 procent) (87:10:3)/v; rozpuszczalnik B: woda/kwas mrówkowy/acetonitryl (40:10:50)o/v. Gradient był następujący: warunki czasu zerowego 94 procent A i 6 procent B; po 15 minutach pompy zostały ustawione na 70 procent A i 30 procent B, po 30 minutach na 50 procent A i 50 procent B, po 35 minutach na 40 procent A i 60 procent B po 41 minutach, koniec analizy, aby 94 procent A i 6 procent B. 5 minutowy czas ponownego równoważenia zastosowano przed kolejną analizą, jak donosi [38]. Kolumną użytą do analiz była woda

Kolumna kulista C 18, podłoże cząstek krzemionki, ODS2 250 ×4,6 mm, średnica cząstek 5 μm, 80 Zastosowano wielkość porów） z przedkolumną. Na kolumnę wstrzyknięto 50 μl wzorców kalibracyjnych lub wina. Wykryto sygnały absorbancji przy 520 nm. Czułość detektora wynosiła 0,01 jednostki absorbancji w pełnej skali (AUFS). Wszystkie próbki przefiltrowano przez filtry membranowe 0,45 µm Durapore (Millipore-Ireland) do szklanych fiolek i natychmiast wstrzyknięto do systemu HPLC.

Krzywą kalibracyjną uzyskano przez wstrzyknięcie 5 roztworów (w trzech powtórzeniach) zawierających wzrastające stężenia malwidyny-3-monoglukozydu (Extrasynthese, Lyon, Francja). Kalibrację scharakteryzowano współczynnikiem korelacji (R')=00,996. Zakres liniowości krzywej kalibracyjnej wynosił 2-200 mg/L. Dokładność zastosowanej metody została przetestowana w sześciu powtórzonych analizach próbki czerwonego wina zawierającej 118,4 mg/l całkowitych monomerycznych antocyjanów. Współczynnik zmienności zawierał się między 1,1 procent (dla malwidyny 3-monoglukozydu) a 9,1 procent (dla malwidyny 3-(6II-kumaroilo)-glukozydu) i wykazał dobrą powtarzalność analizy HPLC. Stężenia monomerycznych antocyjanów wyrażono jako mg/l malwidyny-3-monoglukozydu.

Frakcjonowanie win RLO2, RMO2 i RHO2 przeprowadzono zgodnie z metodą analizy OIV przy użyciu tej samej HPLC Shimadzu LC10 ADVP, jak opisano powyżej. Dla każdego powtórzenia eksperymentalnego przeprowadzono trzy powtórzenia analityczne.

3.4.3. Spektrometria mas z jonizacją w wysokiej rozdzielczości z elektrorozpylaniem (HR ESIMS) Analizy czerwonych win

Rozdzielanie metodą HPLC win czerwonych przeprowadzone jak opisano powyżej dało trzy frakcje dla każdego wina. Pierwszą frakcję zebrano od 15 do 25 min (frakcja 1), drugą od 25 do 30 min (frakcja 2), a trzecią frakcję (frakcja 3) od 30 min do końca chromatografii biegać (45 min). Każdą zebraną frakcję wysuszono, rozpuszczono w metanolu i analizowano metodą HR-ESIMS w ciągłym nastrzyku w trybie jonów dodatnich. Eksperymenty HR ESIMS przeprowadzono na czwartorzędowym układzie Agilent 1260 Infinity IⅡ HPLC sprzężonym z liniową pułapką jonową LTQOrbitrap XL hybrydowym instrumentem z transformacją Fouriera MS (FTMS) wyposażonym w źródło ESI ION MAX (Thermo-Fisher). Zastosowano następujące ustawienia źródła (zakres mas m/z 100-2000): napięcie natryskiwania 4,5 kV, temperatura kapilary 300 stopni, napięcie kapilary 15 V, gaz osłonowy 20 i gaz pomocniczy 21 (jednostki arbitralne), napięcie soczewki tubusu 140 V i 25% energii zderzenia. Obliczenie wzorów pierwiastkowych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Xcalibur v 2.0.7 z ograniczeniem tolerancji masy 5 ppm.

3.4.4. Eksperymenty NMR

Ilość 2 ml każdej próbki wina (RHO2, RMO2 i RLO2) liofilizowano i rozpuszczono w 700 μl CDOD（6H 3,31;5c49.0ppm）. Eksperymenty NMR prowadzono na spektrometrze Varian Unity Inova 700 wyposażonym w 13C Enhanced HCN Cold Probe i przy użyciu rurek Shigemi 5 mm NMR. Zastosowano standardową sekwencję impulsów H-NMR Varian.

3.4.5. Standardowe analizy chemiczne i pomiary spektrofotometryczne

Zgodnie z „OIV Compendium of International Wine and Must Analysis of Wine and Musts Analysis 2007”[37], standardowa analiza chemiczna (stężenie alkoholu obliczona objętościowo, cukier redukujący, kwasowość całkowita, pH, kwasowość lotna, kwasowość jabłkowa i całkowita sucha masa ) było zmierzone.

Analizy spektrofotometryczne wykonano spektrofotometrem Jenway 7305. Charakterystykę chromatyczną, intensywność barwy i barwę określano metodami OIV [37]. Intensywność barwy określono jako sumę abs 420 nm, abs 520 nm i abs 620 nm, a odcień jako stosunek abs 420 nm/abs 520 nm.

Harbertson et al. test [22]. Krótkie pigmenty polimerowe (SPP) i duże pigmenty polimerowe (LPP) otrzymano przez połączenie analizy supernatantu otrzymanego po wytrąceniu białka przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej BSA

(Sigma-Aldrich) z wybielaniem pigmentów w winie wodorosiarczynem. Kompleks BSA-tanina w osadzie ponownie rozpuszczono, dodano chlorek żelazowy i odczytano przy 510 nm. Całkowite fenole oznaczono ilościowo odczytując przy 510 nm próbkę w następujący sposób: 50 µl wina dodano do 825 µl buforu C i odczytano na spektrofotometrze jako roztwór ślepy. Po dodaniu 125 µl chlorku żelazowego próbkę ponownie odczytano w celu określenia ilości reagujących z żelazem fenoli.

Flawany reagujące z waniliną (VRF) oznaczano zgodnie z Gambuti et al. [39]. W skrócie, 750 µl roztworu waniliny 4% w metanolu） dodano do 125 µl rozcieńczonego wina i po 5 minutach dodano 375 µl stężonego kwasu solnego. Po 15-min inkubacji mieszaniny w 20 stopniach, absorbancję określano przy 500 nm i odczytywano względem ślepego roztworu, w którym zamiast roztworu waniliny zastosowano czysty metanol. Stężenia obliczono jako (plus)-katechina (mg/l).

3.4.6. Analiza statystyczna

Dane ilościowe porównano stosując procedurę najmniejszych istotnych różnic Tukey'a, wszystkie wariancje były jednorodne. Gdy wariancje nie były jednorodne, dane analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Gdy wyniki testu Kruskala-Wallisa były istotne (p<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">

4. Wnioski

Wyniki uzyskane w tym badaniu potwierdziły, że różna zawartość tlenu w winie butelkowanym ma wpływ na starzenie się i utlenianie wina.

Zarządzanie tlenem w winie Aglianico za pomocą polipropylenowej membrany kapilarnej wykazało, po 11 miesiącach starzenia, niższą zawartość wolnego i całkowitego SO2 w próbce przy wyższym poziomie rozpuszczonego tlenu. To samo zachowanie zaobserwowano w winie Falanghina ze wzrostem zawartości aldehydu octowego w próbce o wyższym poziomie tlenu.

W odniesieniu do związków fenolowych, w winach czerwonych zaobserwowano większą utratę wszystkich antocyjanów natywnych. Ich zawartość była wyższa w winie o niższym stężeniu tlenu. Jednak utrata całkowitej ilości antocyjanów rodzimych nie wpłynęła na parametry barwy win, takie jak intensywność barwy i tonalność.

Taniny reaktywne względem BSA i wanilinowo reaktywne były niższe w próbkach zawierających średni i niski poziom tlenu w porównaniu z próbkami o wyższej zawartości tlenu. Wynika to z faktu, że tlen, uczestnicząc w reakcjach utleniania, współuczestniczy w tworzeniu pigmentów polimerowych. Zgodnie z oczekiwaniami, w winach czerwonych o najwyższej zawartości tlenu rozpuszczonego po obróbce kontaktorem membranowym, Vitisin B, dimery mostkowane etylidenem i aldehyd octowy były bardziej obfite w porównaniu do win poddanych obróbce tak, aby miały niższą zawartość tlenu w fazie przed butelkowaniem .

Podsumowując, odtlenianie wina przez wykonawców membran może być odpowiednią techniką dla przemysłu winiarskiego, aby zapobiec wszystkim tym zjawiskom oksydacyjnym, które mogą zmienić końcową jakość win czerwonych i białych, wpływając na zawartość dwutlenku siarki i aldehydu octowego (szczególnie w winach białych). . Niemniej jednak enolodzy muszą wziąć pod uwagę, że spadek zawartości tlenu może wpłynąć na stabilność koloru win czerwonych.

Materiały uzupełniające: Poniższe są dostępne online. Rysunek S1: Powiększenie widm H-NMR win RHO, RMO2 i RLO, zarejestrowanych na CD: OD. Rysunek S2: Struktura malwidyny 3-O-glukozydu i względne HR ESIMS w trybie jonów dodatnich. Rysunek S3: Struktura Vitisin B i względne HR ESIMS w trybie jonów dodatnich. Figura S4: Struktura dimeru z mostkiem etylidenowym składającego się z jednej jednostki 3-O-glukozydu malwidyny (na dole) i jednej jednostki (epi)katechiny (na górze) z względną HR ESIMS w trybie jonów dodatnich. Rysunek S5: Struktura dimeru z mostkiem etylidenowym składającego się z dwóch jednostek 3-O-glukozydu malwidyny, z których ta na dole jest w formie flavylium, a ta na górze w formie pseudo-podstawowej, wraz z względne HR ESIMS w trybie jonów dodatnich.

Bibliografia

1. Waterhouse, AL; Laurie, VF Utlenianie fenoli w winie: krytyczna ocena i hipotezy. Jestem. J. Enol. Wityka. 2006, 57, 306–313.

2. Danilewicz, JC Mechanizm samoutleniania polifenoli i udział siarczynu w winie: Kluczowa rola żelaza. Jestem. J. Enol. Wityka. 2011, 62, 319–328. [Odn.]

3. Nikolantonaki, M.; Waterhouse, AL Metoda ilościowego określania szybkości reakcji chinonu z nukleofilami odpowiednimi dla wina: klucz do zrozumienia utraty oksydacyjnej tioli odmianowych. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 2012, 60, 8484–8491. [Odsyłacz] [PubMed]

4. Eliasz, RJ; Andersena, ML; Skibsted, LH; Waterhouse, AL Identyfikacja wolnorodnikowych związków pośrednich w utlenionym winie przy użyciu pułapkowania spinu metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 2009, 57, 4359-4365. [Odsyłacz] [PubMed]

5. Oliveira CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AM Mechanizmy utleniania występujące w winach. Żywność Res. wewn. 2011, 44, 1115-1126. [Odn.]

6. Mouls, L.; Fulcrand, H. UPLC-ESI-MS badanie markerów utleniania uwalnianych z depolimeryzacji garbników: W kierunku lepszego scharakteryzowania ewolucji taniny w porównaniu z przetwarzaniem żywności i napojów. J. Widmo masowe. 2012, 47, 1450-1457. [Odsyłacz] [PubMed]

7. Waterhouse, AL Wino fenole. Anny. Akademia Nowego Jorku. Nauka. 2002, 957, 21-36. [Odn.]

8. Rosenfeld, E.; Schaeffer, J.; Beauvoir, B.; Łosoś, JM Izolacja i właściwości pro mitochondriów z komórek drożdży w fazie beztlenowej. Antonie Van Leeuwenhoek 2004, 85, 9–21. [Odn.]

9. Jarauta, I.; Cacho, J.; Ferreira, V. Współczesne zjawiska przyczyniające się do powstawania aromatu wina podczas starzenia w drewnie dębowym: badanie analityczne. J. Rolnictwo. Chemia Spożywcza 2005, 53, 4166-4177. [Odn.]

10. Singleton, VL; Trousdale, E.; Zaya, J. Utlenianie win. 1. Młode białe wina okresowo wystawione na działanie powietrza. Jestem. J. Enol. Wityka. 1979, 30, 49–54.