Całkowite glikozydy Cistanche Deserticola wspomagają regenerację funkcji neurologicznych poprzez indukcję regeneracji nerwowo-naczyniowej poprzez szlak Nrf- 2/Keap-1 u szczurów MCAO/R-Ⅰ
Apr 18, 2024
WSTĘP
Udary mózgu są uważane za główną przyczynę zgonów i niepełnosprawności na świecie. Prawie 87% wszystkich przypadków udaru mózgu jest spowodowanych udarem niedokrwiennym. Obecnie najskuteczniejszy środek i jedyny stosowany lek zatwierdzony przez FDAleczenie udaru niedokrwiennegojest rekombinowanym tkankowym aktywatorem plazminogenu. Jednakże duża liczba pacjentów po udarze nie reaguje na ten lek ze względu na wąskie okno czasowe leczenia i poważne ryzyko powikłań krwotocznych. Głównym wyzwaniem w leczeniu trombolitycznym jest uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R), które uważa się za główną przyczynę uszkodzenia mózgu i zniszczenia jego funkcji. Reperfuzja po niedokrwieniu mózgu zwiększa ryzyko krwotoku mózgowego, prowadząc jednocześnie do uszkodzenia naczyń nerwowo-naczyniowych i wytwarzania nadmiernej ilości reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają barierę krew-mózg. Kilka badań potwierdziło, że uszkodzenie BBB jest główną przyczyną patogenezy udaru niedokrwiennego.
NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO LECZENIA Udaru niedokrwiennego mózgu PHGS75% ECH 30% ACT 12%
BBB składa się głównie z komórek śródbłonka, perycytów, astrocytów, neuronów i błon podstawnych. Podstawowymi składnikami BBB są mózgowe komórki śródbłonka mikronaczyniowego, które są połączone ścisłymi połączeniami, ograniczając w ten sposób dopływ egzogennych cząsteczek do mózgu. Patologiczne zmiany w połączeniach ścisłych – szczególnie okludyna, klaudyna-5 i zonula occludens-1 (ZO-1) – znacząco wpływają na funkcję BBB podczas udaru niedokrwiennego, zwłaszcza na przepuszczalność bariery. W okresach I/R nadmierne ROS jest jednym z głównych czynników prowadzących do bezpośredniego uszkodzenia neuronów mózgowych. Nadprodukcja ROS prowadzi do degradacji niektórych połączeń i rozerwania BBB, co skutkuje przedostawaniem się egzogennych cząsteczek do mózgu przez BBB, co prowadzi do pogłębienia uszkodzenia mózgu. Dlatego też ochronę BBB za pomocą przeciwutleniaczy uznano za potencjalny sposób zapobiegania uszkodzeniom reperfuzyjnym.
Oprócz rozpadu BBB, I/R może skutkować uszkodzeniem naczyń nerwowo-naczyniowych i śmiercią neuronów. Podczas udaru zwiększona śmierć komórek nerwowych może wynikać ze stresu oksydacyjnego, a liczne badania wykazały, że RFT pogarszają ciężkość udaru i uszkodzenia neurologiczne. Chociaż badania kliniczne nie przyniosły zadowalających wyników, neuroprotekcja jest nadal obiecującą strategią leczenia ostrego udaru niedokrwiennego mózgu. Zatem znalezienie skutecznych leków neuroprotekcyjnych w leczeniu udarów jest korzyścią dla pacjentów po udarze.
Tradycyjna medycyna chińska (TCM) podejmuje działania mające na celu przeciwdziałanie zaburzeniu wewnętrznej równowagi organizmu. Ze względu na złożoną patogenezę udarów niedokrwiennych, wieloczynnikowe działanie TCM i jego aktywnych składników odgrywa kluczową rolę w leczeniu udarów.Cistanchedesericola YC Ma, szeroko rozpowszechniona na suchych lub półsuchych obszarach Mongolii i północno-zachodnich Chinach, jest od ponad 1,000 lat w Chinach szeroko stosowanym ziołem TCM w leczeniu różnych chorób, takich jak zapominanie i depresja. Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że surowe ekstrakty z C. desericola wykazywały różnorodne działanie farmakologiczne, takie jakpoprawiające funkcje uczenia się i pamięci, neuroprotekcję, odporność, działanie przeciwutleniające, przeciwstarzeniowe i przeciwzmęczeniowe. Analiza chemiczna C. Deserticola wykazała, że jej głównymi składnikami są m.inglikozydy fenyloetanoidowe, glikozydy irydoidowe, polisacharydy i oligosacharydy. Jednakże aktywne składniki C. desericola chroniące mózg nie są zbyt jasne.
Właściwości neuroprotekcyjne C. desericola implikują jego potencjał terapeutyczny w leczeniu chorób poznawczych, takich jak udar i depresja, a także choroba Alzheimera. Jednakże badania nad wpływem C. Deserticola na udary, w tym nad jej aktywnymi składnikami i mechanizmami działania, są bardzo ograniczone. W bieżącej pracy badaliśmy ochronne działanie trzech ekstraktów z C. desericola, glikozydów całkowitych (TG, glikozydów fenyloetanoidowych i innych glikozydów), polisacharydów (PS) i oligosacharydów (OS) na uszkodzenia I/R mózgu. Nasze odkrycia mogą przyczynić się do dokładnego zastosowania klinicznego C. desericola i zapewnić kandydata na agentaterapia udaru niedokrwiennego.
MATERIAŁY I METODY
Chemikalia i odczynniki
Łodygi Cistanche desericola zostały zakupione w Alashan w Mongolii Wewnętrznej i zidentyfikowane przez jednego z autorów (P.-F. Tu). TG, PS i OS przygotowano zgodnie z naszą wcześniej opisaną metodą. Analizę ilościową TG przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), jak opisano wcześniej, a jej chromatogram pokazano na Figurze 1. Głównymi składnikami TG są echinakozyd, tubulozyd A, akteozyd, izoakteozyd i 2'-acetyloakteozyd; ich zawartość wynosi odpowiednio 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g i 12,045 mg/g. Zawartość PS i OS wynosi odpowiednio 69,42% i 65,24%, co określono odpowiednio metodą HPLC i analizą kwasu fenolowo-siarkowego.
NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO LECZENIA Udaru niedokrwiennego mózgu PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Standardowe odniesienia dotyczące echinakozydu (A0282), tubulozydu A (A0942), akteozydu (A0280), izoakteozydu (A0281) i 2'-acetylakteozydu (A0943) zakupiono od Chengdu Must Biotechnology. Czystość wszystkich standardów wynosi ponad 98%. Zestawy H&E do bejcowania Nissla zakupiono w firmie Boster. Edaravone (T0407-1) zakupiono od Target Mol (Szanghaj, Chiny). Zakupiono królicze przeciwciało przeciwko szczurom MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) i mysie przeciwciało przeciwko szczurom CD31 (ab24590) od Abcam Inc. Króliczy środek przeciw szczurom Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) i Occludin (BS72035) zakupiono od Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) było źródłem króliczej antyszczurzej synapsyny-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-aktyny mięśni gładkich (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) zakupiono od Proteintech Group, Inc. Przeciwciała wtórne dostarczyła firma Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pekin, Chiny). Hoechst 33258 otrzymano z firmy Beyotime.
Zwierząt
Szczury Sprague-Dawley (samce, o masie 250–300 g) otrzymano z Vital River Laboratory Animal Technology i trzymano w klimatyzowanym pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE dotyczącymi badań na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt Centrum Nauki o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego.
Protokoły eksperymentów na zwierzętach
Szczury poddano MCAO/R, jak opisano wcześniej (Wang i in., 2018). W skrócie, odsłonięto lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA), po czym wprowadzono nylonowy szew monofilamentowy 3-0 od ECA do ICA aż do środka tętnica mózgowa (MCA). Po 1,5 godzinie okluzji MCA symulowano reperfuzję poprzez usunięcie włókna. Podczas zabiegu chirurgicznego temperaturę ciała wszystkich szczurów utrzymywano na poziomie 37,0°C. Lek
Administracja
Szczury podzielono losowo na sześć grup przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0 zgodnie z opisem: grupa normalna (NOR); grupa modeli (MOD); grupa edarawonu (lek pozytywny, 6 ml/kg, EDI); grupa TG (280 mg/kg, TG); Grupa PS (280 mg/kg, PS) i grupa OS (280 mg/kg, OS). TG, PS i OS podawano raz dziennie po MCAO/R przez 14 dni. Grupy NOR i MOD traktowano normalną solą fizjologiczną. Liczbę zwierząt przedstawiono w Tabeli 1.
Pomiar masy ciała i zmodyfikowana skala deficytu neurologicznego (mNSS)
Masę ciała monitorowano w 14. dniu przy użyciu cyfrowej skali ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, USA). Skalę mNSS oceniano według metody opisanej przez FJ Wanga (Wang i in., 2018), z niewielkimi zmianami.
Barwienie chlorkiem trifenylotetrazoliowym (TTC) 2, 3, 5-
Objętość zawału mierzono w sposób opisany wcześniej. W skrócie, mózgi podzielono na siedem równomiernie rozmieszczonych bloków koronowych (2 mm). Skrawki te barwiono 2% TTC w temperaturze 37 stopni przez 15 minut. Objętość zawału (%)=(objętość półkuli niedokrwiennej po tej samej stronie − objętość półkuli niedokrwiennej po przeciwnej stronie)/objętość półkuli niedokrwiennej po drugiej stronie × 100.
Barwienie Nissla i H&E
Szczury głęboko znieczulono, a następnie szybko usunięto cały mózg z czaszki, utrwalono go za pomocą 4% paraformaldehydu zatopionego w wosku parafinowym i pocięto na plasterki o grubości 7 µm. Skrawki barwiono Nissl i H&E. W tym badaniu w każdej próbce tkanki zarejestrowano sześć losowych pól o wymiarach 200 × 200 µm za pomocą mikroskopu świetlnego. Liczbę ciał Nissla policzono za pomocą oprogramowania IPP w wersji 6.0.
Niebieski test Evansa
Szczurom wstrzyknięto 2% EB po MCAO/R. Dwie godziny później szczury znieczulono, a następnie szybko usunięto cały mózg i homogenizowano w acetonie. Supernatanty analizowano przy 620 nm za pomocą czytnika absorbancji 800 TS.
Pomiar aktywności katalazy (CAT), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), dialdehydu malonowego (MDA) i peroksydazy glutationowej (GSH-Px)
Wszystkie próbki surowicy wirowano przy 4,000 × obr/min przez 15 minut w temperaturze 4 stopni, a następnie analizowano w celu wykrycia aktywności MDA, CAT, SOD i GSH-Px zgodnie z instrukcjami producenta.
Analiza Western Blot
Tkanki mózgowe (100 mg) pobrane od każdego szczura homogenizowano i poddano lizie w buforze do lizy RIPA, a następnie analizowano w celu wykrycia stężenia białka przy użyciu zestawu BCA. Całkowite białka tkankowe naniesiono na 10% żele SDS-PAGE i przeniesiono na membranę nitrocelulozową. Błonę blokowano za pomocą 5% odtłuszczonego mleka, następnie inkubowano przez noc z przeciwciałami pierwotnymi w temperaturze 4°C. Następnie membranę inkubowano z przeciwciałem wtórnym. Analizę Western blot przeprowadzono przy użyciu systemu Kodak Digital Imaging System.
Analiza immunofluorescencyjna
Przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne dla CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludyny, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 i Keap-1. Pierwotne przeciwciała przeciwko Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludynie, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 i Keap-1 rozcieńczono do 1 :200 i 1:100, odpowiednio. Obydwa przeciwciała drugorzędowe Alexa Flur 488 mysiej przeciw króliczej IgG i rodaminie (TRITC) koziej przeciw króliczej IgG rozcieńczono do 1:200. Jądra barwiono za pomocą Hoechst 33258. Obrazy wykonano przy użyciu automatycznego systemu obrazowania patologicznego Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, USA). Ekspresję białka analizowano przy użyciu oprogramowania IPP w wersji 6.0. Analiza statystyczna
Wszystkie dane opisano jako średnią ± SD. Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SPSS w wersji 22.0. Do porównania różnych grup zastosowano jednoczynnikową ANOVA. Za różnicę statystyczną uznano P < 0,05.
NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA NA CHOROBY PRZECIWNIEDOCHEMICZNE PHGS75% ECH 30% ACT 12%
WYNIKI
TG zwiększają masę ciała i zmniejszają uszkodzenia mózgu u szczurów MCAO/R
Po 14 dniach leczenia TG, PS, Oss i EDI oceniano masę ciała, deficyty neurologiczne i objętość zawału szczurów I/R. Wyniki pokazały, że masa ciała w grupie MOD znacznie się zmniejszyła, podczas gdy zmniejszona masa ciała w grupach TG, PS i EDI wzrosła (ryc. 2A). Wyniki deficytów neurologicznych zostały znacznie obniżone przez EDI i TG (ryc. 2B). Skrawki mózgu szczurów z grupy NOR były ciemnoczerwone i nie było zawałów, podczas gdy szczury z grupy MOD wykazywały duży ipsilateralny zawał mózgu. Po leczeniu TG objętość zawału uległa znacznemu zmniejszeniu (ryc. 2C, D). Leczenie PS i OS nie wykazało oczywistego wpływu na powyższe wskaźniki. Powyższe dane wykazały, że TG mogą znacząco złagodzić uszkodzenie mózgu wywołane I/R, ale PS i OS nie.
TG łagodzą uszkodzenia histopatologiczne u szczurów MCAO/R
Aby określić niektóre skutki leczenia TG, PS i OS na uszkodzenia histopatologiczne, wykonano barwienie H&E w celu ujawnienia uszkodzeń patologicznych. Struktury histomorfologiczne mózgów w grupie NOR były ułożone regularnie. Zmiany morfologiczne w grupach TG były mniejsze niż w grupie MOD. Jednakże grupy leczone PS i OS nie wykazały znaczącej poprawy zmian morfologicznych (ryc. 3).
TG łagodzą uszkodzenie neuronów u szczurów wywołanych I/R
Barwienie Nissla wykazało zmiany histopatologiczne neuronów w półcieniu obszaru niedokrwiennego. Jak pokazano na rycinie 4, normalne neurony miały wyraźne jąderko i nienaruszoną strukturę. W grupie MOD neurony miały powiększone przestrzenie międzykomórkowe. Ciała Nissla zniknęły, skurczyły się i głęboko poplamione. Jednakże zmiany te rzadko obserwowano w grupach EDI, TG i PS. Wyniki te pokazały, że TG i PS mogą znaczącołagodzić uszkodzenie neuronów wywołane niedokrwieniem/reperfuzją.
TG osłabiają przerwanie BBB po szczurach leczonych I/R
Klasyczną metodą badania zmiany przepuszczalności BBB jest metoda błękitu Evansa. Wyniki eksperymentu wykazały, że w grupie MOD zaobserwowano zwiększenie poziomu błękitu Evansa, podczas gdy u szczurów leczonych TG i EDI zaobserwowano znacząco obniżony poziom błękitu Evansa. Co więcej, nie było istotnej różnicy pomiędzy grupami terapeutycznymi PS i OS (ryc. 5). Wyniki te sugerują, że TG mogą znacząco złagodzić zakłócenia BBB.
TG promują angiogenezę u szczurów z urazami I/R
Nowsze badania pokazują, że angiogeneza odgrywa kluczową rolę w przywracaniu funkcji neurologicznych i wynikach prognostycznych po ostrym udarze niedokrwiennym (Yuen i in., 2015). Aby ocenić wpływ TG, PS i OS na angiogenezę, do ilościowego określenia liczby naczyń włosowatych zastosowano CD31 i a-SMA. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że grupa MOD spowodowała znaczny spadek ekspresji CD31 (ryc. 6A, B) i a-SMA (ryc. 6C, D) w półcieniu obszarów niedokrwiennych szczurów I/R w porównaniu ze szczurami normalnymi . Wynik ten pokazał, że I/R może powodować uszkodzenie naczyń w półcieniu korowym półkul niedokrwiennych. Jednakże leczenie TG i EDI znacząco zwiększyło gęstość naczyń włosowatych, angiogenezę i arteriogenezę, na co wskazuje zwiększona ekspresja CD31 i a-SMA. Wyniki te sugerują, że TG mogą promować angiogenezę w niedokrwiennym półcieniu szczurów I/R, ale PS i OS nie.
TG zwiększają ekspresję białek ścisłego połączenia u szczurów uszkodzonych I/R
Zakłócenie BBB może podnieść zawartość wody w mózgu i obrzęk tkanek, co prowadzi do uszkodzenia mózgu. Białka ścisłych połączeń są ważnymi składnikami strukturalnymi BBB. Aby sprawdzić, czy leczenie TG, PS i OS po udarze może wpływać na integralność BBB, przeprowadzono ekspresję ZO-1, klaudyny-5 i okludyny za pomocą analizy immunofluorescencyjnej. Wyniki wykazały, że ekspresja klaudyny-5, okludyny i ZO-1 była wyraźnie zmniejszona w grupie MOD. Jednakże znacznie wzrosły po 14 dniach podawania. Grupy PS i OS nie wykazały znaczących zmian w ekspresji tych białek (Figura 7). Dane te wskazują, że TG mogą regulować ekspresję białek ścisłych połączeń i prawdopodobnie utrzymują integralność BBB po uszkodzeniu I/R.
TG zwiększają pokrycie perycytów w naczyniach włosowatych u szczurów z urazami I/R
Pokrycie perycytami naczyń włosowatych odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności BBB. W związku z tym sprawdziliśmy, czy pokrycie perycytami można zwiększyć poprzez leczenie TG, PS i OS. Wyniki analizy intensywności immunofluorescencji wykazały, że ekspresja zarówno PDGFRb, jak i CD31 była dramatycznie zmniejszona w grupie MOD. Podawanie TG szczurom I/R znacząco przywróciło lub nawet zwiększyło intensywność ekspresji PDGFRb i CD31, ale nie zaobserwowano żadnej różnicy w grupach leczonych PS i OS (Figura 8). Zatem leczenie TG może znacząco zwiększyć zasięg perycytów. Odkrycia te dodatkowo potwierdziły, że TG mogą utrzymać integralność BBB po I/R.
NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA W ZAPOBIEGANIU Udarowi niedokrwiennemu mózgu PHGS75% ECH 30% ACT 12%
