13-Tygodniowe badanie toksyczności podprzewlekłej 2-(l-mentoksy)etanolu u szczurów F344

Wstęp

2-(1-mentoksy)etanol (nr CAS 38618-23-4) jest klarowną i bezbarwną cieczą o charakterystycznym zapachu, powszechnie stosowaną jako środek aromatyzujący. Wspólny Komitet Ekspertów FAO/WHO ds. Dodatków do Żywności (JECFA) ocenił 2-(l-metoksy)etanol jako środek aromatyzujący, zaliczany do substancji strukturalnie spokrewnionych z mentolem1. Na podstawie klasy strukturalnej środków aromatyzujących, 2-(l-metoksy)etanol przypisano do klasy I. W Stanach Zjednoczonych i Europie poziom spożycia 2-(l-metoksy)etanolu przez ludzi oszacowano na odpowiednio 12 ug/osobę/dzień i 0,01 ug/osobę/dzień, w obu przypadkach poniżej progu klasy I wynoszącego 1800 ug/osobę/dzień. Na podstawie tych szacunków uznaje się, że 2-(1-mentoksy)etanol nie może budzić obaw związanych z bezpieczeństwem podczas rutynowego stosowania jako środek aromatyzujący.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg masy ciała [mc.])1. Pomimo zastosowania 2-(1-mentoksy)etanolu jako środka aromatyzującego, dostępne są ograniczone dane dotyczące toksyczności dawki powtarzanej tego związku. Nasze laboratorium zbadało toksyczność kilku dodatków do żywności, w tym reprezentatywnych środków aromatyzujących z każdej kategorii, na modelach gryzoni2–7. Aby wyjaśnić profil toksykologiczny i ustalić poziom, przy którym nie obserwuje się szkodliwych skutków (NOAEL), przeprowadziliśmy 13-tygodniowe badanie toksyczności podprzewlekłej 2-(1-mentoksy)etanolu, który został podawano doustnie szczurom F344 przez zgłębnik.

Materiały i metody

Testowana substancja chemiczna

2-(1-mentoksy)etanol (partia nr 5I0002, czystość 99,9%) wyprodukowany przez Takasago Int. Corp. (Tokio, Japonia) zostało dostarczone przez Wydział Standardów i Oceny, Departament Bezpieczeństwa Żywności, Ministerstwo Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej, Japonia, przy wsparciu Japońskiego Stowarzyszenia Materiałów Smakowych i Zapachowych (Tokio, Japonia). Chociaż substancja badana była dostarczana w postaci mieszaniny izomerów optycznych (nr CAS 38618-23-4), producent potwierdził, że jest to l-enancjomer (nr CAS 75443-64-0). Jako nośnik wybrano zgłębnik doustny z olejem kukurydzianym (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia) ze względu na nierozpuszczalność w wodzie i lotność 2-(1-mentoksy)etanolu. Roztwory 2-(1-mentoksy)etanolu przygotowywano codziennie, bezpośrednio przed podaniem. Po przechowywaniu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej potwierdzono, że resztkowe proporcje 2-(1-mentoksy)etanolu w roztworze 4, 40 i 400 mg/ml potwierdzono jako 96,8%, 99,8% i 96,5% odpowiednio, metodą chromatografii gazowej (Japońskie Stowarzyszenie Inspekcji Środowiska Żywności i Przemysłu Spożywczego, Tokio, Japonia).

Zwierzęta doświadczalne

W sumie 40 samców i 40 samic szczurów wolnych od specyficznych patogenów (F344/DuCrlCrlj, 5 tygodni) zakupiono od Charles River Laboratories Japan (Jokohama, Japonia) i używano po aklimatyzacji przez jeden tydzień. Podczas badania zwierzęta trzymano w klatkach z poliwęglanu z miękką ściółką z wiórów, w pomieszczeniu wyposażonym w system barier kontrolujących cykl światło/ciemność (12 h), wentylację (szybkość wymiany powietrza 18 razy/h), temperaturę ( 24 ± 1 stopień) i wilgotność względna (55 ± 5%). Klatki i ściółkę z chipami wymieniano dwa razy w tygodniu. Każde zwierzę miało swobodny dostęp do wody z kranu i podstawowej diety (CRF-1; Oriental Yeast, Tokio, Japonia). Na początku eksperymentu zwierzęta przydzielono losowo do czterech grup po 10 samców i samic szczurów każda, na podstawie masy ciała zmierzonej bezpośrednio przed rozpoczęciem leczenia badaną substancją chemiczną.

Projekt badania

We wstępnym {{0}}-dniowym badaniu oceniającym 2-(1-mentoksy)etanol podawany w dawkach 0, 200, 400 i 800 mg/ kg m.c./ dziennie, bezwzględna i względna masa wątroby znacznie wzrosła we wszystkich leczonych grupach obu płci (dane nie pokazane). Na podstawie tych wyników wybraliśmy dawki 2-(1-mentoksy) etanolu wynoszące 0, 15, 60 i 250 mg/kg masy ciała/dzień do podawania zarówno samcom, jak i samicom szczurów obecnie {{ 13}}tygodniowe badanie toksyczności.

Codziennie oceniano stan ogólny i śmiertelność. Masę ciała oraz ilość dostarczonej i resztkowej diety mierzono raz w tygodniu w okresie doświadczenia. Po zakończeniu leczenia wszystkie szczury głodzono przez noc i pobrano próbki krwi do badań hematologicznych i biochemicznych surowicy z aorty brzusznej w znieczuleniu głębokim wziewnym przy użyciu izofluranu. Projekt badania był zgodny z Wytycznymi dotyczącymi oznaczania dodatków do żywności i rewizji standardów stosowania dodatków do żywności z Japonii (1996) i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu w Japonii.

Hematologia i biochemia surowicy

Za pomocą automatycznych analizatorów hematologicznych ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA) analizowano następujące parametry hematologiczne: liczbę białych krwinek (WBC), liczbę czerwonych krwinek (RBC), stężenie hemoglobiny (HGB), hematokryt (HCT), średnia objętość krwinki (MCV), średnia hemoglobina w krwince (MCH), średnie stężenie hemoglobiny w krwince (MCHC), liczba płytek krwi (PLT) i zróżnicowanie leukocytów, w tym neutrofili (Neut), limfocytów (Lymph), monocytów (Mono), eozynofili (Eozyno) i bazofile (Baso). Analizę biochemiczną surowicy przeprowadzono metodą Oriental Yeast pod kątem następujących parametrów: białko całkowite (TP), albumina (Alb), stosunek albumina/globulina (A/G), bilirubina całkowita (Bil), glukoza, cholesterol całkowity (T-Chol), trójglicerydy (TG), azot mocznikowy (BUN), kreatynina (Cre), wapń (Ca), fosfor nieorganiczny (IP), sód (Na), potas (K), chlor (Cl), aminotransferaza asparaginianowa (AST), aminotransferaza alaninowa (ALT), fosfataza alkaliczna (ALP) i transpeptydaza -glutamylowa (-GTP).

Masa narządów i ocena histopatologiczna

U wszystkich zwierząt przeprowadzono pełną sekcję zwłok i zważono mózg, grasicę, płuca, serce, śledzionę, wątrobę, nadnercza, nerki, jądra i jajniki. Narządy te, a także tkanki rdzenia kręgowego, nerwu trójdzielnego, przysadki mózgowej, jamy nosowej, gruczołów ślinowych, języka, przełyku, tchawicy, aorty, tarczycy, przytarczyc, trzustki, żołądka, jelita cienkiego i grubego, jelita podżuchwowego i krezkowego węzły chłonne, pochwę, macicę, pęcherz moczowy, gruczoł krokowy, pęcherzyki nasienne, najądrza, kość udową i mostek ze szpikiem kostnym, kręgi, mięśnie szkieletowe, nerw kulszowy, skórę i gruczoł sutkowy utrwalono w 10% obojętnie buforowanej formalinie; następnie przygotowano skrawki zatopione w parafinie i wybarwiono hematoksyliną i eozyną do badania histopatologicznego. Jądra i oczy z gruczołami Hardera utrwalono odpowiednio w utrwalaczu Bouina i roztworze Davidsona. Tkanki kostne, w tym jamę nosową, kręgi, mostek i kość udową, odwapniano za pomocą mieszaniny 10% kwasu mrówkowego i 10% buforowanej formaliny przez okres do 2 tygodni. Ocenę histopatologiczną przeprowadzono dla wszystkich tkanek uzyskanych od zwierząt z grupy kontrolnej oraz grupy, której podawano najwyższą dawkę, chyba że zaobserwowano zmiany chorobowe związane z leczeniem.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY ODPORNOŚCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Immunohistochemia dla 2u-globuliny

U samców szczurów akumulację 2u-globuliny w nerkach badano za pomocą analizy immunohistochemicznej skrawków zatopionych w parafinie. W celu odzyskania antygenu skrawki uzyskane od 5 szczurów w każdej grupie inkubowano z proteinazą K (DAKO, Glostrup, Dania) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wszystkie skrawki zanurzono w 3% roztworze H2O2/metanol na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu inaktywacji aktywności endogennej peroksydazy. Po zablokowaniu nieswoistych reakcji 10% normalną surowicą króliczą, skrawki inkubowano z przeciwciałem pierwotnym na 2uglobulinę (rozcieńczonym 1:400; przeciwciało przeciwko 2u-globulinie szczurzej; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) przez noc w temperaturze 4°C. Wizualizację wiązania przeciwciał przeprowadzono przy użyciu zestawu VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA) i 3,3′-diaminobenzydyny. Wszystkie skrawki wybarwiono kontrastowo hematoksyliną.

Analiza statystyczna

Rozbieżności w wartościach danych dotyczących masy ciała w okresie doświadczalnym, jak również hematologii, biochemii surowicy i masy narządów oceniano pod kątem jednorodności za pomocą testu Bartletta. Dla danych jednorodnych i heterogenicznych zastosowano odpowiednio jednoczynnikową analizę wariancji i test Kruskala-Wallisa. Do określenia statystycznie istotnych różnic zastosowano test porównań wielokrotnych Dunnetta w celu porównania grup kontrolnych i leczonych. Porównania częstości występowania i stopnia histopatologicznego analizowano, stosując odpowiednio dokładny test prawdopodobieństwa Fishera i test U Manna-Whitneya. Wartości P<0.05 were considered statistically significant.

Wyniki

Parametry życiowe, hematologia i biochemia surowicy

Przez cały okres doświadczenia nie zaobserwowano żadnych znaczących objawów klinicznych, a wszystkie zwierzęta przeżyły do ​​zaplanowanej sekcji zwłok. Ponadto nie zaobserwowano znaczących różnic w masie ciała i dziennym spożyciu pokarmu u samców i samic szczurów (ryc. 1A i B).

Dane hematologiczne i biochemiczne surowicy przedstawiono odpowiednio w tabelach 1 i 2. Analizy hematologiczne wykazały znacząco obniżone wartości HGB, HCT, MCV i MCH oraz zwiększoną PLT u samców szczurów, którym podawano 2-(1-mentoksy)etanol (Tabela 1) w dawce 250 mg/kg masy ciała/dzień. W biochemii surowicy zaobserwowano znaczny wzrost TP, T-Chol i Ca oraz spadek Bil i ALP u mężczyzn w grupie dawki 250 mg/kg (Tabela 2). Znaczący wzrost Cre i spadek A/G zaobserwowano u samców w grupach 60 i 250 mg/kg. U kobiet istotny wzrost Ca i spadek ALP odnotowano w grupach 60 i 250 mg/kg, natomiast podwyższony T-Chol i obniżony A/G, Bil, TG, AST i ALT wykryto w grupie 250 mg grupa /kg. Chociaż u samców otrzymujących dawkę 60 mg/kg zaobserwowano istotny wzrost TG i spadek Cl, brak jakiejkolwiek zależności pomiędzy dawką sugerował, że różnice te nie były związane z ekspozycją na substancję badaną.

Masy narządów

Dane dotyczące masy narządów podsumowano w Tabeli 3. Bezwzględna i względna masa wątroby była znacząco zwiększona u obu płci w grupie otrzymującej 250 mg/kg (Tabela 3). Znaczący wzrost względnej masy wątroby zaobserwowano u mężczyzn w grupie dawki 60 mg/kg. U mężczyzn bezwzględna i względna masa nerek była znacząco zwiększona w grupach otrzymujących 60 i 250 mg/ kg. W grupie mężczyzn otrzymujących dawkę 250 mg/kg odnotowano znaczny wzrost bezwzględnej i względnej masy nadnerczy oraz względnej masy śledziony i jąder.

Histopatologia i immunohistochemia

Dane dotyczące wyników badań histopatologicznych i immunohistochemicznych podsumowano odpowiednio w Tabelach 4 i 5. Wyniki badań histopatologicznych wykazały, że częstość gromadzenia się ziarnistości eozynofilowych (ryc. 2A–D), kanalików zasadochłonnych i wałeczków szklistych, a także ogniskowego śródmiąższowego zapalenia w nerkach była istotnie zwiększona w grupach składających się wyłącznie z mężczyzn w porównaniu z grupą kontrolną. grupy (Tabela 4). Na podstawie analiz immunohistochemicznych stwierdzono, że samce szczurów leczone badaną substancją wykazywały wzrost immunoreaktywności 2u-globuliny w komórkach nabłonkowych kanalików proksymalnych, wykazując wyraźną zależność od dawki (ryc. 2E–H) (tabela 5).

Podczas sekcji zwłok u jednego samca szczura w grupie otrzymującej 250 mg/kg stwierdzono poważne powiększenie prawej nerki z powodu histologicznie charakterystycznego nerczaka zarodkowego. Chociaż nerczak zarodkowy występuje rzadko u większości szczepów szczurów9, przypadek ten uznano za przypadkowy, ponieważ żadne inne zwierzęta nie wykazywały podobnych zmian. Ponadto w badaniach rakotwórczości jamy ustnej częstość występowania samoistnego nerczaka zarodkowego u samców szczurów F344/DuCrlCrlj wahała się między 0–2,0%10. Chociaż sporadycznie wykrywano kilka zmian w innych narządach, nie zaobserwowano żadnych znaczących, zależnych od leczenia zmian w częstości występowania tych zmian.

Dyskusja

Do tej pory JECFA oceniło 24 środki aromatyzujące, w tym 2-(1-mentoksy) etanol, jako substancje strukturalnie spokrewnione z mentolem i wszystkie zostały wymienione jako „nie budzące obaw co do bezpieczeństwa” przy obecnych szacunkowych poziomach spożycia1, 11. 2-(1-Mentoksy)etanol zalicza się do podgrupy alicyklicznych alkoholi lub eterów i uważa się, że jest głównie sprzężony z kwasem glukuronowym, a następnie wydalany z moczem1. Chociaż wartości LD50 tych substancji po podaniu doustnym u gryzoni są stosunkowo wysokie, dane z badań toksyczności po podaniu wielokrotnym pozostają ograniczone. 13-Tygodniowe badanie toksyczności po podaniu wielokrotnym wykazało, że karboksylan mentylu pirolidonu (nr CAS 68127-22-0), związek strukturalnie podobny do mentolu, może być powiązany ze zwiększoną względną masą wątroby i nerek u mężczyzn i kobiet szczury Wistar. Zaobserwowano także akumulację 2u-globuliny w kanalikach proksymalnych samców szczurów po dawce 1111 mg/kg masy ciała/dzień, a NOAEL określono na 109 mg/kg masy ciała/dzień1.

W obecnym 13-tygodniowym badaniu toksyczności podprzewlekłej 2-(1-mentoksy)etanolu nie zaobserwowano żadnych zmian toksykologicznych w stanie ogólnym, masie ciała i spożyciu pokarmu. Po ocenie hematologicznej zaobserwowaliśmy spadek HGB (96,6% w stosunku do średnich wartości kontrolnych), HCT (96,3%), MCV (98,4%) i MCH (98,2%) oraz wzrost PLT (111%) u mężczyzn 250 mg/kg, które uznano za toksykologiczne skutki leczenia 2-(1-mentoksy)etanolem. Zarówno bezwzględna (115% u obu płci), jak i względna (119% u mężczyzn i 111% u kobiet) masa wątroby znacznie wzrosła u obu płci w grupach otrzymujących 250 mg/kg. Chociaż nie stwierdzono zmian histopatologicznych w wątrobie, zwiększone poziomy T-Chol w surowicy (110% u mężczyzn i 121% u kobiet) i TP (105% u mężczyzn) oraz zmniejszenie TG (60,1% u kobiet) u 250 Grupy mg/kg wskazują na toksyczne zmiany związane z metabolizmem lipidów i syntezą białek w wątrobie. Wykryto także obniżone HGB i MCH oraz podwyższone PLT, T-Chol i TP u mężczyzn oraz obniżone TG i zwiększoną bezwzględną i względną masę wątroby u obu płci, co było istotne statystycznie we wstępnym badaniu 28--dniowym (dane nie pokazane ), potwierdzając, że te zmienione parametry hematologiczne i biochemiczne surowicy, a także masa wątroby nie były przypadkowe, lecz skutki związane z substancją badaną. Natomiast znacznemu wzrostowi względnej masy wątroby wykrytemu w niniejszym badaniu w grupie mężczyzn otrzymujących 60 mg/kg nie towarzyszył wzrost bezwzględnej masy wątroby ani zmiany powiązanych parametrów biochemicznych, co sugeruje, że wzrost ten był zmianą adaptacyjną.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Uznano, że znacząco zwiększona bezwzględna (120 %) i względna (118 %) masa nadnerczy w grupie mężczyzn otrzymujących dawkę 250 mg/kg była powiązana z badaną substancją chemiczną. Ponadto zwiększona bezwzględna i względna masa nadnerczy u obu płci wykazała wyraźną zależność od dawki w 28--dniowym badaniu wstępnym (danych nie pokazano), wskazując na związek z leczeniem badaną substancją chemiczną. Chociaż przerost nadnerczy może wynikać ze stresu, nie stwierdzono żadnych objawów sugerujących stres, takich jak zmniejszony przyrost masy ciała lub atrofia grasicy i innych narządów limfatycznych, zarówno w badaniach obecnych, jak i wstępnych. Ponieważ zmiany histopatologiczne w nadnerczach mogą nie wystąpić nawet przy upośledzeniu wytwarzania glukokortykoidów w przypadku hamowania enzymów związanych z steroidogenezą12, nie można wykluczyć, że zwiększona masa nadnerczy jest objawem toksycznym. Natomiast zwiększone względne masy śledziony i jąder w grupie samców otrzymujących 250 mg/kg, nieobserwowane we wstępnym badaniu, uznano za nieistotne toksykologicznie ze względu na brak zmian histopatologicznych lub znacznie zwiększone masy bezwzględne. Podobnie biochemia surowicy wykazała spadek A/G i wzrost Ca u obu płci, co uznano za nie mające znaczenia toksykologicznego, biorąc pod uwagę, że nie wykryto żadnych nieprawidłowości w powiązanych parametrach. Co więcej, obniżone poziomy Bil i ALP u obu płci oraz obniżone poziomy AST i ALT u kobiet kontrastowały z oczekiwanymi skutkami toksycznymi i uznano je za nieistotne.

U mężczyzn we wszystkich leczonych grupach obserwowano przewlekłą nefropatię charakteryzującą się kanalikami zasadochłonnymi, licem szklistym i ogniskowym zapaleniem śródmiąższowym, ze statystyczną istotnością. Ponadto wykryto zwiększone stężenie Cre w surowicy oraz bezwzględną i względną masę nerek w grupach mężczyzn otrzymujących 60 i 250 mg/kg; zmian tych nie obserwowano w grupach leczonych kobiet. W tych przypadkach stopień gromadzenia się ziarnistości eozynofilowych w komórkach nabłonka kanalików proksymalnych był zwiększony w sposób wyraźnie zależny od dawki. Za pomocą immunohistochemii potwierdzono, że granulki te są 2u-globuliną, co wskazuje na występowanie nefropatii 2u-globuliny. 2u-globuliny związane z niektórymi substancjami chemicznymi, takimi jak d-limonen, gromadzą się w lizosomach i są obserwowane w kanalikach proksymalnych w postaci granulek eozynofilowych lub szklistych9. Nagromadzenie to może uszkodzić komórki nabłonkowe, prowadząc do przewlekłej postępującej nefropatii, a w konsekwencji do powstania nowotworu9. Zatem chociaż nie określono wartości NOAEL dla 2-(1-mentoksy)etanolu powiązanego z nefropatią 2u-globuliny w nerkach samców szczurów, według doniesień ten typ nefropatii jest specyficzny dla samców szczurów i dlatego nie ma znaczenia dla ludzi ocena ryzyka13. Zwiększone ryzyko niewydolności nerek za pośrednictwem mechanizmów związanych z akumulacją 2u-globuliny jest wysoce nieprawdopodobne, ponieważ białko to nie występuje u ludzi14. Dlatego też uznano za rozsądne wyłączenie z określania NOAEL zmian związanych z przewlekłą nefropatią obserwowanych u mężczyzn.

Podsumowując, niniejsze 13-tygodniowe badanie toksyczności podprzewlekłej wykazało, że leczenie 2-(1-mentoksy) etanolem w dawce 250 mg/kg masy ciała/dzień powoduje toksyczne zmiany w hematologii, biochemii surowicy i masie narządów u samców i samic szczurów F344. Na podstawie zaobserwowanych wyników określono NOAEL dla 2-(1-mentoksy)etanoluoszacowano na 60 mg/kg masy ciała/dzień dla obu płci.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%